油莎豆SRAP－PCR體系優(yōu)化及遺傳多樣性分析

趙琦琦郭玉靜于夢斐王穎高文偉張斌

(1.新疆農業(yè)大學農學院，新疆 烏魯木齊 830000；2.山東省農業(yè)科學院農作物種質資源研究所，山東 濟南 250100；3.湖南大學研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；4.曲阜師范大學生命科學學院，山東 曲阜 273165)

油莎豆(Cyperus esculentus)是莎草科莎草屬的禾本科作物，原產于非洲及地中海沿岸的干旱和半干旱地區(qū)[1，2]，現(xiàn)廣泛分布于我國的東北、華北及長江流域等中、低緯度地區(qū)，性喜溫暖濕潤氣候，具有生長速度快、生物量大、抗逆性強等優(yōu)點[3]，耐旱、耐澇、耐貧瘠、耐鹽堿[4]。油莎豆塊莖含油量達27%左右[5]，且含有相當豐富的膳食纖維、礦物質(如鉀、磷、鈣、鎂、鋅、銅)、維生素C和E以及人體必需脂肪酸(如肉豆蔻酸、油酸和亞油酸)等[6]。目前，大多數油莎豆研究主要集中在種植技術[7]、油脂提取工藝[8，9]、營養(yǎng)成分[10]及藥用價值分析[11]等方面，對于其種質資源遺傳多樣性的研究相對較少。

SRAP又稱相關序列擴增多態(tài)性(sequencerelated amplified polymorphism，SRAP)，由美國加州大學作物系Li和Quiros于2001年提出[12]，是一種無需任何序列信息即可直接PCR擴增的新型分子標記技術，具有簡便、高共顯性、易分離條帶及測序等優(yōu)點，已被廣泛應用于生物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、比較基因組及品種鑒定等研究[13，14]。目前，SRAP分子標記技術在紫花苜蓿[15]、馬鈴薯[16]、紫錐菊[17]、草果菊[18]、石榴[19]等多種生物的遺傳多樣性及親緣關系分析中取得重大進展，但在探究油莎豆種質資源遺傳多樣性和親緣關系上的應用卻很少。

本研究利用SRAP分子標記技術，采用單因素試驗與正交試驗相結合的方法，基于引物濃度、混合酶體積、模板DNA濃度三因素，探究了SRAPPCR的最佳擴增體系，并對收集到的16份油莎豆種質資源進行遺傳多樣性分析，以探明不同地區(qū)油莎豆種質資源的遺傳距離和親緣關系，以期為油莎豆的種質資源鑒定和遺傳育種提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試16份油莎豆種質資源材料的來源及特性見表1。于2021年4月收集種子，5月底浸種3~5 d，6月初種植于山東省農業(yè)科學院核心區(qū)溫室大棚內底徑26 cm、高23 cm、口徑34 cm的花盆中，盆土為沙質土。每盆播種3穴，每穴1粒種子，穴深4~5 cm。播種后及時澆水，保持土壤濕潤，便于種子萌發(fā)。播種后10 d左右出芽，20 d左右采集油莎豆幼嫩葉片，保存于－80℃超低溫冰箱，用于提取DNA。7~12月進行油莎豆SRAPPCR體系優(yōu)化試驗及相關遺傳多樣性分析。所用引物見表2。

表1 供試16份油莎豆材料的特性及來源

1.2 油莎豆基因組DNA提取與檢測

采用改良的CTAB法提取油莎豆幼嫩葉片基因組DNA，通過微量核酸蛋白濃度測定儀測定DNA濃度。將5μL DNA樣品與1μL 6×Loading buffer混合均勻后點入1%瓊脂糖凝膠，置于100 V電壓下電泳20 min，檢測DNA質量。

1.3 SRAP－PCR擴增體系建立與優(yōu)化

選用條帶清晰且多態(tài)性高的Me2＋Em2引物對，以2號油莎豆種質材料DNA為模板，采用單因素試驗與正交試驗相結合的方法確定SRAPPCR最佳擴增體系。

SRAP－PCR擴增初始體系(15μL):模板DNA 60 ng，2×PCR Master Mix 7.5μL，正反向引物各0.3μL，ddH2O補足至15μL。SRAP－PCR程序:94℃預變性5 min；94℃1 min，35℃1 min，72℃1.5 min，10個循環(huán)；94℃1 min，50℃1 min，72℃1.5 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。用2%瓊脂糖凝膠檢測PCR產物。

1.3.1 單因素試驗設計 影響SRAP－PCR擴增體系的主要因素有引物濃度、混合酶體積、模板DNA含量，所以，基于初始擴增體系，對這3個因素分別設計6個濃度梯度(表2)進行單因素試驗，以確定各因素的基礎濃度范圍。

1.3.2 正交試驗設計 在單因素所選濃度范圍基礎上設計L9(33)正交試驗，共9個處理組合，如表3所示。利用陳璨等[20]的方法，對正交試驗結果進行直觀分析，即:依據擴增條帶的清晰度和穩(wěn)定性對9個組合的PCR擴增結果進行評分，條帶數量最多、清晰度最高的產物記16分，最差的產物記1分；根據各處理組合評分結果，計算各因素各水平的得分均值ki，進而計算該因素的極差R＝kimax－kimin。

表3 油莎豆SRAP－PCR擴增體系的單因素試驗設計

表4 油莎豆SRAP－PCR擴增體系的正交試驗設計

1.4 供試16個油莎豆種質材料的SRAP－PCR遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析所用SRAP引物由上海生工生物工程有限公司合成，設計正向引物6條、反向引物17條(表2)，組合成102對引物。利用上述試驗確定的最佳擴增體系對16份油莎豆材料進行擴增，采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠對PCR產物進行電泳，恒壓200 V，電泳1.0~1.5 h，用銀染法顯影，拍照記錄。

利用人工讀帶的方法統(tǒng)計PCR產物中相同位置清晰的條帶數，有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，轉換為“0/1”數字矩陣。利用NTSYS 2.1計算遺傳一致度和遺傳距離，采用UPGMA法繪制聚類圖，進而分析16份油莎豆材料的親緣關系。

2 結果與分析

2.1 DNA提取質量檢測結果

經過檢測，提取的DNA濃度范圍在141.5~269.7 ng/μL，OD260/OD280值 在1.8以 上，OD260/OD230值在1.96~2.18之間；DNA條帶清晰完整，無降解和拖尾現(xiàn)象(圖1)。綜上，利用改良CTAB法提取的油莎豆DNA質量較好，濃度較高，可用于SRAP－PCR反應。

圖1 16份油莎豆材料的DNA電泳檢測圖譜

2.2 SRAP－PCR擴增體系的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗結果分析 由圖2可知，隨著引物濃度提升，條帶逐漸清晰且多態(tài)性增加，最終根據條帶的擴增情況選擇0.4、0.5、0.6μmol/L三個引物濃度用于正交試驗?；旌厦阁w積在3.0μL時無擴增條帶，在4.5、6.0μL時擴增條帶較模糊，在7.5、9.0、10.5μL時條帶擴增情況最好，所以選擇7.5、9.0、10.5μL用于正交試驗。DNA模板用量為20 ng時擴增條帶較模糊，其他濃度時擴增情況均較好，選擇60、80、100 ng用于正交試驗。

圖2 SRAP－PCR擴增體系單因素試驗結果

2.2.2 油莎豆SRAP－PCR最佳擴增體系的確立

從圖3可看出，處理組合1、7沒有擴增出條帶，處理組合4、8擴增條帶多態(tài)性較少，其余組合擴增條帶較好但清晰度存在差異。正交試驗直觀分析結果(表5)顯示，3個因素對SRAP－PCR反應體系的影響為混合酶體積>模板DNA含量>引物濃度，引物濃度為0.5μmol/L、混合酶體積為10.5 μmol/L、模板DNA含量為80 ng時擴增效果最佳。以此組合作為最佳反應體系，選用不同引物組合，用4號、5號油莎豆材料進行驗證試驗，結果(圖4)表明，不同引物組合在兩種質中均能穩(wěn)定擴增，說明所選體系穩(wěn)定可靠，適用于油莎豆SRAP分子標記研究。

表5 正交試驗直觀分析結果

圖3 SRAP－PCR擴增體系的正交試驗結果

圖4 SRAP－PCR最佳擴增體系在不同品種不同引物穩(wěn)定擴增結果

2.3 16份油莎豆種質材料的遺傳多樣性分析

2.3.1 SRAP－PCR多態(tài)性分析 利用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳從102對引物組合中篩選出30對條帶清晰且多態(tài)性較好的引物組合(表6)，用這30對引物組合共擴增出312個位點，其中多態(tài)性位點289個，平均多態(tài)性比率達92.82%；每對引物擴增出的總位點數在6~17個之間，平均10.40個位點；多態(tài)性位點有5~16個，平均9.63個位點。表明篩選出的30對SRAP分子標記在16份油莎豆材料中所擴增出的條帶都具有較好的多態(tài)性，可用于遺傳多樣性分析。圖5是引物Me1＋Em7和Me2＋Em1對16份油莎豆材料的SRAP擴增結果。

表6 多態(tài)性引物組合擴增結果

圖5 Mel＋Em7和Me2＋Eml對16份油莎豆種質材料的擴增結果

2.3.2 16份油莎豆種質材料的SRAP－PCR遺傳距離與遺傳一致度分析 由表7可知，遺傳一致度范圍為0.60~0.93，遺傳距離范圍為0.07~0.40。8號與11號種質的遺傳一致度最低，親緣關系最遠，遺傳距離最大；來自新疆維吾爾自治區(qū)的14號與來自河北省的15號材料遺傳一致度最高，親緣關系最近，遺傳距離最小。由于14、15號材料的品種特性都為黃色圓粒，結合遺傳一致度結果，推測它們可能為同一品種。綜合分析油莎豆材料的遺傳距離和遺傳一致度，16份油莎豆種質材料間遺傳一致度較高，遺傳背景較狹窄，遺傳差異較小，這可能是因為我國的油莎豆種質是由國外引種而來，引種后地域間種質交流較頻繁，從而造成了油莎豆種質資源具有較高的遺傳一致度。

表7 16份油莎豆材料遺傳距離與遺傳一致度

2.3.3 16份油莎豆種質材料的SRAP－PCR聚類分析 利用UPGMA法對16份油莎豆種質材料進行聚類分析，得到樹狀聚類圖見圖6，可見聚類結果與遺傳一致度和遺傳距離的結果一致。在遺傳相似系數0.824處，可將16份油莎豆種質材料劃分為4個類群，第一、第二、第四類群均包含1份油莎豆種質材料，第三類群包含13份種質材料。在遺傳相似系數0.872處，可進一步將第三類群劃分為5個亞類，其中第1亞類包含河南省的3份油莎豆材料，大部分為圓粒；第2亞類包含吉林省的3份油莎豆材料，均為長粒；第5亞類包含其他4個地區(qū)的5份油莎豆材料，絕大部分為圓粒；來自吉林省的長粒油莎豆7號和來自云南省的長粒油莎豆11號材料單獨歸于一個亞類。表明，油莎豆種質資源的地域來源和品種特性均對聚類結果產生影響。

圖6 16份油莎豆種質材料的UPGMA聚類結果

3 討論

3.1 油莎豆SRAP－PCR體系的優(yōu)化

利用PCR擴增體系獲得條帶清晰、多態(tài)性高的引物組合是研究SRAP分子標記的基礎。本研究利用單因素試驗和正交試驗確定了適合油莎豆的SRAP－PCR最佳擴增體系，即引物為0.5μmol/L，混合酶體積為10.5μL，模板DNA含量為80ng，用ddH2O補足15μL。這與趙永國等[21]確定的油莎豆SRAP優(yōu)化體系(15μL擴增體系包括DNA模板25 ng、Mg2＋1.5 mmol/L、引物濃度1 μmol/L、dNTPs 0.3 mmol/L和Taq酶1 U)不一致，可能與DNA提取方法不同有關，另外，不同廠家的試劑、不同的實驗操作方法也會對SRAPPCR的擴增結果產生不同的影響。

本研究確定了3個因素對油莎豆SRAP－PCR擴增體系的影響大小為混合酶體積>模板DNA含量>引物濃度。但不同植物中SRAP－PCR擴增體系各因素產生的影響不同:戚華沙等[22]在海南油茶SRAP－PCR擴增體系優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，各因素影響大小為引物濃度>dNTPs濃度>TaqDNA聚合酶用量>模板DNA含量；嚴莉等[23]對山桐子SRAP－PCR擴增體系的優(yōu)化結果表明各因素的影響大小為TaqDNA聚合酶用量>Mg2＋濃度>引物濃度>模板DNA濃度>dNTPs濃度。

3.2 SRAP分子標記探究油莎豆遺傳多樣性

SRAP分子標記使用通用引物進行擴增，常被用于分析遺傳多樣性和親緣關系，如沈秀芬等[24]利用SRAP標記分析草菇遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)草菇種質資源在一定程度上出現(xiàn)了地域基因分化；Deng等[25]利用SRAP標記首次對中國特有的10種莪術藥材進行了親緣關系分析。這些研究表明，SRAP分子標記技術可有效區(qū)分種質資源間的遺傳差異，明確其親緣關系。本研究對收集到的16份種質資源進行遺傳多樣性分析，篩選到30對多態(tài)性較好的引物組合，并用其擴增出312個位點，平均多態(tài)性比率為92.82%，說明16份油莎豆種質材料具有豐富的多態(tài)性。聚類分析結果表明，16份油莎豆種質材料的遺傳差異與品種特性及來源均有關。

4 結論

本研究基于引物濃度、混合酶體積和DNA模板含量3個因素，通過單因素試驗和正交試驗，確立了油莎豆SRAP－PCR的最佳擴增體系為:引物0.5μmol/L，混合酶體積10.5μL，模板DNA含量80 ng，用ddH2O補足15μL。利用該體系從102對引物組合中篩選出30對多態(tài)性引物，并用于對16份油莎豆種質材料的遺傳多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)油莎豆種質材料間的遺傳多樣性受品種特性和地域來源的雙重影響。本研究結果可為油莎豆種質資源的品種鑒定和選育等提供一定的參考依據。