miR-21靶向調(diào)控PTEN/PI3K/Akt通路對膽管癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

施 喆, 周麗媛, 趙國棟, 孫樹剛, 薛 亮

河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院 a.普外科， b.婦科， 河北 邯鄲 056000

膽管癌源是肝膽系統(tǒng)中高度致命的惡性腫瘤，近年來全球范圍內(nèi)發(fā)病率不斷上升[1-2]。目前膽管癌病因尚不明確，手術(shù)切除是其主要的根治性手段。但由于膽管癌早期癥狀不明顯且診斷困難，大多數(shù)患者初診時(shí)已處于晚期，總體手術(shù)切除率極低[3]。此外，膽管癌具有高侵襲轉(zhuǎn)移性，惡性進(jìn)展迅速，導(dǎo)致總體預(yù)后差、病死率高，嚴(yán)重威脅人類健康[4]。因此探索新的膽管癌治療方式具有重要意義。已知腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是由多基因調(diào)控，其中原癌基因和抑癌基因的激活與失活發(fā)揮重要功能[5]。隨著腫瘤細(xì)胞增殖凋亡研究深入，多數(shù)原癌基因、抑癌基因及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成為腫瘤靶向治療的關(guān)鍵點(diǎn)[6]。蛋白酪氨酸磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)/磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號(hào)通路在惡性腫瘤細(xì)胞的增殖分化過程中起重要作用[7]。PTEN是目前公認(rèn)的抑癌基因之一，研究[8]表明過表達(dá)PTEN可抑制PI3K/Akt信號(hào)通路并抑制膽管癌細(xì)胞遷移能力。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)可靶向調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后翻譯或使其降解，研究[9-10]表明miRNA-21(miR-21)參與膽管癌細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲，并具有抑制結(jié)直腸癌的增殖和調(diào)控PTEN/PI3K/Akt通路的作用。然而miR-21能否通過靶向PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控膽管癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為仍不清楚。鑒于此，本研究選取人膽管癌細(xì)胞株QBC939開展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，揭示miR-21靶向PTEN/PI3K/Akt通路調(diào)控人膽管癌細(xì)胞株QBC939惡性行為的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與試劑 人膽管癌細(xì)胞株QBC939(由武漢細(xì)胞研究所提供)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(LipofectamineTM2000)試劑盒(購自北京索萊寶科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：11668-027)；人miR-21模擬物(hsa-miR-21 mimics，合成序列：5′-UAGCUUAUCAGCUGAUGUUGA-3′)(pGFP-hsa-miR-21 mimics)過表達(dá)質(zhì)粒、hsa-miR-21抑制劑(hsa-miR-21 inhibitor，合成序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)(pGFP-hsa-miR-21 inhibitor)質(zhì)粒、hsa-miR-21 inhibitor陰性對照(negative control inhibitor，NC inhibitor，合成序列：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUAGUACAA-3′)(pGFP-NC inhibitor)質(zhì)粒、miR-21 mimics、miR-21 mimics陰性對照(negative control mimics，NC mimics)(合成序列：5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′)[均由和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司合成]；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)溶液(購自上海麥克林生化科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：M864643)；凋亡檢測試劑盒(購自杭州諾揚(yáng)生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：FXP023-020-20)；基質(zhì)膠(Matrigel)(購自上海慧穎生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：356234)；侵襲小室(Transwell)(購自北京明陽科華生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：BD-353503)；miR-21、PTEN、PI3K、Akt、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)基因所需實(shí)時(shí)-逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR)引物、野生型和突變型PTEN-3′UTR引物(均由重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司合成)；總RNA提取試劑盒[購自天根生化科技(北京)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：DP419]；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(購自北京索萊寶科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：PC0020)；兔抗人PTEN、PI3K、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、mTOR和β-actin單克隆抗體(一抗)、羊抗兔PTEN、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和β-actin熒光標(biāo)記多克隆抗體(二抗)(均購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：H00005728-K、ab226826、PAB1310、PAB19236、PAB18865、ab179467、ab195056、ab40755、ab372015、ab531250、5048S、ab11003)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒[購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：11401]；PureLinkTMPro 96基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)提取試劑盒(購自賽默飛世爾科技公司，生產(chǎn)批號(hào)：K182104A)；不產(chǎn)色鏈霉菌第二型(Streptomyces achromogenes Ⅱ，Sac Ⅱ)和流感嗜血桿菌d第三型(Haemophilus influenzae d Ⅲ，Hind Ⅲ)內(nèi)切酶(均購自北京博邁斯科技發(fā)展有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：R0157S、R0104V)；pmiRGLO載體(購自湖南科愛醫(yī)療器械有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：VT1439)；質(zhì)粒提取試劑盒(購自上海力敏實(shí)業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：12145)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 MTP-601F型酶標(biāo)儀[購自天美(中國)科學(xué)儀器有限公司]；Agilent NovoCyte Quanteon型流式細(xì)胞儀[購自安捷倫科技(中國)有限公司]；BD-YG3002型熒光顯微鏡(購自深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司)；TS100型倒置顯微鏡(購自武漢醫(yī)捷迅安商貿(mào)有限公司)；H12943型劃痕儀(購自北京恒奧德儀器儀表有限公司)；MA-6000型PCR儀(購自蘇州雅睿生物技術(shù)股份有限公司)；MS型實(shí)時(shí)凝膠電泳系統(tǒng)(購自北京興聯(lián)商貿(mào)有限公司)；Image J v1.8.0軟件(購自美國國立衛(wèi)生研究院)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將人膽管癌細(xì)胞株QBC939接種至含10%胎牛血清的無菌1640液體細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI-1640)中，37 ℃、5% CO2恒溫箱培養(yǎng)。將培養(yǎng)至對數(shù)期的癌細(xì)胞接種至6孔板，待細(xì)胞貼壁至70%左右時(shí)更換培養(yǎng)液。以LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作：加入轉(zhuǎn)染試劑后，逐滴加入hsa-miR-21 mimics過表達(dá)報(bào)告基因質(zhì)粒，培養(yǎng)4～6 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，將該組細(xì)胞記為過表達(dá)組；同法獲得轉(zhuǎn)染hsa-miR-21 inhibitor報(bào)告基因質(zhì)粒和NC inhibitor報(bào)告基因質(zhì)粒的QBC939細(xì)胞，分別記為沉默組和空載組；同時(shí)將未經(jīng)處理的QBC939細(xì)胞株記為空白對照組。每組5個(gè)復(fù)孔，并通過熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 MTT比色法檢測各組細(xì)胞增殖抑制率 胰蛋白酶消化，每孔加20 μL 5 mg/mL MTT溶液，4 h后棄培養(yǎng)液，加入150 μL二甲基亞砜，振蕩5 min，在酶標(biāo)儀上用490 nm波長測定OD值，計(jì)算0～72 h每組細(xì)胞增殖活性。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取OD的平均值。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率 胰蛋白酶消化，離心，預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度1×106個(gè)/mL。加入10 μL磷脂結(jié)合蛋白V避光室溫反應(yīng)10 min，預(yù)冷PBS洗滌，加入4 μL碘化丙啶，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 向Transwell中加60 μL 1.5 mg/mL的Matrigel，均勻鋪在小室上層濾膜，37 ℃孵育1 h成膜以模擬基底膜結(jié)構(gòu)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，將細(xì)胞加入Transwell小室上室內(nèi)，每孔200 μL，下孔加入RPMI-1640培養(yǎng)基后于37 ℃、5% CO2恒溫箱培養(yǎng)24 h。隨后分別經(jīng)過PBS洗滌、多聚甲醛固定、蒸餾水洗滌結(jié)晶紫染色以及洗滌風(fēng)干等步驟后獲取基底膜。倒置顯微鏡下分4個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域隨機(jī)選取1個(gè)視野，觀察拍照并計(jì)數(shù)。每組3張膜，穿膜細(xì)胞數(shù)取平均值。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞達(dá)到95%融合，用劃痕儀對準(zhǔn)6孔板下端中央部位輕輕劃痕。RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕漂洗3次后，37 ℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡拍照，觀察劃痕愈合情況。

1.2.6 RT-qPCR檢測miR-21、PI3K、Akt、mTOR和PTEN mRNA表達(dá) 提取各組細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)引物序列進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 s變性；55 ℃ 30 s退火；72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。引物序列見表1。本研究選取β-actin作為內(nèi)參基因，采用相對定量法[11]比較各組細(xì)胞待測基因mRNA表達(dá)差異。待測基因ΔΔCt值=[待測基因mRNA平均Ct值(轉(zhuǎn)染組)- β-actin mRNA平均Ct值(轉(zhuǎn)染組)]-[待測基因mRNA平均Ct值(空白對照組)- β-actin mRNA平均Ct值(空白對照組)]。以2-ΔΔCt表示各組待測基因 mRNA表達(dá)的倍比關(guān)系。

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting，WB)檢測PTEN、PI3K、Akt和mTOR蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)。BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白終濃度為5 μg/μL。WB凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，脫脂奶粉封閉，加入一抗，4 ℃孵育過夜，將聚偏二氟乙烯膜置于含有二抗試管中，室溫孵育，顯色反應(yīng)，掃描膠片后用Image J軟件分析蛋白印跡灰度值。

表1 PCR反應(yīng)引物序列Table 1 The primer sequences of PCR reaction

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 采用TargetScan數(shù)據(jù)庫[12]預(yù)測miR-21的靶基因。構(gòu)建野生型和突變型PTEN-3′UTR報(bào)告基因質(zhì)粒。野生型PTEN-3′UTR報(bào)告基因質(zhì)粒：獲取細(xì)胞總DNA后，根據(jù)設(shè)計(jì)好的引物(引物包含Sac Ⅱ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))，以細(xì)胞總DNA為模板經(jīng)2次PCR擴(kuò)增出所需片段；對瓊脂糖電泳回收的PCR擴(kuò)增條帶進(jìn)行Sac Ⅱ和Hind Ⅲ雙酶切，同時(shí)將報(bào)告質(zhì)粒pmiRGLO進(jìn)行雙酶切，回收兩者雙酶切電泳條帶；連接兩者雙酶切產(chǎn)物；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中；選取合適單菌落，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)鑒定序列信息與NCBI數(shù)據(jù)庫收錄序列一致。野生型PTEN-3′UTR引物序列：上游引物5′-CCACCAGAGCTCTCTTGTGCTGTGCAGCAG-3′，下游引物5′-CCAACGAAGCCTGTGATGGCATTCACTGAACC-3′。突變型PTEN-3′UTR報(bào)告基因質(zhì)粒：通過引物搭橋法對PTEN-3′UTR進(jìn)行定點(diǎn)突變，用設(shè)計(jì)好的上下游引物分別PCR擴(kuò)增出PTEN-3′UTR上游和下游突變產(chǎn)物；搭橋PCR程序進(jìn)行搭橋連接，以搭橋PCR產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增并電泳回收，后續(xù)過程同野生型PTEN-3′UTR報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建過程一致，經(jīng)鑒定連接產(chǎn)物的序列一致。突變型PTEN-3′UTR引物序列：上游引物5′-AACCGCGGTAAGAGAAATAAGCACCGTTTTCCAAG-3′，下游引物5′-AAAACGGTGCTTATTTCTCTTACCGCGGTTCAGATGTCTGAAGAT-3′。將野生型和突變型PTEN-3′UTR報(bào)告基因質(zhì)粒、miR-21 mimics及NC mimics轉(zhuǎn)染至QBC939細(xì)胞中，48 h后進(jìn)行雙熒光素酶檢測。各組相對熒光強(qiáng)度=各組螢火蟲熒光強(qiáng)度/海腎熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，未轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞無熒光?？蛰d組、過表達(dá)組和沉默組轉(zhuǎn)染效率分別為(90.27±18.03)%、(91.43±18.26)%和(92.16±18.41)%(圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)染后QBC939細(xì)胞熒光圖(×100)

2.2 各組細(xì)胞增殖活性和凋亡率 MTT 結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染處理后24～72 h，與空白對照組和空載組比較，過表達(dá)組QBC939細(xì)胞增殖活性明顯提高(P值均<0.05)(圖2)，凋亡率顯著下降(P值均<0.01)(圖3，表2)；與空白對照組、空載組和過表達(dá)組比較，沉默組細(xì)胞增殖活性顯著降低(P值均<0.01)(圖2)，而凋亡率顯著上升(P值均<0.01)(圖3，表2)。

圖2 各組QBC939細(xì)胞增殖活性

表2 各組QBC939細(xì)胞凋亡率Table 2 The apoptosis rates of QBC939 cells in each group

2.3 各組細(xì)胞遷移和侵襲活性 與空白對照組和空載組比較，過表達(dá)組QBC939細(xì)胞遷移率和穿膜數(shù)目均顯著增高(P值均<0.01)；與空白對照組、空載組和過表達(dá)組比較，沉默組遷移率和穿膜數(shù)目均顯著下降(P值均<0.01)(表3，圖4、5)。

表3 各組QBC939細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of in vitro invasion experiments of QBC939 cells in each group

2.4 各組細(xì)胞miR-21、PI3K、Akt、mTOR和PTEN mRNA表達(dá) 與空白對照組和空載組比較，過表達(dá)組miR-21、PI3K、Akt和mTOR mRNA表達(dá)均升高，PTEN mRNA表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；與空白對照組、空載組和過表達(dá)組比較，沉默組miR-21、PI3K、Akt和mTOR mRNA表達(dá)均下降，PTEN mRNA表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(圖6)。

圖3 流式細(xì)胞檢測各組QBC939細(xì)胞凋亡率Figure 3 Flow cytometry examined apoptosis rates of QBC939 cells in each group

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 Transwell小室試驗(yàn)結(jié)果(結(jié)晶紫染色，×100)

注：與空白對照組比較，#P<0.05；與空載組比較，△P<0.05；與過

2.5 各組細(xì)胞PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和PTEN蛋白表達(dá) 與空白對照組和空載組比較，過表達(dá)組PI3K、Akt、p-Akt和mTOR蛋白表達(dá)均顯著升高，PTEN蛋白表達(dá)顯著下降(P值均<0.01)；與空白對照組、空載組和過表達(dá)組比較，沉默組PI3K、Akt、p-Akt和mTOR蛋白表達(dá)均顯著下降，PTEN蛋白表達(dá)顯著升高(P值均<0.01)(圖7，表4)。

2.6 miR-21靶向PTEN的驗(yàn)證 TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測PTEN為miR-21潛在靶基因，PTEN基因3′UTR與miR-21有6個(gè)堿基位點(diǎn)互補(bǔ)配對(圖8)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，miR-21 mimics和野生型PTEN-3′UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度較NC mimics和野生型PTEN-3′UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯著降低(P<0.05)；miR-21 mimics和突變型PTEN-3′UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中相對熒光強(qiáng)度較NC mimics和突變型PTEN-3′UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖9)。

圖7 各組細(xì)胞PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和PTEN蛋白表達(dá)量Figure 7 Expression levels of PI3K, Akt, p-Akt, mTOR,and PTEN proteins in each group

圖8 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-21和PTEN的互補(bǔ)序列

3 討論

膽管癌作為高度惡性的實(shí)體腫瘤，其傳統(tǒng)手術(shù)切除率低，患者預(yù)后差，嚴(yán)重威脅人類健康。現(xiàn)如今靶向藥物的開發(fā)和應(yīng)用為腫瘤治療提供了新的思路。既往研究[8-10]表明miR-21可調(diào)控抑癌基因PTEN表達(dá)，而PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路在膽管癌增殖分化過程中發(fā)揮重要作用。然而miR-21能否靶向PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)膽管癌惡性行為未知。鑒于此，本研究選取膽管癌細(xì)胞株QBC939，研究miR-21基因干擾靶向PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)膽管癌惡性行為的分子機(jī)制。

表4 各組細(xì)胞PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和PTEN蛋白相對表達(dá)量Table 4 Relative expression levels of PI3K, Akt, p-Akt, mTOR, and PTEN proteins in each group

注：與轉(zhuǎn)染NC mimics細(xì)胞比較，P<0.05。

本研究結(jié)果顯示,在QBC939細(xì)胞中過表達(dá)miR-21可增加細(xì)胞的增殖活性、減少細(xì)胞的凋亡并提高細(xì)胞的遷移率和穿膜數(shù)目；當(dāng)沉默miR-21后，細(xì)胞的增殖活性降低、細(xì)胞凋亡率增加、遷移率和穿膜能力降低。說明miR-21過表達(dá)可顯著促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)膽管癌細(xì)胞惡性行為。有研究[13]指出，膽管癌細(xì)胞高增殖率和低凋亡率與膽管癌細(xì)胞活性增強(qiáng)相關(guān)，癌細(xì)胞遷移和侵襲與基質(zhì)金屬蛋白酶9和波形蛋白的表達(dá)水平相關(guān)，據(jù)此推測本研究中miR-21調(diào)節(jié)膽管癌細(xì)胞的增殖活性、凋亡率、遷移和侵襲行為可能與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的細(xì)胞活性、基質(zhì)金屬蛋白酶9以及波形蛋白表達(dá)水平相關(guān)。

為進(jìn)一步明確miR-21是否能作用于PTEN/PI3K/Akt通路，進(jìn)而調(diào)控膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤等惡性行為，本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-21 mimics過表達(dá)miR-21時(shí)，PI3K、Akt和mTOR mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均升高，而PTEN mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均下降，說明活化miR-21可增加PI3K/Akt通路的活性。當(dāng)抑制miR-21表達(dá)時(shí)，PI3K、Akt和mTOR mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均下降，PTEN mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均升高，表明抑制miR-21可抑制PI3K/Akt 通路的活性。一般Akt的激活都是磷酸化的途徑，總量基本穩(wěn)定，但p-Akt水平改變。但是在本研究中，隨著miR-21的過表達(dá)或沉默，Akt總量也發(fā)生了改變。既往研究[14]表明，泛素化是一種對靶蛋白進(jìn)行特異性修飾的過程，可調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡等多種進(jìn)程，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。據(jù)此推測miR-21可能通過泛素化干擾了Akt蛋白的降解過程，過表達(dá)miR-21導(dǎo)致Akt降解受阻，Akt總量增加，而沉默miR-21促進(jìn)Akt的降解導(dǎo)致總量下降。也可能是miR-21影響了Akt蛋白的表達(dá)。

本研究中雙熒光素酶結(jié)果顯示，miR-21 mimics可顯著抑制野生型PTEN-3′UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度，但是對突變型PTEN-3′UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞無影響，證明PTEN為miR-21的直接作用靶點(diǎn)。近年來腫瘤靶向治療逐漸重視miRNA的靶向作用[15]。miRNA是一種非編碼單鏈小分子RNA，作為轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)節(jié)因子，可與靶基因mRNA互補(bǔ)，結(jié)合到靶基因mRNA的3′UTR，抑制靶標(biāo)基因蛋白翻譯或使其降解，參與原癌和抑癌基因的調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝過程[16]。miR-21由22個(gè)核苷酸組成，參與癌癥的發(fā)生發(fā)展，在腫瘤中呈過表達(dá)現(xiàn)象[17]。有研究[18-19]報(bào)道m(xù)iR-21可促進(jìn)乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移，參與調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡。PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶，Akt是一種蛋白激酶，mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，三者均參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡；活化的PI3K磷酸化Akt，p-Akt水平升高，使Akt處于活化狀態(tài)，在腫瘤中PI3K/Akt信號(hào)通路被異常激活后促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)腫瘤生長，是腫瘤靶向治療的關(guān)鍵分子，同時(shí)mTOR可活化PI3K/Akt信號(hào)通路[20-21]。PTEN作為抑癌基因，可抑制膽管癌細(xì)胞生長并負(fù)調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路；而PTEN表達(dá)被抑制時(shí)，PTEN/PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失衡進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移并抑制凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[22-23]。有研究[24]證明miR-21可調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果一致，據(jù)此推測miR-21可能通過靶向抑制抑癌基因PTEN的表達(dá)，從而誘導(dǎo)PI3K/Akt磷酸化，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)膽管癌的惡性行為。

綜上所述，miR-21基因干擾可有效抑制膽管癌細(xì)胞的惡性行為，具體機(jī)制可能通過靶向調(diào)控PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路信號(hào)傳導(dǎo)，抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步研究miR-21對膽囊癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為提供了一定理論依據(jù)，針對miR-21的小分子抑制劑有望成為潛在的膽管癌治療方案。

倫理學(xué)聲明:本研究于2019年9月27日通過河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)為2019[K]-042。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：施喆負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，研究實(shí)施，數(shù)據(jù)分析以及論文撰寫；周麗媛、趙國棟負(fù)責(zé)資料收集，數(shù)據(jù)分析；孫樹剛、薛亮負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，研究指導(dǎo)，論文修改。