不同電針頻率對抑郁樣小鼠認知功能的影響*

謝彥穎 劉亮生 陳進東

抑郁癥(Depression)作為目前常見的精神疾病之一，主要臨床表現(xiàn)為情緒低落、愉快感缺失、乏趣、自卑、自責、意志活動減退等癥狀，有的患者也會伴有幻覺、妄想等精神類癥狀，抑郁癥對個人認知能力、社會功能、生活質量造成深遠負性影響[1,2]。認知缺陷是抑郁癥的特征之一，研究表明抑郁癥患者在認知加工速度、注意力廣度、記憶力和執(zhí)行功能方面都有損害[3,4]。同時抑郁癥也是阿爾茨海默病的一個危險因素[5]，可能是阿爾茨海默病的前兆[6]。電針作為針灸的主要衍生方式，在臨床中已經(jīng)被證實能夠對抑郁癥有著較好的療效[7]，同時對認知功能損傷的恢復有積極的作用[8-10]。雖然有報道不同的電針參數(shù)對認知能力的恢復有不同的影響[11,12]，但尚未有關于不同電針頻率對抑郁癥及其認知功能的影響的研究報道。本研究從認知的角度，選擇連續(xù)波中不同頻率的電針參數(shù)觀察電針對抑郁樣小鼠抑郁樣行為及認知功能的影響，探討電針治療抑郁癥認知功能的最優(yōu)電針參數(shù)。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與分組SPF級雄性C57/BL6小鼠60只，7周齡，體質量18～22 g，購于浙江維通利華實驗技術有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2019-0001]。實驗小鼠飼養(yǎng)于廈門市仙岳醫(yī)院精神衛(wèi)生研究室，飼養(yǎng)環(huán)境：每籠4只小鼠，溫度22～25 ℃，濕度50%～55%，12 h/12 h明暗時長，自由飲食飲水。實驗小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機區(qū)組分為對照組(Ctrl=12只)、模型組(CUMS=12只)、模型+2 Hz電針組(2 Hz=12只)、模型+15 Hz電針組(15 Hz=12只)、模型+100 Hz電針組(100 Hz=12只)。實驗過程中對動物的處置嚴格遵照中華人民共和國科學技術部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[13]，所有實驗由廈門市仙岳醫(yī)院實驗動物管理倫理委員會進行監(jiān)督與管理(2021-KY-001)。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑①氯化鈉(美國，SIGMA.S7653-1KG)；②碳酸氫鈉(美國，SIGMA.S5761-500G)；③蔗糖(美國，SIGMA.V90016)；④氯化鉀(美國，SIGMA.P9333-1KG)；⑤二水合氯化鈣(美國，SIGMA.C5080-500G)；⑥葡萄糖(美國，SIGMA.G7021-1KG)；⑦二水合磷酸二氫鈉(美國，SIGMA.71500-1KG)；⑧硫酸鎂(美國，SIGMA.M2643-500G)；⑨人工腦脊液(Artificial Cerebrospinal Fluid,ACSF,250 ml)：120.0 mM氯化鈉，2.5 mM氯化鉀，1.2 mM二水合磷酸二氫鈉，2.0 mM硫酸鎂，2.0 mM二水合氯化鈣，26 mM碳酸氫鈉，10 mM葡萄糖；pH7.35～7.45，滲透壓290～310 mOsm。

1.2.2 電針治療相關設備①針灸針(中國，中研太和，0.16 mm×7 mm)；②Master-9(以色列，A.M.P.Instruments LTD.7733)；③小動物麻醉機(中國，瑞沃德，R58S)。

1.2.3 行為學檢測相關設備動物行為學視頻分析系統(tǒng)(美國，Stoeling，ANY version 4.99 m)。

1.2.4 電生理檢測相關設備及耗材①震動切片機(德國，徠卡，VT1000S)；②膜片鉗CCD(日本，尼康，ECLIPSE FN1)；③膜片鉗顯微鏡(日本，尼康，OFN22 WD30)；④數(shù)模轉換器(美國，MD，Axon Digidata 1550B)；⑤數(shù)字放大器(美國，MD，Axon Multi Clamp 700B)；⑥微電極拉制儀(美國，Sutter，P-1000)；⑦恒溫水浴鍋(中國，南京舜瑪儀器設備有限公司，SM8D)；⑧玻璃微電極(美國，Sutter，BF100-50-10)；⑨異氟烷(中國，瑞沃德，R510-22)。

1.3 模型制備模型組與電針組實驗動物采用慢性溫和性不可預見性應激(Chronic Unpredictable Mild Stress, CUMS)方法制備抑郁模型[14]，造模連續(xù)3周，期間小鼠每天隨機給予不同應激，包括：①24 h禁食；②24 h禁水；③2 h束縛；④7 h籠子傾斜；⑤夜間照明；⑥24 h臟籠飼養(yǎng)(每100 g墊料加水200 ml)；⑦8 ℃水中強迫游泳30 min；⑧24 h暴露在異物中(如塑料)。造模期間給予對照組小鼠常規(guī)方式飼養(yǎng)，不進行應激。

1.4 干預方法造模后，電針組小鼠進行電針干預，使用5%異氟烷誘導麻醉后使用2%異氟烷維持麻醉。小鼠麻醉后，俯臥位置于保溫墊上，參照《實驗針灸學》[15]選取百會穴、印堂穴，采用0.16 mm×7 mm一次性針灸針，百會穴與印堂穴向后斜刺2 mm，連接master-9進行電針治療，選用連續(xù)波，電流1 mA，相應分組分別采用2 Hz、15 Hz、100 Hz的電針頻率，每次治療時間30 min，每周治療6 d，連續(xù)治療3周。對照組與模型組進行相同方式的麻醉，不電針。

1.5 指標檢測

1.5.1 行為學檢測行為學檢測前，將實驗小鼠提前2 h轉運至小動物行為學室進行適應，行為學室為隔音室，濕度、溫度同小鼠飼養(yǎng)環(huán)境。

糖水偏好實驗(Sucrose Preference Tests, SPT)[14]：小鼠單籠飼養(yǎng)，首先訓練動物消耗來自2個不同瓶子的1%蔗糖溶液(正式實驗前48 h)。24 h后，允許動物自由接觸來自2個不同瓶子的1%蔗糖溶液和水。為避免位置偏愛，12 h后將2個瓶子位置互換。24 h后測量兩瓶中的液體量，并根據(jù)以下公式計算蔗糖偏好：蔗糖偏好=蔗糖消耗量/(蔗糖+水消耗量)×100%。

懸尾實驗(Tail Suspension Tests, TST)[14]：將小鼠的尾巴懸掛在丙烯酸棒上6 min(直徑1.5 cm，高30 cm)，并使用視頻跟蹤系統(tǒng)進行監(jiān)控。記錄6 min內的不動持續(xù)時間，分析后5 min的實驗數(shù)據(jù)。每只小鼠結束實驗后均用10%乙醇進行清理小鼠排泄物，消除氣味對其他小鼠的影響。

強迫游泳實驗(Forced Swimming Tests, FST)[14]：小鼠放置在一個裝有水(23±1)℃深13 cm透明丙烯酸圓柱桶中(直徑10 cm，高20 cm)。使用視頻跟蹤系統(tǒng)將小鼠放入水中6 min；記錄測試的最后5 min內的不動持續(xù)時間。

Morris水迷宮實驗(Morris Water Maze Task)[16]：為了評估學習和記憶，實驗小鼠進行為期5 d的 Morris水迷宮任務測試。水迷宮裝置由直徑120 cm，高50 cm，水深40 cm 的圓柱形水箱和連接計算機的攝像機組成。水箱分為4個象限，平臺(直徑10 cm)放置在第三象限，距離水面1 cm。在定位導航訓練過程中，將一只老鼠從每個象限的等距位置放入水中4 d。當一只老鼠在90 s內停留在平臺上超過3 s時，這個時間將被記錄為該象限老鼠的逃避潛伏期。如果老鼠在90 s內沒有找到平臺，它就會被從水中取出，放在平臺上進行15 s學習。第5天是測試實驗，調查記憶的鞏固。平臺被移走，老鼠被放在第一象限，記錄每只小鼠的游泳軌跡。

跳臺回避實驗(Step-down Avoidance Test)[16]：在Morris水迷宮任務測試之后進行跳臺回避測試，將小鼠放入實驗箱(20 cm×20 cm×60 cm)的圓柱形隔熱平臺中，適應周圍環(huán)境3 min。當老鼠走下平臺時會立即接受2 s電刺激(電壓32 V，電流0.25 A)，訓練時間5 min。訓練后24 h，記錄潛伏期(第1次下臺)和錯誤次數(shù)(跳臺次數(shù))，記錄時間5 min。

1.5.2 電生理檢測腦片制備：0～4 ℃ ACSF通入95%O2+5%CO2混合氣體30 min，小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后快速取腦放入0～4 ℃ ACSF中，使用震動切片機將小鼠大腦切至400 μm厚的腦片，34 ℃ ACSF孵育30 min，室溫孵育1 h后進行記錄。ACSF全程通入上述混合氣體。

長時程增強記錄(Long-term Potentiation，LTP)[17]：使用同心圓電極刺激 SC-CA1通路，3～5 MΩ的玻璃電極內部裝入ACSF，電流鉗記錄 CA1局部的場電位(field EPSPs, fEPSPs)。刺激參數(shù)100 μs的恒定電流脈沖，頻率為0.033 Hz，強度為最大振幅的30%左右，時間為1 s。通過測量fEPSPs的斜率來確定突觸傳遞的強度。記錄刺激前10 min基線及刺激后60 min的fEPSPs。

2 結果

2.1 各組小鼠抑郁樣行為學比較與對照組(Ctrl)相比，模型組(CUMS)表現(xiàn)出典型的抑郁樣表現(xiàn)：糖水偏好減少，懸尾與強迫游泳中的靜止時間增多(圖1A、1B、1C，P<0.01)；與模型組(CUMS)相比，2 Hz電針治療能夠明顯改善小鼠抑郁樣行為：糖水偏好增加，懸尾與強迫游泳中的靜止時間減少(圖1A、1B、1C，P<0.01)，而15 Hz、100 Hz的電針治療只能改善部分抑郁樣行為(圖1B，P<0.01)。見圖1。

注：A圖：在糖水實驗中，CUMS組小鼠對糖水的偏好明顯降低，而2 Hz較15 Hz、100 Hz的電針治療能夠更為明顯改善小鼠對糖水的偏好；B圖：在懸尾實驗中，CUMS組小鼠靜止的時間明顯增長，而電針能夠有效減少小鼠的靜止時間，其中2 Hz的電針參數(shù)效果最好；C圖：在強迫游泳實驗中，CUMS組小鼠靜止的時間明顯增長，只有2 Hz的電針能夠有效減少小鼠靜止的時間。*P<0.05，**P<0.01，n=12只/組。

2.2 各組小鼠認知行為學比較與對照組(Ctrl)相比，模型組(CUMS)有明顯的認知功能損傷：Morris水迷宮的潛伏期縮短，跳臺規(guī)避實驗中的潛伏期延長、錯誤次數(shù)增多(圖2A、2B、2C、2D、2E，P<0.01)；與模型組(CUMS)相比，2 Hz電針治療能夠明顯改善小鼠認知功能：Morris水迷宮的潛伏期縮短，跳臺規(guī)避實驗中的潛伏期延長、錯誤次數(shù)減少(圖2A、2B、2C、2D、2E，P<0.01)，而15 Hz、100 Hz的電針治療只能改善部分認知功能：Morris水迷宮的潛伏期縮短(圖2A、2B、2C，P<0.01)；15 Hz的電針治療也能夠減少跳臺規(guī)避實驗中的錯誤次數(shù)(圖2E，P<0.05)。見圖2

注：A圖：各組小鼠水迷宮實驗代表性例圖；B圖、C圖：水迷宮實驗中，CUMS組小鼠的潛伏期明顯延長，而電針能夠有效減少小鼠的潛伏期，其中2 Hz的電針參數(shù)效果最好；D圖、E圖：在跳臺回避實驗中，CUMS組小鼠的潛伏期明顯縮短，錯誤次數(shù)明顯增多，只有 2 Hz的電針能夠有效延長小鼠潛伏期。*P<0.05，**P<0.01，n=12只/組。

2.3 各組小鼠LTP比較與對照組(Ctrl)相比，模型組(CUMS)的LTP明顯受損(圖3A、3B、3C，P<0.01)；與模型組(CUMS)相比，2 Hz電針治療能夠顯著改善小鼠受損的LTP(圖3A、3B、3C，P<0.01)，而15 Hz、100 Hz的電針治療也能夠明顯改善小鼠受損的LTP(圖3A、3B、3C，P<0.05)。見圖3。

注：A圖：各組小鼠LTP代表性例圖；B圖、C圖：CUMS組小鼠的LTP受損最嚴重，而電針能夠有效減少小鼠LTP受損情況，其中2 Hz的電針參數(shù)效果最好。*P<0.05，**P<0.01，n=8腦片/3只/組。

3 討論

抑郁癥的發(fā)病機制紛繁復雜，至今尚不明確，除了與遺傳因素密切相關外，心理社會因素是其另一主要發(fā)病因素[18]。慢性不可預見性溫和刺激(CUMS)作為應激的一種主要模式被廣泛應用于抑郁癥、焦慮癥等精神心理疾病模型中，通過不同的應激方法作用于小鼠可以獲得比較穩(wěn)定的抑郁癥樣小鼠模型[19]。抑郁樣小鼠行為主要表現(xiàn)在糖水偏好的降低、懸尾實驗和強迫游泳實驗的不動時間延長、新環(huán)境進食抑制實驗潛伏期延長等方面[19]。

雖然抑郁癥是以情緒低落、興趣減退、快感缺失為主要癥狀，但越來越多的研究報道抑郁癥患者的認知功能有不同程度的損傷[20]，并且認知功能的損傷在老齡抑郁癥患者中表現(xiàn)得更加明顯[21]，因此有學者認為抑郁癥是老齡癡呆的一大危險因素[22]。

百會穴位于督脈之上，而督脈入絡腦，腦為諸陽之會，且百會穴位于巔頂，其下為腦，故百會具有調和機體陰陽、調節(jié)情志活動、醒腦開竅、安神定志等功效。印堂穴位于面部兩眉頭之間，其內為額葉，因其隸屬于督脈，故與腦聯(lián)系密切，因此印堂、百會穴一脈相通，可調督醒神?，F(xiàn)代研究表明選用百會穴、印堂穴能夠對腦內的單胺類神經(jīng)遞質、谷氨酸、γ-氨基丁酸等神經(jīng)遞質有不同的調節(jié)作用[23]，同時研究報道，電針“印堂”“百會”兩穴可使腦內5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素的含量增加，改善抑郁[24]。

針灸/電針在改善認知功能障礙方面有明顯的療效，針刺聯(lián)合藥物治療對阿爾茲海默病(Alzheimer’s Disease, AD)患者的短期和中期認知功能比單獨用藥有明顯的改善作用[9]，同時針灸有利于改善老年人的輕度認知功能障礙[10]?；A實驗研究表明，電針百會穴能顯著提高 APP/PS1轉基因小鼠的學習記憶能力，上調N-乙酰天冬氨酸、谷氨酸和肌醇代謝，增加海馬存活神經(jīng)元，促進BDNF和TrkB的表達[15]。LTP是發(fā)生在2個神經(jīng)元信號傳輸中的一種持久的增強現(xiàn)象，由于記憶被認為是通過突觸強度的改變來編碼的，因此LTP 被廣泛認為是構成學習和記憶基礎的主要細胞機制之一[25,26]，血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)大鼠的LTP受損明顯，針灸可增強VD大鼠海馬體中的LTP和去甲腎上腺素水平從而改善VD大鼠的認知功能[27]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，CUMS后的小鼠表現(xiàn)出糖水偏好減少、懸尾實驗與強迫游泳實驗的不動時間延長等典型的抑郁樣行為，同時也有水迷宮實驗與跳臺規(guī)避實驗中的潛伏期延長、LTP受損等認知功能障礙的表現(xiàn)，而2 Hz電針干預在改善小鼠的抑郁樣行為和認知功能障礙方面效果突出，15 Hz、100 Hz電針干預則只能夠部分改善小鼠的抑郁樣行為及認知功能。

4 結論

本實驗的研究結果表明，在選用連續(xù)波的情況下，2 Hz電針治療不僅能夠有效改善小鼠抑郁樣行為，同時能夠明顯改善抑郁樣小鼠的認知功能；15 Hz、100 Hz電針治療只能夠部分改善小鼠的抑郁樣行為及認知功能，其中15 Hz的療效優(yōu)于100 Hz。