體外存儲過程中紅細(xì)胞衰亡的研究

楊麗麗，丁慧榮，李 姝，李旭妍，孫明玥，蘇 燕

(1.鄂爾多斯市蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯 017000；2.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院中心實驗室；3.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室)

體外存儲紅細(xì)胞(Red blood cells, RBC)是臨床輸血的主要來源，隨血液存儲時間延長，RBC會發(fā)生一系列形態(tài)、功能、生物化學(xué)等方面的變化，即RBC存儲損傷[1]。RBC存儲損傷會引起RBC能量缺乏、氧化應(yīng)激增強及細(xì)胞外K+濃度升高等[2]，而體外存儲是否會觸發(fā)RBC啟動衰亡程序尚不明確。本研究擬通過檢測不同存儲時間點RBC表面的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)含量、RBC平均體積(mean corpuscular volume，MCV)以及細(xì)胞外離子、葡萄糖(glucose，Glu)、乳酸(lactic acid，Lac)、總膽紅素(total bilirubin，TBil)濃度及高鐵血紅蛋白分?jǐn)?shù)(fraction of methemoglobin，F(xiàn)MetHb)的改變，明確體外存儲RBC的衰亡及其與紅細(xì)胞平均體積、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)代謝和離子轉(zhuǎn)運間的相關(guān)性，為血液保護及臨床輸血研究提供理論和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1血液的來源與制備 本研究經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，招募乙肝病毒、丙肝病毒、人類免疫缺陷病毒陰性且無疾病家族遺傳史的20～40歲健康男性志愿者6名。囑3 d內(nèi)清淡飲食、適量運動，于3 d后分別采集全血400 mL于山東威高的四聯(lián)采血袋內(nèi)，經(jīng)白細(xì)胞濾器(四聯(lián)袋自帶)分離白細(xì)胞后，4 200 g離心17 min，分離血漿和RBC，RBC保存于100 mL MAP紅細(xì)胞保護液中，4 ℃保存。

1.2試劑與儀器 APC Annexin V、FITC Mouse Anti-Human CD235a、10×Annexin V Binding Buffer均購自美國BD公司。一次性使用去白細(xì)胞塑料血袋(山東威高集團醫(yī)用高分子制品股份有限公司)；離心機(德國Eppendorf公司)；血氣分析儀(丹麥雷度公司)；全自動血流變儀(中國普利生公司)；流式細(xì)胞分析儀(美國BD公司)；全血細(xì)胞分析儀(日本Sysmex800i)。

1.3檢測方法 將儲存期0、7、14、21、28和35 d紅細(xì)胞血袋輕輕搖勻，從血袋小辮端無菌抽取RBC懸液6 mL進行以下檢測。

1.3.1Annexin V Bingding RBC檢測 取1 μL RBC與100 μL 1×Annexin V Binding Buffer、5 μL APC Annexin V和0.5 μL FITC Mouse充分混合，避光15 min后，加300 μL 1×Annexin V Binding Buffer，立即上機檢測。

1.3.2MCV檢測 取1 mL RBC利用全血細(xì)胞分析儀進行檢測。

1.3.3細(xì)胞外離子、Glu、Lac和TBil濃度及FMetHb檢測 取5 mL RBC，利用血氣分析儀及配套試劑進行檢測。

2 結(jié)果

2.1存儲時間對結(jié)合Annexin V 的RBC比例的影響 研究結(jié)果表明，隨著存儲時間的延長，與Annexin V結(jié)合的RBC減少(r=-0.8356，圖1)。

圖1 不同存儲時間對體外存儲期間結(jié)合Annexin V的RBC比例的影響

2.2存儲時間對RBC MCV及細(xì)胞外Cl-、Na+、Ca2+濃度的影響 隨著存儲時間的延長，MCV、細(xì)胞外Cl-濃度沒有明顯變化；細(xì)胞外Na+不斷減少(r=-0.9274)；細(xì)胞外Ca2+由于濃度低于儀器的檢測限，一直未檢測到(表1)。

表1 存儲時間對MCV、細(xì)胞外Cl-、Na+、Ca2+影響

2.3存儲時間對RBC外Glu、Lac、TBil濃度及FMetHb的影響 隨著存儲時間的延長，細(xì)胞外Glu濃度不斷降低(r=-0.9860，圖2-C)，而Lac(r=0.9377，圖2-A)、TBil(r=0.8035，圖2-B)濃度及FMetHb(r=0.9706，圖2-D)不斷增加。

圖2 存儲時間對RBC外Glu、Lac、TBil濃度及FMetHb的影響

2.4存儲期間各指標(biāo)與結(jié)合Annexin V的RBC比例的相關(guān)性 貯存期間K+、Lac、TBil濃度及FMetHb與結(jié)合Annexin V的RBC比例均呈高度負(fù)相關(guān)關(guān)系(r值分別為：-0.9569,-0.9790,-0.9060,-0.8302 圖3-A，C-E)，而Glu濃度與結(jié)合Annexin V的RBC比例呈高度正相關(guān)關(guān)系(r=0.9328，圖3B)。

圖3 部分指標(biāo)與結(jié)合 Annexin V的 RBC比例間的線性關(guān)系

3 討論

本研究結(jié)果顯示，長期低溫存儲RBC表面PS的含量降低，與之前部分研究結(jié)果并不一致。Liu、Lu、Verhoeven 等[4-6]采用SAGM及CPDA-1等保護液，結(jié)果顯示，隨著存儲時間的延長PS的含量增加，但其檢測前采用了加入Ca2+溫浴等方式。RBC衰亡是機體為了避免溶血引發(fā)的炎癥反應(yīng)而進行的自殺性程序性死亡[7]。此過程不破壞細(xì)胞膜的完整性，也不會將細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放到組織液[8-9]，其主要特征為磷脂酰絲氨酸外翻[10-12]。RBC衰亡的主要特征是細(xì)胞體積減小、細(xì)胞表面囊泡形成及膜彈性的改變[13]。衰亡的RBC被巨噬細(xì)胞識別、吞噬和降解，并從循環(huán)中清除[8]。RBC衰亡的主要機制是Ca2+可滲透的非選擇性陽離子通道的激活引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加[13-14]，氧化應(yīng)激、高滲及能量不足等均可通過該機制引發(fā)RBC衰亡[15]。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加會引發(fā)由于Ca2+敏感性K+通道的激活而引起的RBC內(nèi)水分和KCl外流，最終導(dǎo)致RBC皺縮[7,12,16]。細(xì)胞膜的囊泡化是由細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加激活鈣蛋白酶引起細(xì)胞骨架降解而形成[17]。本研究結(jié)果顯示，MCV的體積在存儲后期增大，但差異無顯著性，可能與樣本例數(shù)較少有關(guān)。此外，細(xì)胞外Cl-濃度也沒有明顯的變化。存儲過程中RBC利用細(xì)胞外Glu通過糖酵解和磷酸戊糖途徑進行供能和維持細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，然而低溫存儲使糖酵解生成ATP的效率并不高，生成的ATP不足可能導(dǎo)致ATP依賴性Na+-K+-ATP泵失活，進而使存儲RBC外K+濃度增加、Na+濃度降低[15]。隨著存儲時間延長，葡萄糖酵解產(chǎn)生的Lac不斷累積，因此，細(xì)胞內(nèi)Lac濃度不斷增高。然而存儲RBC與體內(nèi)RBC的衰亡機制并不完全相同[18-20]，長期存儲RBC的衰亡是能量消耗、氧化應(yīng)激等與Ca2+內(nèi)流共同作用的結(jié)果[20]。由于成熟RBC缺乏細(xì)胞內(nèi)鈣存儲系統(tǒng)，因此，其細(xì)胞內(nèi)濃度的升高主要源于Ca2+的內(nèi)流。本研究中MAP紅細(xì)胞保護液的主要成分為枸櫞酸、枸櫞酸鈉和葡萄糖，其中枸櫞酸鈉的主要作用是與血漿中Ca2+結(jié)合防止血液凝固，所以血漿中Ca2+幾乎全部與保護液中的枸櫞酸鈉結(jié)合，在血液成分分離的過程中隨著血漿的去除而不再存在于RBC存儲液中。紅細(xì)胞存儲上清中Ca2+濃度的檢測結(jié)果也提示，由于Ca2+濃度過低而無法檢測。相關(guān)分析顯示，紅細(xì)胞膜PS外翻與K+、Lac、TBil、FMetHb含量變化呈高度負(fù)相關(guān)，表明存儲RBC表面PS外翻主要通過Ca2+內(nèi)流介導(dǎo)，其他代謝和氧化應(yīng)激產(chǎn)物并不能促進PS外翻。本研究結(jié)果提示，紅細(xì)胞保存液中Ca2+缺失可以防止紅細(xì)胞衰亡，紅細(xì)胞衰亡的檢測并不能直接反映紅細(xì)胞存儲損傷。但存儲損傷的累積是否會加速輸注后紅細(xì)胞的衰亡尚需要進一步研究。