豬瘟病毒E2基因主要抗原區(qū)表達(dá)及Dot-ELISA建立研究

蘇紅遼 宗玉國

（1河南省滑縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南安陽 456400；2山東省臨朐縣綜合行政執(zhí)法局，山東濰坊 262600）

豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染豬引起的一種急性或慢性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。該病臨床癥狀以發(fā)病豬死亡、懷孕母豬繁殖障礙為主要特征，臨床危害嚴(yán)重，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,WOAH) 列為必須報(bào)告疫病[2]，我國將其列為二類動(dòng)物疫病。歐洲部分發(fā)達(dá)國家已宣布成功消滅豬瘟，但包括我國在內(nèi)的多數(shù)養(yǎng)豬國家和地區(qū)仍存在此病[3,4]，甚至部分已宣布消滅豬瘟的國家仍不時(shí)發(fā)生[5]，嚴(yán)重影響全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[6]。以C株為代表的豬瘟弱毒疫苗在消滅、凈化豬瘟過程中發(fā)揮了重要作用，但因?qū)嶋H免疫中存在盲目接種、接種后缺乏免疫效果監(jiān)測甚至因免疫抑制等原因?qū)е旅庖呤7]。因此，對生豬養(yǎng)殖場戶、基層動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)而言，找到一種適宜于現(xiàn)地使用的CSFV抗體快速檢測方法，有助于第一時(shí)間掌握豬群的豬瘟抗體水平，便于采取針對性防控措施。

依據(jù)我國發(fā)布的豬瘟診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 16551-2020)，豬瘟抗體檢測方法主要有病毒中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫熒光試驗(yàn)等，但這些方法的使用場景主要以獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室為主，且對人員、技術(shù)、設(shè)施、儀器等的要求相對較高，并不適宜養(yǎng)殖圈舍的現(xiàn)場使用。為此，本研究在分析了CSFVE2基因的主要抗原區(qū)域后，進(jìn)行了E2基因的克隆、表達(dá)、純化，經(jīng)SDS-PAGE、Western blotting分析，表達(dá)的重組蛋白E2能夠與CSFV陽性血清特異性結(jié)合，基于純化的重組E2蛋白作為檢測抗原，初步建立能檢測豬瘟抗體的斑點(diǎn)酶聯(lián)吸附試驗(yàn)(Dot-ELISA)，該方法保留了常規(guī)ELISA的優(yōu)點(diǎn)，克服了繁瑣的操作程序，檢測結(jié)果能直接肉眼觀察，易于基層推廣應(yīng)用[8]，將結(jié)果報(bào)道如下。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌(毒)株和質(zhì)粒

豬瘟病毒、原核表達(dá)載體pET-28a(+)以及表達(dá)宿主菌Rosetta均由河南省滑縣動(dòng)物疫病控制中心保存。

1.1.2 主要試劑

TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0、Taq DNA聚合酶、EcoR I、Xho I和DNA膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶均購自Takara；HRP標(biāo)記羊抗豬IgG、BCA蛋白定量試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Immobilon ECL發(fā)光液購自Millipore公司；豬瘟陽性血清由河南省滑縣動(dòng)物疫病控制中心采集、鑒定并保存。

1.1.3 引物

根據(jù)Genebank中收錄的CSFV Qixian株E2基因序列(KY816738)，利用primer5.0設(shè)計(jì)1對擴(kuò)增E2主要抗原區(qū)dE2的引物，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為762 bp。引物序列：上游引物5’-GAGGAATTCAACCCATCA ACTGAGGAAATG-3’，下游引物5’-TATCTCGAGTT C TGCGAAGTAATCTGAGTGG-3’ (下劃線分別為EcoR I和 Xho I位點(diǎn))。

1.2 E2基因的RT-PCR擴(kuò)增

1.2.1 cDNA合成

cDNA合成按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0說明書進(jìn)行。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

PCR體系及反應(yīng)參數(shù)分別如下，10×Taq DNA聚合酶緩沖液 5 μL、反轉(zhuǎn)錄 cDNA 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 pmol/L上、下游引物各1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，滅菌超純水補(bǔ)至50 μL；反應(yīng)參數(shù)是 95℃ 5 min；94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 46 s，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸6 min。

1.3 pET28a-dE2的構(gòu)建

將E2基因PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳、切膠回收純化，再用EcoR I和Xho I雙酶切后回收，與經(jīng)EcoR I和Xho I酶切并回收的產(chǎn)物與pET-28a(+)連接，連接如下：E2 基因 4 μL，pET-28a(+)1 μL，5×T4 DNA連接酶緩沖液2 μL，T4 DNA連接酶1 μL，滅菌超純水補(bǔ)至 10 μL，16℃過夜。轉(zhuǎn)化 Rosetta，涂布于含 100 μg/mL卡那霉素(Kan) 的LBA平板上，37℃培養(yǎng)14～16 h，挑單菌落，培養(yǎng)后，分別進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pET28a-dE2，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，并進(jìn)行NCBI BLAST分析。

1.4 pET28a-dE2的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取pET28a-E2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Rosetta，接種于含100 μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)至A600為0.5～0.6，加入0.1 mol/L IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，37℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)6 h，備用。

1.5 E2基因的SDS-PAGE和Western blotting分析

1.5.1 SDS-PAGE分析

誘導(dǎo)培養(yǎng)物于4℃下3 000 r/min離心10 min，收集菌體，PBS洗滌，用1/10菌液體積的PBS重懸菌體，冰浴超聲裂解菌體，4℃12 000 r/min離心10 min，收集上清，12%SDS-PAGE，染色，脫色，檢測表達(dá)蛋白。同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)的pET28a-E2’為對照。

1.5.2 Western blotting分析

通過Western blotting分析E2基因的蛋白表達(dá)，方法參考文獻(xiàn)[9]，同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)的pET28a-E2’為對照。

1.6 Dot-ELISA方法的初步建立

純化的dE2包被NC膜，建立檢測E2抗體的Dot-ELISA方法如下：剪取硝酸纖維素膜，30 ng/μL的E2抗體，取1 μL涂于NC膜，37℃溫箱干燥，10%脫脂奶粉37℃封閉1 h，PBST洗滌，CSFV抗體陽性血清(1∶200稀釋)4℃孵育過夜，PBST洗滌，1∶3 000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG 37℃孵育30 min，PBST洗滌5次，置于AEC顯色液中，至出現(xiàn)斑點(diǎn)后，終止顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 E2基因主要抗原區(qū)的擴(kuò)增

TR-PCR擴(kuò)增獲得了長度約為760 bp的E2基因片段(圖1)，與預(yù)期片段長度一致。

圖1 E2基因RT-PCR擴(kuò)增

2.2 pET28a-dE2的鑒定

pET28a-dE2的PCR鑒定獲得了約760 bp的片段(圖2-A)，pET28a-dE2的EcoR I和Xho I雙酶切鑒定獲得了約530和760 bp的DNA片段(圖2-B)，與預(yù)期一致，表明E2基因擴(kuò)增片段入pET-28a(+)載體。NCBIBLAST分析表明，擴(kuò)增基因與我國CSFV分離株的E2基因?qū)?yīng)序列的同源性≥98.84%以上(見圖3)。

圖2 pET28a-dE2的PCR(A)及雙酶切 （B）鑒定

圖3 E2基因主要抗原區(qū)序列Blast比對結(jié)果

2.3 E2重組蛋白的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析結(jié)果(圖4-A)顯示，pET28adE2經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了約32.4 KDa的重組蛋白，而未誘導(dǎo)pET28a-dE2’轉(zhuǎn)化菌則未見相應(yīng)條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，表明E2基因主要抗原區(qū)已獲得成功表達(dá)。

2.4 dE2重組蛋白的Western blotting分析

Western blotting結(jié)果(圖4-B)表明，pET28a-E2誘導(dǎo)菌在約32.4 KDa處有特異性條帶，而未誘導(dǎo)pET28a-E2’轉(zhuǎn)化菌則未見相應(yīng)條帶，表明誘導(dǎo)菌中表達(dá)的E2蛋白能夠與CSFV感染陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。

2.5 Dot-ELISA方法的初步建立

由Dot-ELISA顯色結(jié)果(圖4)可知，純化dE2與CSFV抗體陽性血清反應(yīng)，有可見斑點(diǎn)，而等量未誘導(dǎo)的菌體蛋白則不與CSFV抗體陽性血清反應(yīng)，無可見斑點(diǎn)，表明重組蛋白作為包被抗原建立的Dot-ELISA，可檢測豬血清中的CSFV抗體。

圖4 E2重組蛋白的SDS-PAGE （A）和Western blotting （B） 分析

圖4 重組蛋白的Dot-ELISA

3 討論與結(jié)論

豬瘟是由豬瘟病毒引起豬的一種高度傳染性疾病，呈急性或慢性經(jīng)過，分布范圍廣，世界各地都有發(fā)生，能導(dǎo)致發(fā)病豬的死亡及母豬的繁殖障礙。當(dāng)前，通過豬瘟疫苗接種和嚴(yán)格的生物安全措施，豬瘟的流行得到了有效控制。但我國在豬瘟免疫時(shí)間方面，由于缺乏及時(shí)、準(zhǔn)確的免疫監(jiān)測，導(dǎo)致免疫時(shí)機(jī)的選擇具有很大的盲目性，常造成免疫失敗[10,11]。相較于需要專業(yè)技術(shù)人員、專用設(shè)備的商品化CSFV抗體檢測試劑盒，建立簡便、易行、可現(xiàn)場使用的豬瘟抗體檢測方法，及時(shí)對豬瘟抗體進(jìn)行監(jiān)測，給免疫時(shí)機(jī)選擇提供參考，并且及時(shí)檢測免疫效果，才是廣大養(yǎng)殖場戶和基層動(dòng)物防疫機(jī)構(gòu)開展豬瘟免疫并確保免疫效果的重要保障[5]。

鑒于Dot-ELISA的豬瘟抗體檢測方法操作簡便、易行，并且不需要特殊儀器設(shè)備讀取檢測結(jié)果，便于在基層推廣應(yīng)用[12]。E2是豬瘟病毒重要保護(hù)性抗原[13]，本研究首先分析了E2主要抗原區(qū)，RT-PCR擴(kuò)增了E2的主要抗原區(qū)(dE2)，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET28a-dE2，并利用SDS-PAGE和Western blotting成功表達(dá)了豬瘟病毒的重組蛋白抗原和特異性結(jié)合豬瘟抗體，然后利用表達(dá)的重組蛋白建立了檢測豬瘟抗體的Dot-ELISA，為豬群豬瘟抗體檢測提供了有效工具，通過豬瘟抗體檢測，不僅可為豬瘟免疫時(shí)機(jī)選擇提供參考，而且可以及時(shí)了解豬瘟免疫接種效果。此外，NCBI BLAST分析，發(fā)現(xiàn)本研究擴(kuò)增的豬瘟病毒E2的主要抗原區(qū)與多個(gè)毒株E2基因?qū)?yīng)序列的同源性≥99.8%，多數(shù)可達(dá)100%。表明本研究建立的Dot-ELISA，在檢測豬群豬瘟抗體時(shí)具有較好的代表性和通用性，可為豬瘟病毒抗體檢測提供有效工具。