198 例兒童哮喘4 種基因多態(tài)性分布特征及個(gè)體化治療效果分析

劉勇 陸婉秋

哮喘是常見的慢性氣道疾病，其臨床表現(xiàn)主要為反復(fù)喘息、咳嗽、氣促和胸悶，通常在夜間和（或）凌晨發(fā)作或加劇。哮喘嚴(yán)重影響患兒健康，并給社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)，以及對家庭和主要照顧者都有一定程度的負(fù)面影響。目前大多認(rèn)為哮喘是一種由免疫、遺傳、環(huán)境等因素導(dǎo)致的多因素疾病，其遺傳與多個(gè)基因位點(diǎn)有關(guān)。研究者報(bào)道，IL-13 基因R110Q（IL-13 R110Q）、IL-4 基因-590C>T（IL-4-590C>T）、β腎上腺素能受體基因R16G（ADRB2 R16G）、IgE 高親和力受體β 鏈基因E237G（FcER1B E237G）組成的四位點(diǎn)模型是哮喘易感基因的最佳預(yù)測模型。單核苷酸多態(tài)性與藥物治療關(guān)系密切，并且與哮喘的易感性及其嚴(yán)重程度有關(guān)。劉艷琳等研究顯示，實(shí)現(xiàn)哮喘個(gè)體化治療需要以藥物基因檢測作為方向，然而，目前國內(nèi)相關(guān)臨床數(shù)據(jù)有限，仍然需要大樣本研究來獲取更可靠的臨床數(shù)據(jù)。本研究主要分析了198 例兒童哮喘4 種相關(guān)基因（IL-13 R110Q、IL-4-590C>T、ADRB2 R16G、FcER1B E237G）的多態(tài)性，描述哮喘兒童的遺傳特征，觀察并分析了哮喘相關(guān)藥物基因檢測結(jié)果指導(dǎo)哮喘患兒個(gè)體化治療后的臨床療效，進(jìn)而為哮喘患兒的個(gè)體化治療提供臨床數(shù)據(jù)支持。

對象與方法

一、研究對象

選取2019 年7 月到2021 年9 月在貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科門診確診的396 例非急性發(fā)作期輕-中度哮喘兒童作為研究對象。干預(yù)組198例，行四基因位點(diǎn)的多態(tài)性及哮喘藥物基因檢測；對照組198 例，未行四基因位點(diǎn)的多態(tài)性及哮喘藥物基因檢測。入組標(biāo)準(zhǔn)：①非急性發(fā)作期的輕-中度哮喘兒童，哮喘的診斷及分級標(biāo)準(zhǔn)參照《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016 年版）》；②初診支氣管哮喘且未規(guī)范治療；③貴州省內(nèi)本地居民。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并引起咳嗽、喘息為主要癥狀的其他疾病，包括支氣管異物、肺結(jié)核、先天性心臟病、先天性呼吸系統(tǒng)畸形、支氣管狹窄、胃食管反流病、先天性免疫缺陷病等。此研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)［批件號：2021 倫審第（155）號］，所有患兒的監(jiān)護(hù)人均已簽署知情同意書。

二、方 法

1. 干預(yù)組DNA 的提取

干預(yù)組行四基因位點(diǎn)的多態(tài)性及哮喘藥物基因檢測。收集患兒口腔雙側(cè)內(nèi)腮頰黏膜拭子，并置于專用離心管，?20 ℃冰箱保存，送至上海解碼醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，應(yīng)用天根口腔拭子基因組DNA 提取試劑盒（美國Agena Bioscience 公司），按試劑盒說明書步驟提取DNA。

2. 基因多態(tài)性分析

將提取的DNA 樣本經(jīng)過PCR、擴(kuò)增、純化、引物延伸、純化、點(diǎn)樣等步驟，最后運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS） 對IL-13 R110Q、IL-4-590C>T、ADRB2 R16G、FcER1B E237G 4 個(gè)哮喘易感基因位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）進(jìn)行基因分型。其中IL-13 R110Q位點(diǎn)有3 種基因型，分別為AA、AG、GG；IL-4-590C > T 位點(diǎn)有3 種基因型，分別為TT、CT、CC；ADRB2 R16G 位點(diǎn)有3 種基因型，分別為AA、AG、GG；FcER1B E237G 位點(diǎn)有3 種基因型，分別為AA、AG、GG。將4 個(gè)基因位點(diǎn)均不攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因純合子者定義為哮喘基因檢測陰性，任一基因位點(diǎn)攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因純合子者定義為哮喘基因檢測陽性。

3. 藥物基因檢測

對常見的三大類支氣管哮喘控制藥物基因［包括糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子1（GLCCI1）基因 rs37973、低親和力IgE 受體（FcER2）基因rs28364072、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體1（CRHR1）基因 rs242941、細(xì)胞色素氧化酶P450 3A5（CYP3A5）基因 rs776746、ADRB2 基因rs1042713、ⅩⅩⅡ型α1 鏈膠原（COL22A1）基因rs6988229、CRHR2 基因 rs7793837、腺苷酸環(huán)化酶9（ADCY9）基因 rs2230739、白三烯C4 合成酶（LTC4S） 基因 rs730012、5-脂氧化酶（ALOX5）基因 rs2115819］進(jìn)行治療反應(yīng)檢測，最終得到個(gè)體化用藥提示結(jié)果，并分為療效較好、療效欠佳2 類。

4. 治療方法

干預(yù)組與對照組的吸入性糖皮質(zhì)激素（ICS）治療方案均按照《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016 年版）》執(zhí)行，在治療隨訪期間根據(jù)患兒病情適當(dāng)加用硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑。個(gè)體化治療方案中的藥物包括3 大類：①糖皮質(zhì)激素（激素），如丙酸氟替卡松、布地奈德、二丙酸倍氯米松；②β受體激動劑，如沙美特羅、福莫特羅、沙丁胺醇；③白三烯調(diào)節(jié)劑，如孟魯司特。干預(yù)組根據(jù)哮喘藥物基因檢測的結(jié)果選擇上述療效較好的ICS 治療。其中經(jīng)丙酸氟替卡松吸入氣霧劑治療90 例、布地奈德治療60 例、二丙酸倍氯米松治療48 例。對照組使用的激素類型同干預(yù)組，其中丙酸氟替卡松吸入氣霧劑治療90 例、布地奈德治療60 例、二丙酸倍氯米松治療48 例。藥物用量與用法：丙酸氟替卡松吸入氣霧劑1 撳/次，早晚各1 次；吸入用布地奈德混懸液1 mg/次，早晚各1 次；丙酸倍氯米松吸入氣霧劑2 撳/次，早晚各1 次。

5. 觀察指標(biāo)

根據(jù)患兒的年齡選擇以下相應(yīng)的哮喘控制評估工具對個(gè)體化治療后的療效進(jìn)行評價(jià)：①哮喘控制測試（ACT）評分，適用于≥12 歲的患兒，評分范圍5～25 分，≤19 分為控制不佳，20～24 分為良好控制，25 分為完全控制。②兒童哮喘控制測試（C-ACT）評分，適用于4～11 歲的患兒，評分范圍5～27 分，24～27 分為哮喘完全控制，20～23分為哮喘部分控制，≤19 分為哮喘未控制。③兒童呼吸和哮喘控制測試（TRACK）評分，適用于≤5 歲的患兒，< 80 分為控制不佳，≥80 分為哮喘控制。考慮本研究中C-ACT 與TRACK 兩個(gè)評分工具有年齡重疊，故統(tǒng)一年齡 ≤5 歲的患兒采用TRACK評分進(jìn)行評價(jià)，年齡6～11 歲的患兒以C-ACT 進(jìn)行評價(jià)。分別于入組時(shí)、治療1 個(gè)月、治療3 個(gè)月對患兒進(jìn)行問卷評分。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、干預(yù)組與對照組患兒的性別構(gòu)成和年齡比較

干預(yù)組198 例患兒中，男133 例、女65 例，年齡（4.4±2.7）歲。對照組198 例患兒中，男128例、女70 例，年齡（4.6±2.8）歲。2 組患兒的性別構(gòu)成、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均>0.05）。

二、干預(yù)組患兒哮喘相關(guān)基因多態(tài)性分析

干預(yù)組患兒IL-13 R110Q、IL-4-590C>T、ADRB2 R16G、FcER1B E237G 基因型的頻數(shù)和頻率見表1，IL-13 R110Q、IL-4-590C>T、ADRB2 R16G、FcER1B E237G 等位基因的頻數(shù)和頻率見表2。IL-13 R110Q 基因?qū)嶋H頻數(shù)與預(yù)期頻數(shù)對比=0.068，P = 0.794；IL-4-590C>T 基因?qū)嶋H頻數(shù)與預(yù)期頻數(shù)對比=2.462，P = 0.117；ADRB2 R16G 基因?qū)嶋H頻數(shù)與預(yù)期頻數(shù)對比= 5.760，P = 0.016；FcER1B E237G 基因?qū)嶋H頻數(shù)與預(yù)期頻數(shù)對比=0.967，P = 0.325，位點(diǎn)分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，具有群體代表性。IL-13 R110Q 位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)基因型GG、IL-4-590C>T 位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)基因型TT、ADRB2 R16G 位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)基因型AA 的比例較高，而FcER1B E237G 位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)基因型GG 比例最低。經(jīng)哮喘基因檢測結(jié)果提示，陽性134 例、占67.7%，陰性64 例、占32.3%。

表1 干預(yù)組198 例哮喘患兒IL-13、IL-4、ADRB2、FcER1B 基因型頻數(shù)及頻率

表2 干預(yù)組198 例哮喘患兒IL-13、IL-4、ADRB2、FcER1B 等位基因頻數(shù)及頻率

三、干預(yù)組與對照組的療效分析

入組時(shí)，2 組ACT、C-ACT 和TRACK 評分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均> 0.05）。治療1 個(gè)月后，干預(yù)組C-ACT、TRACK 評分均優(yōu)于對照組（P 均> 0.05）；治療3 個(gè)月后，干預(yù)組的哮喘控制評分均優(yōu)于對照組（P 均< 0.05），見表3。

表3 ICS 治療前后干預(yù)組與對照組的哮喘控制評分比較（x±s） 單位：分

討 論

兒童哮喘的患病率呈逐年上升趨勢。越來越多的研究顯示，哮喘的發(fā)病機(jī)制是多種基因、免疫和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者對哮喘相關(guān)基因進(jìn)行了大量的研究，尤其是隨著全基因組關(guān)聯(lián)研究的廣泛開展，迄今已發(fā)現(xiàn)近1000 個(gè)哮喘候選基因。我國鮑一笑教授團(tuán)隊(duì)通過大量研究發(fā)現(xiàn)，由IL-13 R110Q、IL-4-590C>T、ADRB2 R16G、FcER1B E237G 組成的4位點(diǎn)模型是最佳的兒童哮喘易感基因預(yù)測模型，并且該模型與哮喘預(yù)測指數(shù)和特應(yīng)性相關(guān)，推測其可作為預(yù)測學(xué)齡前喘息兒童未來是否會發(fā)展為哮喘的有力工具，該團(tuán)隊(duì)提出基因多態(tài)性對藥物治療反應(yīng)差異的影響是未來個(gè)體化藥物治療的一個(gè)主要研究方向。

1 型輔助性T 淋巴細(xì)胞（Th1）/ Th2 失衡是哮喘主要的免疫發(fā)病機(jī)制，Th2 產(chǎn)生的IL-13 和IL-4 起了重要的作用。多項(xiàng)研究表明，IL-4 基因和IL-13 基因與兒童哮喘密切相關(guān)，曹華等研究顯示，導(dǎo)致兒童哮喘的主要因素是IL-4 基因和IL-13基因之間的相互作用。舒磊等研究報(bào)道，IL-13 rs20541（即 R110Q）SNP 與哮喘患兒的發(fā)病呈強(qiáng)相關(guān)。廖興娟等報(bào)道，IL-4-590C/T 位點(diǎn)的多態(tài)性可能與貴陽地區(qū)的兒童哮喘有關(guān)。

目前，對ADRB2 基因的研究主要集中在編碼區(qū)第16 和第27 位的多態(tài)性，但是各種報(bào)道的結(jié)果并不完全一致。馮媛元等的研究表明，ADRB2基因的rs1042713 位點(diǎn)，即ADRB2 R16G 多態(tài)性，不僅與兒童哮喘的易感性有關(guān)，而且在一定程度上影響哮喘患兒對治療的反應(yīng)。 但陳更業(yè)等研究表明，β-2AR 基因16 位點(diǎn)基因多態(tài)性和中國漢族兒童哮喘易感性無關(guān)。一項(xiàng)關(guān)于沙特阿拉伯哮喘人群的研究亦報(bào)道ADRB2 基因SNP 與哮喘無關(guān)。上述研究顯示ADRB2 基因SNP 分布不一致的原因可能是不同地域和環(huán)境存在差異。

FcER1B 主要參與IgE 介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)，使肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)和分泌細(xì)胞因子。郭素華等研究報(bào)道，兒童喘息的發(fā)病和FcER1β 基因多態(tài)性有關(guān)，風(fēng)險(xiǎn)型基因不僅是喘息的危險(xiǎn)因素，而且影響喘息發(fā)作的嚴(yán)重程度，但并非哮喘的主導(dǎo)因素。劉婷等研究顯示，哮喘、特應(yīng)性與E237G 基因突變可能無關(guān)。

隨著我國兒童哮喘相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)與指南的推出并不斷更新，大部分兒童哮喘得到有效控制，但仍有部分哮喘患兒難以控制，隨著藥物基因組學(xué)的開展，這為兒童哮喘個(gè)體化治療提供了方向。多項(xiàng)研究利用基因檢測臨床指導(dǎo)哮喘患兒的個(gè)體化治療，均取得一定的成效。

本研究顯示，IL-13 R110Q 位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)基因型GG、IL-4-590C/T 位 點(diǎn) 風(fēng) 險(xiǎn) 基 因 型TT、ADRB2 R16G 位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)基因型AA 的比例較高，而FcER1B E237G 位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)基因型GG 比例最低，是否表明FcER1B 基因不是本地區(qū)兒童哮喘發(fā)病的因素，這仍需要大樣本數(shù)據(jù)的支持。另有研究顯示，哮喘患兒哮喘基因檢測陽性者占67.7%，在臨床工作中哮喘基因檢測可考慮作為預(yù)測哮喘風(fēng)險(xiǎn)的檢查之一。本研究同時(shí)通過哮喘藥物基因檢測結(jié)果為患兒制定ICS 個(gè)體化治療方案后，治療后3 個(gè)月干預(yù)組患兒的哮喘控制評分均優(yōu)于對照組，這為本地區(qū)兒童哮喘的精準(zhǔn)治療提供了一定的臨床數(shù)據(jù)支持。然而，目前尚缺乏利用藥物基因組學(xué)指導(dǎo)兒童哮喘治療的大樣本研究，期望未來開展更多人群、更多位點(diǎn)的研究，最終實(shí)現(xiàn)兒童哮喘精準(zhǔn)醫(yī)療的目的。