宮腔粘連動物模型的建立

石雯 周抒

宮腔粘連（IUA）是由于各種宮腔內(nèi)操作導致子宮內(nèi)膜基底層損傷、宮內(nèi)感染以及機體內(nèi)源性雌激素水平低下等引起子宮頸和（或）子宮腔內(nèi)膜纖維化，宮腔容受性減小，出現(xiàn)部分或完全閉塞粘連。IUA 臨床表現(xiàn)為月經(jīng)量減少、閉經(jīng)、周期性下腹痛、復發(fā)性流產(chǎn)及不孕等，是危害女性生殖及生理健康的一大疾病。IUA 具體的病因機制尚不清楚。大鼠具有與人類相似的月經(jīng)周期及子宮生理解剖結構，且大鼠的雙子宮結構提供了天然的實驗對照，是建立IUA 模型進行相關病因機制研究的良好實驗平臺。本研究通過模擬人類子宮內(nèi)膜機械損傷后IUA 狀態(tài)，選取性成熟、未交配雌性SD 大鼠制作子宮內(nèi)膜不同程度機械損傷動物模型，在損傷后的不同時間段進行取材切片后進行免疫組織化學（免疫組化）染色，觀察大鼠宮腔不同時期不同機械損傷程度下的內(nèi)膜情況，進一步探討引起IUA 與子宮內(nèi)膜病理性再生的相關病因機制并提供穩(wěn)定、合適的動物實驗模型。

材料與方法

一、材 料

1. 實驗動物

健康、性成熟、未交配雌性SD 大鼠30 只，鼠齡9～11 周，體質(zhì)量200～250 g，購于大連醫(yī)科大學無特定病原體動物實驗中心。所有大鼠遵循周期一致性原則，溫度20～26 ℃，濕度50%～60%，光照晝夜比例統(tǒng)一，自由采食、飲水。實驗動物的使用和處理過程均符合動物實驗相關倫理規(guī)范。

2. 藥物與主要試劑

包括：生理鹽水，一抗為小鼠抗大鼠主要組織相容性復合體Ⅱ類分子（MHC Ⅱ）抗體（稀釋比1∶100）購自英國Abcam 公司，大鼠抗 5-溴脫氧尿苷（BrdU，稀釋比1 ∶10）購自美國Bio-Rad 公司；二抗山羊抗小鼠 Ig 堿性磷酸酶（ALP，稀釋比1∶100）購自英國Abcam 公司，山羊抗大鼠 Ig ALP（稀釋比1∶100）購自英國Jackson 公司；免疫組化染色試劑藍色堿性磷酸鹽底物購自美國Vector公司，新品紅基質(zhì)試劑盒購自日本N-Histofine公司；水合氯醛粉劑購自天津市大茂化學試劑廠。

二、方 法

1. 實驗動物的分組及處理

按照配對比較法隨機分組，將30 只雌性SD大鼠分成實驗組與對照組，每組各15 只。其中，實驗組大鼠左側子宮行子宮內(nèi)膜輕度機械損傷并設定為輕度機械損傷組，右側子宮行子宮內(nèi)膜重度機械損傷并設定為重度機械損傷組。對照組大鼠開腹后不進行子宮內(nèi)膜損傷處理，進行假手術對照。

2. 大鼠陰道涂片方法

用毛細玻璃管吸取約50 μL 生理鹽水，輕輕置入大鼠陰道內(nèi)約1 cm 處，反復輕柔抽吸3～5 次后，將陰道內(nèi)抽吸液取出，立即均勻涂于潔凈載玻片并編號標記，待干3 min，顯微鏡下觀察陰道涂片各細胞的分布情況。統(tǒng)一選取大鼠動情期（涂片在光學顯微鏡下幾乎全部為聚堆的無核角化上皮細胞，呈落葉狀，而白細胞和有核細胞極少）進行實驗，以避免不同實驗對象間子宮內(nèi)膜所處月經(jīng)周期不同和雌孕激素水平差異而導致結果出現(xiàn)誤差。

3. 建模方法

所有實驗對象于術前禁食、禁飲12 h，動物電推剪取下腹正中部剃毛（面積約3 cm×4 cm），腹腔注射麻醉，嚴格遵循無菌操作原則，碘伏棉球腹壁消毒3 次，以無菌紗布鋪巾（圖1A）。取實驗對象腹部正中線、距離尿道口約3～4 cm 處用大號直剪作縱行切口1.5 cm，鈍銳結合分離腹直肌層及腹膜，進入腹腔（圖1B）；用2 根無菌棉簽輕探腹腔，完整暴露膀胱后方“V”形子宮（圖1C）；無齒尖頭直鑷提起單側子宮，盡量避開子宮旁血管網(wǎng)，于子宮1/2 總長度處使用眼科剪橫向剪開子宮至橫切面直徑3/4 處（圖1D），采用自制2 mm直徑不銹鋼刮匙探入手術側子宮切口上、下側宮腔，反復進行宮腔搔刮操作。實驗組采用自身對照將大鼠左側子宮內(nèi)膜輕度搔刮作為輕度機械損傷組（圖1E、F），反復搔刮左側宮腔至刮出宮腔內(nèi)組織1～2 刮匙、宮腔內(nèi)少量積血、左側子宮外觀輕度充血、半透明、宮腔壁輕度塌陷，彈性欠佳；右側子宮內(nèi)膜重度搔刮作為重度機械損傷組（圖1G、H），以不刮破子宮壁為標準反復搔刮右側宮腔、刮出宮腔內(nèi)容物3～4 刮匙、宮腔內(nèi)大量新鮮積血，右側子宮外觀極度充血、近透明狀、宮腔壁塌陷，彈性極差，無菌紗布清理切口處少量鮮血，7-0 帶針縫合線間斷縫合子宮切口3 針，查子宮切口無明顯出血，使用無菌棉簽輕輕還納術側子宮；處置完畢后清點手術器械與術前一致，逐層關腹（圖1I、J）；對照組同法進行開腹，暴露相同手術時長后關腹，不進行宮腔搔刮操作。術后將實驗對象安全轉(zhuǎn)至術后專用鼠籠，溫水瓶保暖，等待麻醉復蘇；蘇醒后觀察30 min、轉(zhuǎn)至新的普通鼠籠；清洗手術器械、消毒備用，清掃操作臺面，及時記錄手術過程。

圖1 SD 大鼠輕、重度機械損傷術程圖

4. 動物處理及取材

實驗組和對照組分別在術后0 h、24 h、72 h、5 d、7 d 進行取材。取材前1 h 進行10% BrdU 1 mL活體大鼠尾靜脈注射，實驗組、對照組各取材3只。其中各組術后0 h 取材的實驗對象需在進行宮腔機械損傷前1 h 進行BrdU 注射后再進行手術，術后立即取材包埋，BrdU 注射成功后1 h 及時將各實驗對象左、右側子宮組織等完整取出，分別進行同側組織快速冰凍包埋后凍存于?80 ℃冰箱備用。4 μm 厚度標準下冰凍切片機快速切片，并于?80 ℃冰箱密封保存。

5. 免疫組化染色

取冰凍組織切片，風干、固定、標記染色范圍。第一重免疫組化選用MHC Ⅱ 60 μL 為一抗，抗鼠 Ig ALP 60 μL 為二抗，Vector Blue 堿性磷酸鹽顯色劑60 μL 顯色，倒置相差顯微鏡下觀察染色情況。第二重免疫組化選用抗鼠BrdU 60 μL 為一抗，抗鼠Ig ALP 60 μL 為二抗，New Fuchsin 顯色劑顯色，倒置相差顯微鏡下觀察染色情況。之后再次以甲醛鈣固定玻片、封片，風干后室溫保存，倒置相差顯微鏡下觀察各切片組織形態(tài)改變及染色情況。

6. 大鼠子宮內(nèi)膜腺體檢測

術后7 d 在倒置相差顯微鏡下觀察大鼠的子宮內(nèi)膜形態(tài)學變化以及腺體數(shù)量，子宮內(nèi)膜腺體的計數(shù)：每份組織隨機選取3 張切片，置于鏡下進行整個視野的子宮內(nèi)膜腺體計數(shù)，每份組織取3 個視野進行計數(shù)，取平均值為該組織腺體個數(shù)。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、動情期大鼠陰道細胞涂片的情況

大鼠的動情周期約4～5 d。大鼠動情期陰道涂片在光學顯微鏡下幾乎全部為聚堆的無核角化上皮細胞，呈落葉狀，白細胞和有核細胞極少，見圖2。

圖2 SD 大鼠動情期陰道細胞涂片在光學顯微鏡下的表現(xiàn)（×100）

二、大鼠輕、重度機械損傷后各個時期子宮形態(tài)與正常子宮解剖形態(tài)的比較

所有大鼠術后一般狀況良好，精神可，飲食佳，大小便正常，體質(zhì)量無明顯改變，術后均存活。正常大鼠子宮外觀顏色粉紅，血運豐富，無充血，管腔粗細均勻，管壁膨隆、彈性好，剖視子宮內(nèi)膜層結構完整，無異常出血及破損（圖1C）；輕度機械損傷0 h 后大鼠子宮外觀輕度充血水腫，宮腔半透明、輕度塌陷狀態(tài)，彈性欠佳（圖1F）；重度機械損傷0 h 后大鼠子宮外觀極度充血水腫，宮腔呈透明狀、宮腔壁塌陷，彈性極差，剖視內(nèi)膜層幾乎完全破損、即將穿透子宮壁，管腔積血多（圖1H）。機械損傷24 h 后大鼠雙側子宮水腫明顯（圖3A）；機械損傷72 h 后大鼠雙側子宮水腫，可見管腔內(nèi)淤血（圖3B）；機械損傷5 d 后大鼠雙側子宮水腫淤血狀態(tài)減輕，管壁彈性較前改善（圖3C）；機械損傷7 d 后大鼠雙側子宮與周圍組織粘連明顯，無明顯水腫淤血（圖3D）。

圖3 輕度機械損傷組（左側子宮）和重度機械損傷組（右側子宮）術后各時期大體形態(tài)圖

三、輕、重度機械損傷組子宮內(nèi)膜各時期的鏡下形態(tài)學表現(xiàn)、MHC Ⅱ細胞及BrdU 標記細胞免疫組化染色結果

1. 輕、重度機械損傷組子宮內(nèi)膜各時期鏡下形態(tài)學表現(xiàn)

術后0 h， 輕度機械損傷組的子宮內(nèi)膜組織破損、較正常內(nèi)膜變薄1/4～1/3，部分間質(zhì)細胞及腺體缺失，剩余內(nèi)膜結構清晰、層次分明，剩余腺體排列規(guī)則，子宮管腔出現(xiàn)空隙（可能由積血或積液所致），無明顯水腫及纖維組織形成（圖4A）； 重度機械損傷組的子宮內(nèi)膜組織破損嚴重、內(nèi)膜層幾乎全部破壞，極少量間質(zhì)細胞及腺體殘留，子宮管腔出現(xiàn)大空隙（可能由積血或積液所致），無明顯水腫及纖維組織形成（圖4F）。術后24 h，輕度機械損傷組的管腔見大量黏液及壞死組織，管腔輕度水腫，內(nèi)膜較前變薄（圖4B）；重度機械損傷組見大量黏液壞死組織充滿管腔，管腔水腫明顯，部分宮腔未見明顯內(nèi)膜組織，腺體少見（圖4G）。術后72 h，輕度機械損傷組的子宮內(nèi)膜逐漸增生修復，內(nèi)膜間質(zhì)及腺體數(shù)目增加，子宮內(nèi)膜表面上皮被覆完整，管腔內(nèi)空隙變小（圖4C）；重度機械損傷組的管腔空隙較前變小，其內(nèi)可見壞死組織，未見明顯腺體（圖4H）。術后5 d，輕度機械損傷組的管腔間隙進一步變小，腺體數(shù)目較前明顯增多（圖4D）；重度機械損傷組的管腔間隙進一步變小，未見明顯腺體增多（圖4I）。術后7 d，輕度機械損傷組的管腔基本閉合，無明顯水腫，出現(xiàn)內(nèi)膜線（圖4E）； 重度機械損傷組無明顯水腫，管腔進一步縮小，未見腺體或腺體數(shù)目極少，內(nèi)膜組織纖維化，內(nèi)膜層大部分組織被纖維組織替代且向?qū)m腔凸起，甚至占據(jù)整個宮腔，局部管腔閉合并出現(xiàn)粘連（圖4J）。

2. 輕、重度機械損傷組MHC Ⅱ細胞及BrdU標記細胞免疫組化染色結果

輕度機械損傷組中，術后24 h 開始出現(xiàn)藍染的MHC Ⅱ細胞（圖4B）；術后72 h 內(nèi)膜層出現(xiàn)大量紅染含BrdU 的細胞，并見大量藍染的MHC Ⅱ細胞（圖4C）；術后5 d 見較多紅染含BrdU 的細胞，子宮內(nèi)膜見藍染的MHC Ⅱ細胞數(shù)目較前稍減少（圖4D）；術后7 d 仍可見少量紅染含BrdU 的細胞，子宮內(nèi)膜基本修復，見少量藍染的MHC Ⅱ細胞（圖4E）。重度機械損傷中，術后24 h 開始出現(xiàn)藍染的MHC Ⅱ細胞（圖4G）；術后72 h 內(nèi)膜層未見明顯紅染含BrdU 的細胞，見少量藍染的MHC Ⅱ細胞（圖4H）；術后5 d 未見明顯紅染含BrdU 的細胞，見藍染的MHC Ⅱ細胞、數(shù)目較前減少（圖4I）；術后7 d未見明顯紅染含BrdU的細胞，見藍染的MHC Ⅱ細胞、數(shù)目較前進一步減少（圖4J）。

圖4 SD 大鼠輕、重度機械損傷術后子宮內(nèi)膜各時期形態(tài)表現(xiàn)（免疫組化染色，×100）

四、術后7 d 輕、重度機械損傷組和對照組的子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目比較

術后7 d，輕度機械損傷組、重度機械損傷組和對照組的子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目分別為（9.37±1.31）個、（12.96±1.22）個和（2.93±0.83）個，3組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目比較差異有統(tǒng)計學意義（F =538.69，P < 0.001），且隨著子宮內(nèi)膜受損程度增加，腺體數(shù)目隨之減少（組間兩兩比較P 均<0.001）。

討 論

IUA 的發(fā)病機制尚不明確，Polishuk 等（1975年）提出的纖維細胞增生活躍學說為當前主流學說。IUA 的發(fā)病機制可能與纖維細胞的異常增生活躍主要相關。研究提示，IUA 分離術后子宮內(nèi)膜中微血管密度的增加、血管內(nèi)皮生長因子表達的上調(diào)、新生微血管的形成可能對子宮內(nèi)膜修復有利。用于建立IUA 模型的實驗物種包括小鼠、大鼠、新西蘭兔以及犬等。其中大鼠具有成本低、適應性強、生殖周期短、遺傳背景清晰及個體差異性小等特點，其獨特的雙子宮解剖結構可為IUA模型的建立提供天然的自身對照條件。IUA 動物模型的建立方式包括機械損傷法、物理損傷法、化學損傷法、感染損傷法、熱損傷法以及多重損傷聯(lián)合法等。

本研究采用子宮內(nèi)膜機械損傷法，最接近臨床妊娠后行人工流產(chǎn)清宮術操作下的子宮內(nèi)膜損傷方式。與通過Masson 染色、HE 染色等方式進行IUA 模型建立不同，本研究對大鼠子宮內(nèi)膜組織染色方法進行了改進，通過雙重免疫組化染色將大鼠子宮內(nèi)膜中包含MHC Ⅱ的細胞染成藍色，將含有BrdU 的大鼠子宮內(nèi)膜細胞染成紅色，進而觀察術后不同時間點子宮內(nèi)膜細胞的炎性反應以及細胞增殖情況，深入反映術后早期IUA 發(fā)生發(fā)展的過程。

MHC Ⅱ?qū)τ行д{(diào)節(jié)炎癥反應的強效應答有重要意義。本研究通過對MHC Ⅱ細胞染色，發(fā)現(xiàn)子宮受損后內(nèi)膜及肌層組織中MHC Ⅱ反應增強，在機械損傷后0 h 至術后3 d 炎癥反應較大，之后逐步減輕。BrdU 是一種胸腺嘧啶核苷酸類似物，通過與胸腺嘧啶核苷酸競爭，從而替代胸腺嘧啶核苷酸摻入到S 期新合成的DNA 片段中，研究者可通過計數(shù)不同機械損傷程度下標記有BrdU 的細胞，了解子宮內(nèi)膜增生修復情況。本研究顯示，輕度機械損傷組術后72 h，大鼠子宮內(nèi)膜處出現(xiàn)紅染含BrdU 的細胞，提示大鼠內(nèi)膜細胞開始增生修復；而重度機械損傷組大鼠子宮內(nèi)膜未見紅染含BrdU 細胞，提示子宮內(nèi)膜細胞無增生修復，考慮重度機械性損傷破壞了大鼠子宮內(nèi)膜基底層及腺體，導致子宮內(nèi)膜再生障礙，從而影響子宮內(nèi)膜的修復。

另外，本研究通過使用自制2 mm 刮匙對大鼠子宮內(nèi)膜進行輕、重度機械性搔刮后所造成的內(nèi)膜損傷程度甚至IUA 的整個大體及組織病理學過程的對比研究，發(fā)現(xiàn)大鼠子宮內(nèi)膜在輕度機械損傷后0 h 出現(xiàn)1/4～1/3 淺表層組織破壞，部分腺體缺損，術后24 h 出現(xiàn)明顯組織水腫，術后72 h 出現(xiàn)組織增生修復及大量炎性細胞，術后5 d 組織繼續(xù)修復增生，術后7 d 基本達到完全修復再生；而大鼠子宮內(nèi)膜在重度機械損傷后，術后0 h 子宮內(nèi)膜損傷破壞程度達到內(nèi)膜全層、累及整個基底層和腺體，甚至造成肌層等的損傷，術后24 h 宮腔內(nèi)殘留的部分內(nèi)膜組織水腫明顯，腺體殘留少甚至部分宮腔不見腺體，術后72 h 及術后5 d，子宮腔內(nèi)間隙逐漸縮小，但內(nèi)膜組織鏡下觀察仍無明顯修復增生表現(xiàn)，術后7 d 內(nèi)膜組織無法達到基本修復，子宮腔內(nèi)間隙進一步縮小，腺體數(shù)目少、排列分布不規(guī)則，出現(xiàn)組織纖維化，內(nèi)膜層大部分被纖維組織替代且向?qū)m腔凸起，甚至占據(jù)整個宮腔，局部管腔閉合、出現(xiàn)粘連。

綜上所述，本研究通過觀察動情期大鼠子宮內(nèi)膜在不同程度機械損傷后不同時期的再生修復過程，發(fā)現(xiàn)重度機械損傷后大鼠子宮腔出現(xiàn)粘連改變，提示切開縫合子宮內(nèi)膜機械損傷法可以成功建立大鼠IUA 模型。這為后續(xù)進行IUA 相關機制的研究提供了良好的動物模型，也提示在保護子宮內(nèi)膜方面盡量避免重度機械損傷的重要性。