Elabela 通過α7nAChR/JAK2/STAT3 信號通路改善心肌缺血/ 再灌注損傷的機制研究

杜勝利 張大鵬 賈增芹

AMI 后心肌缺血/再灌注（MI/R）損傷可誘導(dǎo)更多的氧自由基產(chǎn)生，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，甚至死亡。因此，抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡將有助于MI/R 損傷的治療。目前尚無有效的藥物或操作方法治療MI/R。Wang（2015 年）等認(rèn)為，小分子肽Elabela 及其配體APJ 信號通路與心血管病理生理密切相關(guān)，其主要在心臟血管的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。Elabela對心臟胚胎發(fā)生至關(guān)重要。Chng（2013年）、Pauli（2014 年），Peverelli（2014 年）等 相繼發(fā)現(xiàn)，缺乏Elabela 的魚類會出現(xiàn)嚴(yán)重的心臟發(fā)育不良，甚至缺如。同時他們也發(fā)現(xiàn)，Elabela 可以通過引導(dǎo)血管細(xì)胞遷移到中線，改變細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，以及激活磷酸化Smad3 等途徑來促進(jìn)血管生成。Elabela/APJ 還可引起冠狀動脈擴張，增強心肌收縮力，改善左心室肥厚和心肌間質(zhì)纖維化以及抗高血壓作用。但是，到目前為止，Elabela 對MI/R 的影響尚不清楚。人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過從迷走神經(jīng)末端釋放乙酰膽堿并激活炎癥細(xì)胞中的α7 煙堿型乙酰膽堿受體（α7nAChR）來阻斷促炎分子的產(chǎn)生。Pavlov 等（2003 年）認(rèn)為α7nAChR 是一種配體門控離子通道，其主要作用是轉(zhuǎn)運神經(jīng)系統(tǒng)中的乙酰膽堿。當(dāng)其與乙酰膽堿結(jié)合時，α7nAChR 的抗炎信號傳導(dǎo)至細(xì)胞質(zhì)，激活Janus 激酶2 /信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（JAK2/STAT3）信號通路，啟動抗炎轉(zhuǎn)錄。因此，迷走神經(jīng)可能通過乙酰膽堿/α7nAChR 抑制炎癥、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和促進(jìn)血管生成來治療心血管疾病。在本研究中，筆者評估了Elabela 對H9C2 細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響及其潛在的機制，現(xiàn)報道如下。

對象與方法

一、研究對象

筆者連續(xù)招募了北京佑安醫(yī)院26 例ST 段抬高型心肌梗死患者（STEMI 組）和同期的26 名健康受試者作為對照（對照組）。所有心肌梗死患者均為首次發(fā)生心肌梗死，并在癥狀出現(xiàn)后12 h 內(nèi)住院治療。STEMI 在入院時診斷需符合以下標(biāo)準(zhǔn)，包括臨床癥狀、典型心電圖表現(xiàn)、心肌肌鈣蛋白-Ⅰ（cTnⅠ）和CK-MB 含量增加以及冠狀動脈造影的結(jié)果。對照組則定義為冠狀動脈無明顯有意義的狹窄（狹窄< 50%）。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡< 18 歲或 > 80 歲、心肌病、感染性疾病、活動性炎癥疾病、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤晚期、嚴(yán)重肝腎功能不全且拒絕進(jìn)入研究者。筆者通過電子醫(yī)囑系統(tǒng)獲得受試者的人口統(tǒng)計學(xué)信息。所有受試者在入院后24 h 內(nèi)采集靜脈血以檢測血漿Elabela 水平。使用Elabela（人）試劑盒（美國半島實驗室，貨號：S-1508）對Elabela 的血漿濃度進(jìn)行定量檢測，操作按試劑盒說明進(jìn)行。本研究獲取了首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（LL-2021-004-Y），所有受試者均簽署了書面知情同意書。

二、主要試劑和抗體

DMEM/F12培養(yǎng)基（DMEM，產(chǎn)品編號sh30023.01b）和胎牛血清（產(chǎn)品編號sv30087.03）購自美國Hyclone 公司，過氧化氫（HO，產(chǎn)品編號RJ0523）購自德國Bioruler，乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，細(xì)胞計數(shù)試劑-8（CCK-8 試劑盒，產(chǎn)品編號C0038）、熒光探針二氫乙錠（DHE）均購自Beyotime 公司（中國江蘇），Bcl-2、Bax、GAPDH 抗體均購自ProteinTech 公司（美國芝加哥），α7nAChR 抗體購自英國劍橋Abcam 公司，p-JAK2、t-JAK2、p-STAT3、t-STAT3 抗體購自Cell Signaling Technology公司（美國馬薩諸塞州），凋亡檢測試劑盒購自Becton， Dickinson and Company（美 國 紐 約BD 公司），ELA-32（人，是Elabela 經(jīng)剪切后的一個成熟肽，含32 個氨基酸）（產(chǎn)品編號6291/100U）、Quantinova Rev 轉(zhuǎn)錄試劑盒（產(chǎn)品編號205411）、Quantinova SYBR PCR 試劑盒（產(chǎn)品編號208054）和RNeasy 迷你試劑盒（產(chǎn)品編號74104）購自德國Qiagen 公司。

三、細(xì)胞培養(yǎng)和處理

大鼠心肌細(xì)胞H9C2（大鼠胚胎心臟克隆細(xì)胞系，產(chǎn)品編號：JNO-19363-1）購自中國廣州吉妮歐生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)基由10%（V/V）胎牛血清、100 U/mL 青霉素/鏈霉素和DMEM 組成。細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，然后接種在6 孔板中，用ELA-32 和（或）α-銀環(huán)蛇毒素（α-BTX，Sigma）預(yù)處理30 min （HO+ ELA-32 組和HO+ELA-32 + α-BTX 組）。向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加HO（最終濃度為400 μmol/L）2 h（HO組），收集H9C2 或上清液進(jìn)行后續(xù)分析。

四、細(xì)胞活力測定

H9C2（6×10個細(xì)胞/mL）在對數(shù)期時接種在96 孔板上，根據(jù)試劑盒的說明，使用CCK-8 分析方法評估H9C2 的細(xì)胞活力。

五、LDH、SOD 和MDA 試驗

使用LDH 檢測試劑盒檢測細(xì)胞上清液中的LDH 濃度。使用SOD、MDA 試劑盒檢測培養(yǎng)基中SOD、MDA 的活性。

六、細(xì)胞凋亡檢測

使用Annexin V 異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）試劑盒在BD 流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡水平，使用FlowJo VX 軟件對細(xì)胞凋亡率進(jìn)行量化。

七、DHE 染色

使用組織活性氧（ROS）檢測試劑盒（DHE）處理細(xì)胞后在熒光顯微鏡下直接觀察，利用ImageJ軟件量化細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平。

八、蛋白免疫印跡法

蛋白經(jīng)提取、變性、電泳、電轉(zhuǎn)后，將Bax、Bcl-2、α7nAChR、p-JAK2、t-JAK2、p-STAT3、t-STAT3 和內(nèi)參GAPDH 的抗體（稀釋比例為1∶1000）培養(yǎng)過夜，清洗后再將抗兔二抗添加到膜上，然后用Licor 系統(tǒng)掃描。根據(jù)蛋白免疫印跡條帶的光密度測定蛋白表達(dá)。

九、實時熒光定量（RT）-qPCR

通過RNeasy 試劑盒從H9C2 細(xì)胞中提取總RNA，通過轉(zhuǎn)錄試劑盒從RNA 中反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA。用SYBRGreen PCR 混合物（Thermo Fisher Scientific，Inc.）在ABI 7500 熱循環(huán)上運行RT-qPCR法用于量化最終結(jié)果。本研究中使用的引物為：Elabela 正向5′-GCGAGTCTCTCTCTCTTTTATCAGG-3′和反向5′-ATCTCCGGCGAAAGAGAGTTG-3′，GAPDH 正向5′-TGATTCTACCCACGGCAAGTT-3′ 和 反 向5′-TGATGGGTTTCCCATTGATGA-3′。

十、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、STEMI 受試者血漿中的Elabela 水平增加

對照組和STEMI 組的性別、年齡、高血壓、糖尿病、吸煙、血脂、腎功能等比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均> 0.05），見表1；STEMI 組的Elabela 水平高于對照組（P < 0.001），見圖1。

表1 對照組和STEMI 組基線資料比較

二、H2O2 處理后Elabela 表達(dá)增加

用RT-qPCR 評 估HO處 理 后Elabela 的 表達(dá)，結(jié)果表明經(jīng)HO處理上調(diào)了Elabela 表達(dá)水平（2：1.007 vs. 5.640，t = 40.883，P < 0.001）。

三、ELA-32 預(yù)處理增強H9C2 細(xì)胞活力

與對照組相比，使用200 nmol/L 和500 nmol/L ELA-32 預(yù)處理增加了H9C2 細(xì)胞活力，2 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 21.029，P < 0.001），而在200 nmol/L 和500 nmol/L 組間細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F = 21.029，P = 0.570）（圖1）。因此，后續(xù)實驗決定使用200 nmol/L ELA-32 進(jìn)行30 min 的預(yù)處理。

圖1 不同濃度Elabela 對H9C2 細(xì)胞活力的影響

四、ELA-32 預(yù)處理保護(hù)H9C2 細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷

LDH 的釋放水平反映了細(xì)胞損傷的程度。HO可以明顯增加H9C2 細(xì)胞的LDH 釋放水平［（38.6±1.14）U/L vs. （83.6±5.22）U/L，P<0.001］，而ELA-32 預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)這種有害作用［（83.6±5.22）U/L vs.（62.2±12.39）U/L，P=0.001，F(xiàn) = 41.688，P < 0.001，n = 5］。

五、ELA-32 預(yù)處理減少H2O2 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷

與對照組相比，HO組ROS 陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加（F = 800.457，P < 0.001），但在ELA-32處理后ROS 陽性細(xì)胞數(shù)則減少（F = 800.457，P <0.001） （圖2A、B）。此外，經(jīng)HO處理H9C2 細(xì)胞 后，SOD 水 平 降 低（F = 10.929，P < 0.001），MDA 水平升高（F = 7.089，P = 0.001），而ELA-32 的預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了這種有害效應(yīng)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（SOD、MDA 分別為P = 0.001、P = 0.045）（圖2C、D）。這些結(jié)果均表明，ELA-32 可能抑制HO誘導(dǎo)的ROS 生成，減少H9C2 細(xì)胞損傷。

圖2 Elabela 對細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

六、ELA-32 減少H2O2 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞凋亡

用HO處理的H9C2 凋亡率明顯上升。但與HO處理的細(xì)胞相比，ELA-32 可以降低細(xì)胞的凋亡水平（圖3A、B，F(xiàn) = 360.182，P < 0.001）。與HO組相比，HO+ ELA-32 組的Bax/Bcl-2 降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3C、D，F(xiàn) = 85.180，P <0.001），提示ELA-32 可以減少HO損傷引起的細(xì)胞凋亡。

圖3 Elabela 對細(xì)胞凋亡的影響

七、ELA-32 對α7nAChR/JAK2/STAT3 通路的影響

為探索ELA-32 是如何保護(hù)H9C2 細(xì)胞的，研究對H9C2細(xì)胞中α7nAChR、p-JAK2、JAK2、p-STAT3和STAT3 的水平進(jìn)行定量研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在HO處理后的α7nAChR、 p-JAK2和p-STAT3 的蛋白質(zhì)水平表達(dá)降低，而ELA-32預(yù)處理組的α7nAChR、p-JAK2、p-STAT3 表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4A～D，P 均<0.05）， 表 明ELA-32 可 以 影 響α7nAChR/JAK2/STAT3 信號通路中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)。

圖4 Elabela 影響α7nAChR/JAK2/STAT3 信號通路蛋白表達(dá)

八、ELA-32 通 過α7nAChR 介 導(dǎo) 的JAK2/STAT3 途徑抑制H2O2 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞損傷

在HO處理的H9C2 細(xì)胞中，與單獨給予ELA-32 相比，ELA-32+α-BTX 處理增加了細(xì)胞凋亡率和ROS 陽性細(xì)胞的數(shù)量，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（圖5A～D，P 均< 0.05）。此外，與ELA-32 組相比，α-BTX 的應(yīng)用逆轉(zhuǎn)了Elabela 帶來的MDA的降低和SOD 的升高（圖5E、F，P < 0.05）。因此，ELA-32 可能部分通過激活α7nAChR/JAK2/STAT3 途徑發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用（圖6）。

圖5 Elabela 通過α7nAChR/JAK2/STAT3 信號通路發(fā)揮心肌保護(hù)的作用

圖6 Elabela 的作用和機制簡圖

討 論

MI/R 是AMI 后死亡的重要原因之一。MI/R是一種由炎癥、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等復(fù)雜因素引起的心肌損傷。研究發(fā)現(xiàn)，Elabela 可通過抑制缺氧/復(fù)氧（H/R）或MI/R 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）增加，保護(hù)腎臟免受MI/R 損傷。但是Elabela 能否減輕MI/R 損傷尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)ELA-32 可以降低HO誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞凋亡率，降低心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax 的產(chǎn)生、心肌細(xì)胞凋亡率、ROS 陽性細(xì)胞數(shù)、LDH 水平和MDA 水平；增加SOD 活性和Bcl-2 表達(dá)，從而發(fā)揮心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)ELA-32 可能部分通過激活α7nAChR/JAK2/STAT3 信號通路起到上述有益的作用。

目前，關(guān)于Elabela 在心肌缺血中作用的研究都是基于動物模型。Perjés 等發(fā)現(xiàn)，動物研究中的假手術(shù)組的Elabela 表達(dá)明顯低于心肌缺血組。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，對照組的血漿Elabela 濃度明顯低于STEMI 組。

LDH 是一種廣泛應(yīng)用的心肌損傷標(biāo)志物。諸多研究發(fā)現(xiàn)，MI/R 時LDH 釋放水平明顯增加。因此，筆者檢測了LDH 活性和細(xì)胞活力，用于評估心肌損傷的范圍。結(jié)果表明，ELA-32 預(yù)處理改善了HO誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞LDH 活性升高和細(xì)胞活力降低，表明ELA-32 對HO誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。Manzanero（2013 年）等發(fā)現(xiàn)，氧自由基在MI/R 條件下能夠大量產(chǎn)生。MI/R 的主要原因是通過有氧代謝產(chǎn)生的ROS。Valko（2007年）等認(rèn)為，ROS 是不穩(wěn)定的化合物，很容易與蛋白質(zhì)、DNA 反應(yīng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，甚至死亡。因此，減輕氧化應(yīng)激和減少氧化產(chǎn)物可能是治療MI/R 的一種途徑。在本研究中，筆者用DHE 染色陽性細(xì)胞的數(shù)量、MDA 和SOD 來反映H9C2 細(xì)胞中的氧化和抗氧化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過HO處理明顯降低SOD 水平，增加MDA 水平和DHE 陽性細(xì)胞，而用ELA-32 預(yù)處理則可明顯逆轉(zhuǎn)HO帶來的上述指標(biāo)的變化。在MI/R 過程中，細(xì)胞凋亡在細(xì)胞死亡中起著至關(guān)重要的作用。最終會導(dǎo)致心功能不全，甚至死亡。因此，降低心肌細(xì)胞的凋亡率已成為治療MI/R 損傷的有效方法之一。在本研究中，筆者檢測了Elabela 對細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，ELA-32 預(yù)處理明顯降低了Bax 水平和Bax/Bcl-2 值以及H9C2 細(xì)胞凋亡率。因此，筆者得出結(jié)論，ELA-32 預(yù)處理可能通過阻斷細(xì)胞凋亡途徑減輕HO損傷。

研究表明，刺激迷走神經(jīng)和α7nAChR / JAK2激活可降低MI/R 模型大鼠的炎癥水平、惡性心律失常和死亡的發(fā)生率，并抑制血液中的氧自由基濃度和左心室重塑。在本研究中發(fā)現(xiàn)，ELA-32明 顯 增 加 了α7nAChR、p-JAK2 和p-STAT3 的 表達(dá)。α7nAChR 拮抗劑α-BTX 可阻斷ELA-32 對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。因此，本研究證明α7nAChR/JAK2/STAT3 信號通路可能參與了Elabela 對HO誘導(dǎo)的心臟損傷的保護(hù)作用。

本研究還存在一些不足。臨床研究上，缺乏關(guān)于缺血持續(xù)時間、缺血區(qū)域范圍、冠狀動脈疾病程度（1～3 支血管疾?。┑男畔?，也沒有動態(tài)觀察血漿Elabela 的濃度變化，基礎(chǔ)研究中也缺乏動物實驗，將來有必要進(jìn)一步擴大樣本量，完善體內(nèi)實驗，進(jìn)一步探索Elabela 調(diào)節(jié)α7nAChR 的具體過程。

ELA-32 預(yù)處理至少部分通過α7nAChR/JAK2/STAT3 信號通路對HO誘導(dǎo)的心臟損傷發(fā)揮保護(hù)作用。Elabela 可能成為改善MI/R 損傷的有效藥物。