微藻生物肥制備及農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究進展

李武陽崔巖孟憲剛羅光宏

(1.蘭州交通大學生物與制藥工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.河西學院/甘肅省微藻技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 張掖 734000)

隨著世界人口不斷增多，糧食需求量也日漸攀升。糧食生產(chǎn)過程中化肥的大量使用雖然極大地增加了糧食供應(yīng)，卻也帶來一系列環(huán)境問題，如土地酸化、重金屬污染、土壤板結(jié)、硝酸鹽污染等，造成土壤肥力和作物質(zhì)量下降[1]。因此，遏制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程對環(huán)境的負面影響，在確保糧食產(chǎn)量的同時減少化肥的使用，成為目前我國亟需解決的問題。國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示，自改革開放至今，我國農(nóng)業(yè)化肥施用量從1 635.4萬噸增長至6 022.6萬噸，增長近3.7倍[2]。由于化肥的過量施用，給環(huán)境安全、食品安全及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等帶來諸多影響，國家“十四五”規(guī)劃中繼續(xù)將化肥減量增效作為農(nóng)業(yè)工作重點，尋找新型的傳統(tǒng)化肥替代品，以保護生態(tài)環(huán)境、實現(xiàn)我國農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展。

生物肥料又稱微生物肥料，是指含有特定微生物活體的制品，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中通過其所含微生物的生命活動促進作物生長，提高產(chǎn)量，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境[3]。生物肥料是一種高效、無污染和無公害的新型肥料，長期使用有助于建立土壤的良性循環(huán)，減少化肥使用，從而獲得更好的經(jīng)濟效應(yīng)和生態(tài)效應(yīng)[4]。在不同類型生物肥料中，基于光合生物的制劑，如微藻生物制劑得到廣泛關(guān)注與應(yīng)用[5，6]。微藻是地球上分布最廣、種類最多的一類形態(tài)微小、結(jié)構(gòu)簡單的光合自養(yǎng)微生物，在能量轉(zhuǎn)化和碳循環(huán)中發(fā)揮著舉足輕重的作用[7]。微藻能將水、二氧化碳和無機營養(yǎng)素(N、P、K等)轉(zhuǎn)化為O2和蛋白質(zhì)、維生素、抗氧化劑和動植物所需的其他營養(yǎng)物質(zhì)[8]。因此，微藻能有效提高土壤肥力，促進植物生長，還可以改良土壤環(huán)境，提高土壤的保水保肥性能，修復(fù)被破壞的土壤，微藻生物肥被廣泛應(yīng)用于大田種植。本文就微藻生物肥的藻種選擇、制備、應(yīng)用方式及作用原理進行綜述，以期為微藻生物肥的規(guī)模制備和農(nóng)業(yè)應(yīng)用提供一定的參考。

1 微藻生物肥的藻種選擇及配方研究

土壤微藻作為土壤微生物的重要組成部分，是指土壤表層、土表下層及與土壤形成、演替和與土壤組成有關(guān)的各種類群的藻類集合群，在沙漠地、鹽堿地、沼澤地、貧瘠地等農(nóng)業(yè)種植艱難的地方均有微藻生存的痕跡[9]。土壤微藻種類主要包括:藍藻門、綠藻門、裸藻門、金藻門和紅藻門[10]，其中藍藻門和綠藻門占據(jù)絕大多數(shù)并在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。文獻報道的土壤藍藻近40個屬，主要包括色球藻屬、平裂藻屬、微囊藻屬、螺旋藻屬、顫藻屬、席藻屬、魚腥藻屬、擬魚腥藻屬和念珠藻屬等。而隸屬于真核藻類的土壤綠藻目前有112屬，主要包括杜氏藻屬、衣藻屬、小球藻屬、盤星藻屬、柵藻屬、團藻屬、四孢藻屬、膠球藻屬、綠球藻屬、集球藻屬、四角藻屬、纖維藻屬、卵囊藻屬、網(wǎng)球藻屬、剛毛藻屬、盤藻屬、羽枝藻屬、鞘藻屬、轉(zhuǎn)板藻屬、新月藻屬、鼓藻屬和水綿屬等[9]。隨著研究的不斷深入，其應(yīng)用范圍也不斷拓展，如用作生物刺激劑、土壤改良劑和環(huán)境監(jiān)測等[10，11]。

在農(nóng)田應(yīng)用中，藻種的選擇對生物肥效的發(fā)揮至關(guān)重要。一種是使用單一的純種藻株來促進作物生長。印度的研究人員于1939年最早在農(nóng)田中接種固氮藍藻來提高作物產(chǎn)量[12]。黎尚豪等[13]研究表明接種固氮藍藻后水稻平均增產(chǎn)超過15%，最高達33%，驗證了固氮藍藻作為晚稻肥源的潛力。Chittapun等[14]研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比添加藍藻后促進水稻幼苗的生長和提高產(chǎn)量。Bumandalai[15]將番茄和黃瓜種子在含藻類菌株的培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)芽，結(jié)果表明在施加小球藻濃度為0.17 g/L和0.25 g/L時，番茄和黃瓜幼苗根長和芽長分別達到最高值，較對照顯著提高。

另一種是采用混合微生物，包括不同微藻品種之間的混合以及微藻和細菌的混合。Taha等[16]研究了兩種小球藻混合對玉米生長參數(shù)和土壤理化性質(zhì)的影響，結(jié)果表明在2.5%藻液濃度下，玉米植株鮮重、干重最大增幅分別為44.3%、65.0%，葉綠素含量增加2.5%，土壤總氮也顯著增加。Renuka等[17]研究了從污水中分離出的天然藻株MC1(由小球藻、藍藻、綠球藻和紅球藻組成)和MC2(由席藻、魚腥藻、擬惠氏藻、飛氏藻和綠藻組成)的接種效果，結(jié)果表明，兩種接種處理的微生物量碳均比肥料對照組提高31.8%~67.0%，75%N＋全劑量PK＋MC1處理組達到最大值；微藻制劑顯著增加小麥根、莖長及根中氮、磷、鉀含量，75%N＋全劑量PK＋MC2處理總氮含量最高，為3.56%；收獲期接種微藻制劑處理的植株干重增加7.4%~33.0%，穗重增加10%；與肥料對照組相比，千粒重增加5.6%~8.4%，這表明將微藻混合接種作為生物肥料方施用，有望節(jié)省25%的氮并提高小麥產(chǎn)量。在實驗室條件下，研究者通過嚴格的環(huán)境條件控制可獲得純凈的藻種，但是在自然生態(tài)環(huán)境中，微藻和細菌不可能完全分離。研究發(fā)現(xiàn)，藻菌的交互作用對一些藻類生長有著積極的作用[18－21]。Rana等[22]利用從小麥根部分離出的菌株P(guān)W5(Providenciasp.)與微藻CW1(Anabaenasp.)、CW2(Calothrixsp.)和CW3(Anabaenasp.)進行田間試驗，結(jié)果表明藻菌肥組(CW1＋PW5)相比于純化肥組，小麥產(chǎn)量提高11%~16%。Zayadan等[23]利用稻田里分離出來的兩株固氮菌(Anabaena variabilis和Nostoc calsicola)與小球藻混合制成藻菌肥ZOB1，在無氮培養(yǎng)中，ZOB1中微藻細胞與氧釋放和二氧化碳固定相關(guān)的非環(huán)轉(zhuǎn)運速率急劇增加，這表明其具有較高的光合活性。稻田施加ZOB1，種子發(fā)芽率較對照提高16%，芽長增加27%。同時進一步研究發(fā)現(xiàn)ZOB1能有效提高水稻對極端條件的抗性和生長速率并保證水稻在缺乏碳和氮素環(huán)境下正常生長。Kumar等[24]將嗜熱菌和兩種藍藻混合研究其對植物生長的影響，表明茴香芽長和根長增加30%~50%，而香菜干重及芽和根的過氧化物酶活性均增加5~10倍，說明藻菌混合對作物生長有明顯的促進作用。

2 微藻生物肥的制備及應(yīng)用方式

雖然微藻生物肥相較于傳統(tǒng)化肥有著較大優(yōu)勢，但農(nóng)作物對肥料的需求量很大，按照傳統(tǒng)的施肥方式需要規(guī)?；囵B(yǎng)獲得大量微藻生物質(zhì)，這就需要培養(yǎng)、收獲、干燥和保藏等一系列設(shè)備和場所，生產(chǎn)成本高。此外，微藻的培養(yǎng)受生態(tài)環(huán)境因素影響很大[25]。因此，需要進一步探究更高效的藻肥制備方式。

2.1 微藻生物肥的制備形態(tài)

目前市場上的微藻肥產(chǎn)品主要為液體制備形態(tài)，其中包含兩大類:一類是基于全藻細胞制備的肥料，其優(yōu)勢在于微藻細胞可存活且具有活性；另一類是基于提取微藻活性物質(zhì)制備的肥料，目的是挖掘功能獨特的成分。微藻含有大量農(nóng)作物生長必需的生物活性物質(zhì)，包括藻多糖及其衍生物(寡糖)、特殊脂肪酸、氨基酸、小分子肽、天然色素、礦物質(zhì)、植物激素、微量元素、抗生素、酚類、萜類等[26，27]。國內(nèi)液體藻肥的生產(chǎn)廠家主要有地福來和阿爾格，其生產(chǎn)的活性藻液產(chǎn)品對作物生長有很好的促進作用。國外在這方面的研究起步早，技術(shù)較為成熟，代表的企業(yè)有西班牙的AlgaEnergy公司，該公司于2015年底推出了世界第一批基于微藻的生物刺激素產(chǎn)品，用于提高作物栽培效率。

2.2 微藻生物肥的應(yīng)用方式

微藻生物肥的農(nóng)田應(yīng)用方式主要有生物質(zhì)直接投放和載體添加兩種方式。前者將生物質(zhì)按照一定比例用水稀釋后，通過澆灌或者噴淋的方式作用于植物，通過微藻自身代謝活動促進植物生長。這種方式成本低、簡單易行，但考驗藻種在不同環(huán)境條件下的繁殖能力。后者是通過不同載體將微藻固定，以增強細胞在不同環(huán)境下的適應(yīng)能力，目前應(yīng)用的載體類型包括小麥秸稈、稻草堆肥、蛭石、粘土、動物廢棄物和農(nóng)業(yè)廢棄物等[28]。Prasanna等[29]利用蛭石作為稻田藍藻增殖的有效載體，通過測定土壤相關(guān)指標，發(fā)現(xiàn)土壤微生物量碳和腐殖質(zhì)含量有顯著提高。Dhar等[30]評估了新型藍藻生物肥(載體為麥秸和漂白土)制劑與傳統(tǒng)土壤基BGA生物肥料對水稻產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)，以麥稈和漂白土為載體添加75%氮肥，可獲得最高的籽粒產(chǎn)量。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，新材料的發(fā)明和應(yīng)用將大大提高微藻肥料的效率。

3 微藻生物肥的作用效果及原理

近年來化肥的大量施用雖然增加了作物產(chǎn)量，但也造成一系列環(huán)境問題，某些化學元素過分積累，殘留于土壤，造成土壤結(jié)構(gòu)板結(jié)；進入水體使得水體富營養(yǎng)化，形成水華或赤潮；經(jīng)土壤反硝化作用形成N2O進入大氣，破壞臭氧層，危害人類健康[31，32]。土壤中的微藻可以通過微生物代謝活動來提高土壤肥力、分泌植物生長刺激素、提升作物抗病蟲害能力，進而提高作物產(chǎn)量，可以有效減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中化肥的使用[33]。

3.1 提高土壤肥力

3.1.1 固氮作用 土壤氮含量極大地影響著作物產(chǎn)量，同時也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的較大投入，但約有一半化肥(如硫酸銨、尿素等)不能被作物有效利用而流失到環(huán)境中[34]。固氮藍藻是地球上年固氮量僅次于豆科植物和根瘤菌共生結(jié)合體的固氮生物，是重要的可利用生物氮肥資源。Pereira等[35]研發(fā)出一款含固氮藍藻的生物肥，發(fā)現(xiàn)水稻田接種固氮藍藻可以使得化肥施用減少至50%(N 50 kg/hm2)，并且保障產(chǎn)量維持不變。Valiente等[36]通過15N標記法研究藍藻對N的固定，結(jié)果表明土壤氮是水稻氮的主要來源，而施加的氮肥只有8%~14%被水稻吸收，土壤－植物體系對硫酸銨的吸收率低于50%。土壤－植物系統(tǒng)對標記藍藻氮的吸收率高于化肥組，20天后，仍能在水稻體內(nèi)檢測到藍藻所固定的氮。這說明藍藻肥的固氮效率和持久力遠高于普通氮肥?？椎轮萚37]研究固氮魚腥藻在小麥和番茄上的肥效，結(jié)果表明，90天后，施用藻肥的土壤含氮量提高4.16倍，維持在0.075%左右；同時研究發(fā)現(xiàn)，固氮魚腥藻肥初施階段土壤氮含量很低，僅為0.023%，之后逐漸增加，30天時土壤氮含量達到0.066%，之后增速變緩，60天達到平衡點，氮含量為0.073%。這說明固氮魚腥藻在土壤中能夠持續(xù)固定空氣中的氮，有望開發(fā)成為環(huán)境友好、肥效持久的生物肥料。

3.1.2 解磷作用 磷是作物生長過程中所必需的主要營養(yǎng)元素之一，直接影響著作物產(chǎn)量和品質(zhì)[38]。土壤中磷的形態(tài)可分為有機態(tài)磷和無機態(tài)磷，后者包括礦物態(tài)磷、吸附態(tài)磷和水溶性磷。其中，水溶性磷是最有效的部分，是可供植物利用的主要形態(tài)，但在土壤中含量較少，而前者卻不能被植物直接吸收利用，只能通過礦化分解間接為植物提供磷素[39]。所以需要向土壤直接補充化學磷肥，但只有部分化肥能被作物吸收，大量磷因侵蝕和淋溶而流失，污染地下水，造成地表水富營養(yǎng)化[40]。Bose等[41]研究發(fā)現(xiàn)微藻在生長過程中釋放的酸類化合物可以通過溶解含鈣磷化物來釋放磷。Mazhar等[42]利用從稻田中分離的藍藻菌株作為生物肥料，測試其對磷酸鹽的溶解能力，結(jié)果顯示選定的兩種藍藻菌株SM－14和SM－15都能夠很好地溶解磷酸鹽。微藻還能將土壤中有機磷轉(zhuǎn)化為無機磷。Ghyoot等[43]研究了磷酸鹽限制下球囊藻中堿性磷酸酶活性及微藻將有機磷轉(zhuǎn)化為無機磷的機制，表明在無機磷缺乏時，微藻可以利用各種形式的有機磷并轉(zhuǎn)化為無機磷進而提高土壤磷含量。

3.1.3 固碳作用 微藻是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中有機物的重要來源。微藻生長周期短、光合效率高，其CO2固定效率為一般陸生植物的10~50倍[44]。Karthikeyan等[45]從小麥根系分離出3株微藻[Calothrix ghosei(K1)，Hapalosiphon intricatus(K2)andNostocsp.(K3)]，將其按照一定比例制作成生物肥施入小麥田中，結(jié)果表明土壤有機碳含量比未接種的對照組高兩倍以上，比全劑量化肥處理高80.58%，這說明微藻能有效增加土壤中有機碳濃度。Nisha等[46]采用盆栽試驗研究藍藻對半干旱土壤生產(chǎn)力的影響，將用3株藍藻配組的有機肥應(yīng)用于缺乏有機物的半干旱土壤中(有機碳總TOC 0.34%)，在缺水(土壤水分6%~12%)條件下，施后90~180天時TOC含量增加50%，說明微藻在極端條件下也能發(fā)揮很好的生物固碳能力。凌麗俐[47]研究發(fā)現(xiàn)，在光合作用下土壤藻類數(shù)量變化與有機質(zhì)的相關(guān)性十分密切，達到極顯著水平，表明藻類對土壤有機質(zhì)的提高有明顯影響。

3.2 分泌生長刺激素

微藻可以通過分泌生長因子來促進植物的生長和發(fā)育，這些生長因子包括植物激素、氨基酸、維生素(如維生素B12和維生素H)、多糖和多肽[26，48]。它們通過促進植物的代謝反應(yīng)，如呼吸作用、光合作用、核酸合成、葉綠素產(chǎn)生和離子吸收等提高種子發(fā)芽率和植物生長指標(增加枝條和根的長度，增加葉面積和營養(yǎng)成分含量)[49]。El Arroussi等[50]研究從杜氏鹽藻提取的脯氨酸、類胡蘿卜素和胞外多糖對鹽脅迫條件下小麥幼苗萌發(fā)和生長的影響，結(jié)果表明，從微藻中提取的胞外多糖對小麥種子的萌發(fā)和幼苗生長有重要的刺激作用；與空白對照組相比，鹽脅迫濃度3 g/L和6 g/L條件下小麥種子的萌發(fā)率分別提高96%和83%，根長提高1.33倍和4.44倍，胚芽鞘長提高1.05倍和7.50倍。這表明杜氏鹽藻提取物，特別是胞外多糖提取物可以緩解植物鹽脅迫，并提高作物產(chǎn)量。Ramya等[51]制備了不同濃度的裸藻液體提取液，作為葉面肥噴施于盆栽茄子幼苗，表明其可有效提高茄子的一些生理生化指標，株高提高30%，植株干重提高25%，葉面積提高61%，含水率提高56%；葉綠素含量提高77%，蛋白含量提高38%，還原糖含量提高201%，抗壞血酸含量提高36%。El Arroussi等[52]將柏氏螺旋藻總多糖提取物(TPE)應(yīng)用于番茄和辣椒中，當TPE處理濃度為3 g/L時番茄和辣椒主莖長分別增加20%和30%，葉面積增加57%和100%，葉片數(shù)增加33%和50%；TPE處理對番茄根重的影響較辣椒(提高67%)更為明顯(提高2.30倍)。

3.3 提升作物抗病蟲害能力

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化學農(nóng)藥的大量使用使得農(nóng)藥殘留在食物鏈中不斷積累，生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞[53]。為此需要探索可持續(xù)的病原體控制替代方法，防止植物病害傳播，以建立高效和可持續(xù)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式，減少農(nóng)業(yè)中的化學農(nóng)藥投入[54]。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)，微藻提取物對植物致病菌和真菌具有抗菌作用，而且藍藻代謝物能夠通過破壞線蟲的孵化過程來達到抑制線蟲生長的效果。

3.3.1 抑制病原菌 研究發(fā)現(xiàn)藍藻通過產(chǎn)生某種抗菌化合物，對病菌細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能進行破壞并降低相關(guān)酶的活性和抑制蛋白質(zhì)合成從而達到抑制病原菌的效果[55]。Prasanna等[56]評估了70種微藻對一組植物致病菌的生物滅活性，其中35種微藻產(chǎn)生了抑制區(qū)，這些微藻產(chǎn)生的水解酶、殼聚糖酶和具有殺菌活性的木聚糖酶對菌株產(chǎn)生了抑制作用。Ordog等[57]對174株綠藻和23株藍藻的抗菌能力進行評估，篩選出10株具有較高抗菌活性的綠藻菌株。經(jīng)驗證，這些藻株對革蘭氏陽性菌(10種中有9種)和革蘭氏陰性菌(10種中有7種)均表現(xiàn)出較高的抗菌活性。Chaudhary等[58]研究了兩種藍藻(RPAN59和RPAN69)的復(fù)合菌劑對選定的植物病原真菌(ITCC95)、根菌(ITCC4578)、鐮刀菌(ITCC4223、ITCC4998)在番茄幼苗上的抑制能力，表明患病植株在施加微藻復(fù)合菌劑后一些生長指標有顯著提高，比化學農(nóng)藥處理植株鮮重提高10%~15%，株高增加40%~50%。

3.3.2 抗蟲害 微藻能夠通過產(chǎn)生肽毒素和殺線蟲化合物來有效減少線蟲等植物害蟲的數(shù)量[59]。Khan等[60]在溫室條件下，將番茄幼苗用不同濃度的微藻(0.2%、0.5%、1%、2%、10%、50%和100%)培養(yǎng)濾液浸泡30 min，與對照相比，浸根處理的效果隨著濃度的增加而增加，最高濃度處理線蟲數(shù)量減少可達97.5%。Holajjer等[54]研究藍藻對線蟲的殺蟲活性，發(fā)現(xiàn)藍藻提取物使得線蟲幼體(J2)的最大不動率達到94.2%，死亡率達到29.3%，藍藻在土壤中的應(yīng)用可以降低線蟲感染，提高作物產(chǎn)量。Khan等[61]在盆栽試驗中加入藍藻粉，當濃度達到0.8%(w/w)時，與對照組相比，土壤根系中的線蟲數(shù)量減少97.6%。

4 展望

微藻已被證明有助于提高土壤肥力、促進作物生長以及提升作物抗病蟲害能力，但目前技術(shù)的不夠成熟和研究的不夠深入限制了微藻生物肥的廣泛使用。在實現(xiàn)其規(guī)模應(yīng)用之前還需解決以下問題:(1)目前可用于工業(yè)化生產(chǎn)的藻種較少，未來需進一步篩選優(yōu)質(zhì)藻種，期望能夠在獲得生物質(zhì)的同時，利用其固碳能力實現(xiàn)零碳生產(chǎn)模式。(2)微藻生物質(zhì)生產(chǎn)和加工的成本導致微藻生物肥、生物刺激劑和生物殺蟲劑等產(chǎn)品的成本增加，其價格無法與化學產(chǎn)品在市場上競爭。因此，目前微藻生物質(zhì)通常在經(jīng)濟價值較高的產(chǎn)品(保健品、制藥和化妝品行業(yè))中應(yīng)用較為廣泛，降低微藻生物質(zhì)的獲取成本是需要攻克的方向之一。(3)研究微藻生物肥在不同作物品種和不同土壤類型中的作用效果，開發(fā)適合我國主要作物和土壤現(xiàn)狀的產(chǎn)品。(4)目前，關(guān)于生物肥活性保護技術(shù)研究較少，菌體的活性保持時間限制了肥料的使用效果，因此需要對生產(chǎn)工藝進一步優(yōu)化和提升，獲得性能穩(wěn)定的產(chǎn)品。(5)微藻生物肥的肥效已在實驗室和大田應(yīng)用中獲得廣泛驗證，但對微藻及其提取物、植物和環(huán)境之間的相互作用仍然知之甚少，未來需要在作用機制方面進行更加深入的研究。