CXCL10、CXCR3在成年人結(jié)節(jié)性胃炎患者胃黏膜中的表達(dá)及意義*

張紅楊，年媛媛，孟憲梅，陳洪鎖，武 勇，彭 飛

(包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)蒙古消化病研究所，內(nèi)蒙古包頭 014030)

結(jié)節(jié)性胃炎(nodular gastritis,NG)是與幽門螺桿菌(helicobacterpylori，Hp)感染密切相關(guān)的一種特殊型胃炎，其特征是內(nèi)鏡下表現(xiàn)為彌漫性小結(jié)節(jié)或者顆粒樣改變，以大致均勻的方式分布，主要發(fā)生在胃竇部，少數(shù)也表現(xiàn)為胃體或全胃受累[1]；病理上主要表現(xiàn)為淋巴濾泡的形成以及淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)[2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子配體10(chemokine CXC motif ligand 10，CXCL10)及其受體趨化因子受體3(CXC chemokine receptor 3，CXCR3)是在眾多炎性疾病發(fā)病過(guò)程中起著重要作用的細(xì)胞因子。有研究表明CXCL10可能在Hp感染胃黏膜炎性病變中起著一定作用[3-4]，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。本研究檢測(cè)了趨化因子CXCL10及其受體CXCR3在結(jié)節(jié)性胃炎及Hp陰性及陽(yáng)性慢性非萎縮性胃炎患者胃黏膜中的表達(dá)水平，并對(duì)其臨床意義作一討論，以進(jìn)一步了解其在結(jié)節(jié)性胃炎中可能的作用，為后續(xù)研究結(jié)節(jié)性胃炎的發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)的理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選擇2020年4月—2021年11月就診于內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化病研究所胃鏡室的患者，根據(jù)內(nèi)鏡下表現(xiàn)入組結(jié)節(jié)性胃炎患者及慢性非萎縮性胃炎患者共64例，根據(jù)病理學(xué)檢查及Hp呼氣試驗(yàn)將入組患者分為結(jié)節(jié)性胃炎組(NG組)、Hp陽(yáng)性慢性非萎縮胃炎組、Hp陰性慢性非萎縮胃炎組，收集其胃黏膜標(biāo)本，年齡18～70歲，平均年齡為44.5歲。其中NG組33例，男性12例，女性21例，平均年齡為38.9歲；Hp陽(yáng)性慢性非萎縮性胃炎組14例，男性8例，女性6例，平均年齡為50.4歲；Hp陰性慢性非萎縮性胃炎組17例，男性9例，女性8例，平均年齡為50.5歲。免疫組化共46例，NG組 27例，Hp陽(yáng)性慢性非萎縮性胃炎組8例，Hp陰性慢性非萎縮性胃炎組11例；Western-blot共18例，NG組6例，Hp陽(yáng)性慢性非萎縮性胃炎組6例，Hp陰性慢性非萎縮性胃炎組6例。NG組與慢性非萎縮胃炎組相比，患者年齡差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各組患者性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～70歲；(2)性別不限；(3)均接受內(nèi)鏡檢查，通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并簽署內(nèi)鏡檢查及活檢知情同意書。NG組患者均經(jīng)胃鏡及病理檢查確診為結(jié)節(jié)性胃炎，另外選擇胃鏡及病理診斷為慢性非萎縮性胃炎患者作為對(duì)照組，根據(jù)Hp呼氣試驗(yàn)分為Hp陽(yáng)性慢性非萎縮性胃炎組與Hp陰性慢性非萎縮性胃炎組。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)已行抑酸、抗Hp治療；(2)患有消化道腫瘤、有消化道手術(shù)史、免疫性疾病、口服免疫抑制劑或激素；(3)孕婦、哺乳期婦女；(4)嚴(yán)重心、肺、腎、肝、腦及惡性腫瘤史；(5)有精神疾病、溝通障礙；(6)其他嚴(yán)重疾病及意識(shí)不清。

1.2方法

1.2.1胃鏡檢查及Hp診斷標(biāo)準(zhǔn) 電子胃鏡行常規(guī)胃鏡檢查，結(jié)節(jié)性胃炎患者于胃竇小彎側(cè)距幽門環(huán)5 cm內(nèi)結(jié)節(jié)性改變最明顯處取活檢組織3-4塊，慢性非萎縮性胃炎患者于胃竇小彎側(cè)距幽門環(huán)5 cm取活檢組織3-4塊，分別行組織石蠟包埋、蛋白質(zhì)提取。將Hp組織學(xué)染色陽(yáng)性加上快速尿素酶試驗(yàn)陽(yáng)性定義為Hp感染。

1.2.2免疫組化檢測(cè)CXCL10、CXCR3蛋白陽(yáng)性染色情況 將石蠟包埋組織連續(xù)切片后進(jìn)行脫蠟、水化，微波爐內(nèi)行抗原修復(fù)，3 %過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，磷酸鹽緩沖鹽水緩沖液(PBS)沖洗，滴加山羊血清封閉液，一抗后4 ℃過(guò)夜，二抗室溫孵育30 min，室溫滴加顯色劑，然后復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢觀察CXCL10、CXCR3在各組胃黏膜的著色情況。

免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：陽(yáng)性等級(jí)采用Sinicrope改良半定量法，顯微鏡下觀察記錄各切片中陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，按5級(jí)法計(jì)分。0分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5 %；1分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5 %～25 %；2分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26 %～50 %；3分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51 %～75 %；4分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>75 %。同時(shí)將染色強(qiáng)度分為4級(jí)，0分：不顯色或顯色不清；1分：淺黃色；2分：棕黃色；3分：深棕色。最后綜合計(jì)分=(染色細(xì)胞分?jǐn)?shù)+染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù))/2；陰性：所得分?jǐn)?shù)<0.5分；弱陽(yáng)性(+)：0.5分～1.5分；中度陽(yáng)性(++)：>1.5～2.5分；強(qiáng)陽(yáng)性(+++)：>2.5分。

1.2.3Western-blot檢測(cè)CXCL10、CXCR3蛋白表達(dá)量 提取各組織總蛋白；按照BCA試劑盒檢測(cè)組織蛋白濃度；制備濃縮膠和分離膠，按上樣體積上樣、電泳；進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、一抗和二抗孵育、化學(xué)發(fā)光；將凝膠圖像掃描拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1CXCL10、CXCR3蛋白陽(yáng)性染色結(jié)果 NG組、Hp陽(yáng)性慢性非萎縮性胃炎組、Hp陰性慢性非萎縮性胃炎組間CXCL10、CXCR3蛋白均有陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)部位集中在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，各組中弱陽(yáng)性表達(dá)較多，其中Hp陽(yáng)性非萎縮胃炎組胃黏膜內(nèi)CXCL10、CXCR3染色陽(yáng)性率分別為87.5 %(7/8)、75.0 %(6/8)，但各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組患者CXCL10和CXCR3蛋白陽(yáng)性染色免疫組化圖譜(×400)

CXCL10蛋白陽(yáng)性染色：A為Hp陽(yáng)性非萎縮胃炎組；B為NG組；C為Hp陰性非萎縮胃炎組。CXCR3蛋白陽(yáng)性染色：D為Hp陽(yáng)性非萎縮胃炎組；E為NG組；F為Hp陰性非萎縮胃炎組

2.2CXCL10、CXCR3蛋白表達(dá)量結(jié)果 CXCL10和CXCR3蛋白在三組間均有表達(dá)。進(jìn)一步兩兩比較示，與NG組和Hp陰性慢性非萎縮胃炎組相比，Hp陽(yáng)性慢性非萎縮胃炎組CXCL10、CXCR3蛋白表達(dá)更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NG組和Hp陰性慢性非萎縮胃炎組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

表1 各組胃黏膜組織中CXCL10、CXCR3蛋白陽(yáng)性染色結(jié)果比較[n(%)]

表2 各組胃黏膜組織中CXCL10和CXCR3蛋白表達(dá)

圖2 Western blot 法檢測(cè)各組胃黏膜組織CXCL10和CXCR3 蛋白表達(dá)(組1為NG組；組2為HP陽(yáng)性慢性非萎縮胃炎組；組3為HP陰性慢性非萎縮胃炎組)

3 討論

結(jié)節(jié)性胃炎，也稱為淋巴網(wǎng)狀增生、結(jié)節(jié)性增生、胃淋巴組織增生、濾泡性胃炎或淋巴細(xì)胞性胃炎，被認(rèn)為是胃黏膜的一種炎癥狀態(tài)，與Hp感染密切相關(guān)[5-7]。根據(jù)報(bào)道，在結(jié)節(jié)性胃炎患者中Hp陽(yáng)性率為87.5 %～100 %[1]。本研究中所有結(jié)節(jié)性胃炎患者均有Hp感染，進(jìn)一步說(shuō)明了結(jié)節(jié)性胃炎與Hp之間的相關(guān)性。結(jié)節(jié)性胃炎在普通人群中較為罕見(jiàn)，患病率在0.19 %～0.22 %，常見(jiàn)于兒童，但近年來(lái)隨著結(jié)節(jié)性胃炎的檢出率增高，研究報(bào)道成人結(jié)節(jié)性胃炎的病例數(shù)目亦呈上升趨勢(shì)[7-8]。日本在成年人群中進(jìn)行的研究表明，結(jié)節(jié)性胃炎患病率在0.93 %～2.9 %，年齡在40歲以下的患者和女性患病率呈增加趨勢(shì)[9]；另有國(guó)內(nèi)研究回顧性分析了30例成年結(jié)節(jié)性胃炎患者，其中女性患者占66.67 %，平均年齡為36.84歲，表明結(jié)節(jié)性胃炎患者中以女性居多，且年紀(jì)較輕[6]。本研究結(jié)果也顯示NG組患者平均年齡38.9歲顯著低于Hp陽(yáng)性慢性非萎縮胃炎組(50.4歲)與Hp陰性慢性非萎縮性胃炎組(50.5歲)，其中女性占63.64 %，這一點(diǎn)與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果一致。

趨化因子是一類能與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合可趨化免疫細(xì)胞至相應(yīng)部位參與炎癥、感染等多種病理生理過(guò)程的小分子分泌蛋白[9]。在趨化因子的分子中有4個(gè)保守的半胱氨酸(C)，根據(jù)其半胱氨酸精確構(gòu)型的變化可將人類趨化因子分為CXC、C-C、C及CX3C四類亞族[10]。而CXCL10又稱干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10，屬于CXC趨化因子超家族，受多種誘導(dǎo)干擾素-α/β和適應(yīng)性免疫細(xì)胞細(xì)胞因子干擾素-γ(IFN-γ)的天然刺激誘導(dǎo)。其受體為CXCR3，激活后可在幼稚T細(xì)胞上快速誘導(dǎo)，并優(yōu)先在1型輔助性(Th1)CD4+T細(xì)胞、效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞和天然型淋巴細(xì)胞上保持高表達(dá)[11]。當(dāng)CXCL10與其受體CXCR3結(jié)合后可趨化效應(yīng)T細(xì)胞的產(chǎn)生，隨后向Th1型炎癥周圍部位的遷移。研究表明，Hp感染的胃炎T淋巴細(xì)胞主要是Th1表型，且高分泌IFN-γ[12]，Hp可激活I(lǐng)FN-γ的上游信號(hào)通路，從而增強(qiáng)胃黏膜上皮細(xì)胞對(duì)IFN-γ刺激的促炎信號(hào)，導(dǎo)致其調(diào)節(jié)的趨化因子CXCL10產(chǎn)生增加，促進(jìn)炎癥細(xì)胞向感染部位聚集[13]。本研究針對(duì)NG組與非NG組患者胃黏膜的免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NG組、Hp陽(yáng)性慢性非萎縮性胃炎組、Hp陰性慢性非萎縮性胃炎組間CXCL10、CXCR3蛋白均有陽(yáng)性表達(dá)，其中在Hp陽(yáng)性非萎縮胃炎組表達(dá)最為顯著，CXCL10、CXCR3染色陽(yáng)性率分別為87.5 %、75.0 %，這一點(diǎn)與上述研究結(jié)果一致。此外，Eck 等[4]通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察到在Hp感染的慢性胃炎中，CXCL10在T細(xì)胞密集區(qū)域高表達(dá)，認(rèn)為CXCL10有助于T細(xì)胞向黏膜中的募集，并加重黏膜的損傷。綜合以上表明，Hp感染后可能通過(guò)多種方式協(xié)同作用促進(jìn)了趨化因子CXCL10的產(chǎn)生，且其表達(dá)量可能與疾病的嚴(yán)重程度之間呈正相關(guān)。

本研究進(jìn)一步通過(guò)Western-blot檢測(cè)了CXCL10、CXCR3蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Hp陽(yáng)性慢性非萎縮胃炎組CXCL10、CXCR3蛋白表達(dá)最為顯著。相反的是，本研究中NG組所有患者均有Hp感染，但NG組CXCL10、CXCR3蛋白表達(dá)顯著低于Hp陽(yáng)性慢性非萎縮胃炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示在結(jié)節(jié)性胃炎中，CXCL10、CXCR3的表達(dá)除Hp刺激的因素外，同時(shí)還受其他因素的調(diào)控。一項(xiàng)國(guó)外研究通過(guò)檢測(cè)結(jié)節(jié)性胃炎中促炎因子的表達(dá)，同樣發(fā)現(xiàn)與Hp感染但不伴有結(jié)節(jié)性胃炎的患者相比，Hp感染的結(jié)節(jié)性胃炎患者中的促炎細(xì)胞因子表達(dá)顯著降低，表明免疫識(shí)別能力降低或免疫逃避。另外，該研究還測(cè)定了NG中Hp的細(xì)菌載量，認(rèn)為細(xì)菌載量增高同樣是導(dǎo)致免疫抑制的一個(gè)因素[14]。此外，在本研究結(jié)果中NG組與Hp陰性慢性非萎縮胃炎組相比，NG組CXCL10、CXCR3蛋白表達(dá)量低于Hp陰性慢性非萎縮胃炎組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根據(jù)病理結(jié)果顯示，本研究中Hp陰性慢性非萎縮胃炎組患者炎癥程度多呈輕度到中度，而NG組患者多呈重度，因此，CXCL10、CXCR3在NG組表達(dá)更低可能也是免疫反應(yīng)被抑制的表現(xiàn)。綜合以上，我們推測(cè)，CXCL10與CXCR3在Hp感染的結(jié)節(jié)性胃炎患者胃黏膜中表達(dá)降低，可能反映體內(nèi)Th1細(xì)胞反應(yīng)活性降低，表明結(jié)節(jié)性胃炎狀態(tài)下，胃黏膜的免疫反應(yīng)受到了抑制。

在大量配體-受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，趨化因子與受體間的結(jié)合表現(xiàn)出冗余現(xiàn)象[15]，趨化因子及其受體間的相互作用以多渠道方式參與免疫反應(yīng)過(guò)程中T細(xì)胞運(yùn)輸?shù)木?xì)控制，特定的趨化因子可以識(shí)別其互補(bǔ)亞類的一個(gè)或多個(gè)受體，反之亦然[16]。因此，單一的趨化因子及其受體的結(jié)合產(chǎn)生的免疫反應(yīng)不足以完全解釋結(jié)節(jié)性胃炎的發(fā)生機(jī)制，CXCL10/CXCR3在結(jié)節(jié)性胃炎中的作用還需要更深入的研究，為后續(xù)研究結(jié)節(jié)性胃炎的發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)的理論依據(jù)。

綜上所述，成年人結(jié)節(jié)性胃炎與Hp感染密切相關(guān)，趨化因子CXCL10及其配體CXCR3在Hp感染患者胃黏膜中呈高表達(dá)，而在結(jié)節(jié)性胃炎中呈低表達(dá)可能代表了結(jié)節(jié)性胃炎狀態(tài)下胃黏膜免疫反應(yīng)的普遍抑制。