鳥分枝桿菌MAV_2927基因編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

李祥芳，丁壽鵬，高婧華，吳利先

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）是除麻風(fēng)分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，Mtb）復(fù)合群以外的分枝桿菌，而鳥分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium aviumcomplex，MAC）是NTM中生長緩慢的一類菌群。目前已知有200多種NTM，其中MAC是革蘭氏陽性、抗酸、需氧桿菌，廣泛存在于土壤、水、灰塵等自然環(huán)境中〔1〕，絕大多數(shù)為腐物寄生菌。近年來隨著HIV病毒的傳播，NTM（特別是MAC）的感染人數(shù)逐年增多，而且MAC對治療Mtb的藥物大部分都耐藥，導(dǎo)致MAC病防治非常困難，因此MAC感染致病機制的研究對臨床治療顯得尤為重要。

鳥分枝桿菌（Mycobacterium avium，MAV）基因組具有相似的PPE（Pro-Pro-Glu）和PE（Pro-Glu）基因家族，其在分枝桿菌致病機制中起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)MAV_2927基因?qū)儆赑E家族，緊鄰PPE25_MAV（MAV_2928），其 中MAV_2928、MAV_2927和MAV_2926是在一個多順反子轉(zhuǎn)錄本上產(chǎn)生的，它們形成了一個異二聚體〔2〕。研究表明PPE基因MAV_2928可以促進MAC在細胞內(nèi)的存活，可預(yù)測MAV_2927蛋白質(zhì)，也可以影響MAC在細胞內(nèi)的存活并致病。本研究利用生物信息學(xué)對MAV_2927基因編碼蛋白質(zhì)進行結(jié)構(gòu)功能預(yù)測，為研究MAC的致病機制和防治提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源 使用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）數(shù)據(jù)庫和Uniprot（https：//www.uniprot.org/）蛋白數(shù)據(jù)庫對鳥分枝桿菌104菌株MAV_2927進行序列分析，獲取MAV_2927蛋白質(zhì)的基因序列和氨基酸序列。

1.2 生物信息學(xué)分析

1.2.1 MAV_2927蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 使用在線軟件Expasy（https：//web.expasy.org/contact）的Prot-Param toll對MAV_2927蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（分子式、不穩(wěn)定指數(shù)、氨基酸數(shù)量、分子量、氨基酸組成、等電點和正、負電荷的殘基總數(shù)等）進行預(yù)測分析。

1.2.2 MAV_2927蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 使用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線軟件 和SWISSMODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）蛋白分析軟件在線分析MAV_2927蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。

1.2.3 MAV_2927蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和信號肽預(yù)測運用TMHMM Server V 2.0（https：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和SignalP 4.0 server（https：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0）在線軟件對MAV_2927蛋白質(zhì)進行跨膜區(qū)和信號肽預(yù)測。

1.2.4 MAV_2927蛋白質(zhì)磷酸化位點及親疏水性分析 使用NetPhos 3.1 servera（https：//www.cb s.dtu.dk/services/NetPhos/）和ExPASy ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）在線軟件預(yù)測MAV_2927蛋白質(zhì)的磷酸化位點及親疏水性。

1.2.5 MAV_2927蛋白質(zhì)T細胞、B細胞抗原表位預(yù)測 采用BepiPred 1.0 server（https：//www.iedb.org/home_v3.php）和NCBI-Conserved domains在線軟件預(yù)測MAV_2927蛋白質(zhì)的B細胞抗原表位，采用SYFPEITHI（https：//www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）軟件在線預(yù)測MAV_2927蛋白質(zhì)的T細胞抗原表位。

2 結(jié)果

2.1 基因及編碼蛋白質(zhì)基本信息 使用蛋白數(shù)據(jù)庫Uniprot分析鳥分枝桿菌MAV_2927基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)為43個，蛋白質(zhì)名稱為PE domain-containing protein，登錄號為ABK69185。

2.2 MAV-2927蛋白質(zhì)序列及其理化性質(zhì)MAV_2927蛋白質(zhì)分子量為4.213 kDa，等電點4.72，分子式：C183H284N48O62S2，總原子數(shù)579個。負電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）3個，正電荷殘基總數(shù)為0，消光系數(shù)ε280=1 490 m-1。半衰期t1/2=30 h（哺乳動物網(wǎng)織紅細胞，體外），t1/2>20 h（酵母，體內(nèi)），t1/2>10 h（大腸埃希菌，體內(nèi)）。不穩(wěn)定指數(shù)（instability index，II）38.57，當(dāng)II<40時為穩(wěn)定蛋白質(zhì)，II≥40則為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。脂肪指數(shù)75.35，親水性總平均值（grand average of hydropathicity，GRAVY）為0.595，說明該蛋白質(zhì)為疏水性蛋白質(zhì)。MAV_2927基因編碼蛋白質(zhì)含43個氨基酸，丙氨酸占30.2%，天冬酰胺占2.3%，谷氨酸占7.0%，甘氨酸占4.7%，組氨酸占4.7%，亮氨酸占4.7%，甲硫氨酸占4.7%，苯丙氨酸占4.7%，脯氨酸占2.3%，絲氨酸占11.6%，蘇氨酸占11.6%，酪氨酸占2.3%，纈氨酸占9.2%。

2.3 MAV_2927蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 采用SOPMA軟件預(yù)測MAV_2927蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋（Hb）26個（占60.5%），β-折疊（Ee）8個（占18.6%），β-轉(zhuǎn)角（Tt）1個（占2.3%），無規(guī)則卷曲（Cc）8個（占18.6%）。見圖1。通過SWISS-MODEL軟件構(gòu)建MAV_2927蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型。見圖2。SWISSMODEL中含有對模型的GMQE和QMEAN評分，該模型GMQE評分為0.30，QMEAN評分為-2.66，一致性較好。

圖1 MAV_2927蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖2 MAV_2927蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4 MAV_2927蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和信號肽預(yù)測 應(yīng)用TMHMM Server V 2.0軟件預(yù)測MAV_2927蛋白質(zhì)跨膜螺旋數(shù)為0。見圖3?？缒ぐ被釘?shù)為0.789 76（>18表示很可能為跨膜蛋白質(zhì)），可能在胞質(zhì)內(nèi)的概率為0.214 62，表明MAV_2927蛋白質(zhì)可能無跨膜區(qū)，即為非跨膜區(qū)蛋白質(zhì)（膜內(nèi)蛋白質(zhì)）。應(yīng)用SignalP 4.0 server軟件預(yù)測MAV_2927蛋白質(zhì)43個氨基酸的信號肽，結(jié)果顯示MAV_2927蛋白質(zhì)D值為0.336，閾值0.450，無信號肽。見圖4。

圖3 MAV_2927蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析

圖4 MAV_2927蛋白質(zhì)信號肽分析

2.5 MAV_2927蛋白質(zhì)磷酸化位點 采用NetPhos 3.1 servera軟件預(yù)測MAV_2927蛋白質(zhì)有7個磷酸化位點，其中磷酸化絲氨酸位點3個（氨基酸位置分別為25、28、30），磷酸化蘇氨酸位點3個（氨基酸位置分別為6、26、34），磷酸化酪氨酸位點1個（氨基酸位置為31）。見圖5。

圖5 MAV_2927蛋白質(zhì)磷酸化位點預(yù)測

2.6 MAV_2927蛋白質(zhì)抗原表位 采用BepiPred 1.0 server在線軟件分析MAV_2927蛋白質(zhì)，得到多個可能B細胞抗原表位，其中得分＞0.35（臨界參考值0.35）的可能B細胞抗原表位有23個，得分>0.80的可能B細胞抗原表位9個。見表1。采用SYFPEITHI軟件預(yù)測得到多個可能T細胞抗原表位，主要組織相容性抗原類型為RT1.AI。見表2。

表1 MAV_2927蛋白質(zhì)B細胞抗原表位預(yù)測

表2 MAV_2927蛋白質(zhì)T細胞抗原表位預(yù)測

2.7 MAV_2927蛋白質(zhì)親水性 采用ExPASY ProtScale軟件預(yù)測MAV_2927蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)，其氨基酸殘基分布見圖6。氨基酸親水性得分最高分為1.6，最低分為-0.5（標(biāo)度值>0的區(qū)域比標(biāo)度值<0的較為密集），GRAVY為0.595（GRAVY>0為疏水性蛋白質(zhì)；GRAVY<0為親水性蛋白質(zhì)），所以預(yù)測該蛋白質(zhì)可能為疏水性蛋白質(zhì)。

圖6 MAV_2927蛋白質(zhì)的親水性分析

3 討論

MAC是一種生長緩慢的分枝桿菌，是一種機會性細胞內(nèi)致病菌，能夠在巨噬細胞中存活并抵抗宿主的免疫機制，這種機制可能是其細胞壁中存在的糖肽類物質(zhì)發(fā)揮作用〔3〕。除肺部疾病外，MAV還可侵入淋巴結(jié)、骨骼、關(guān)節(jié)、皮膚和軟組織，并可在全身擴散。如果不治療或治療不當(dāng)，感染可能導(dǎo)致嚴重疾病甚至死亡，尤其是在免疫功能低下的人群中。感染的癥狀是非特異性的，包括不適、咳嗽、發(fā)燒、虛弱、呼吸困難和咯血〔4〕。神經(jīng)纖維素2蛋白（neurofibromin 2，NF2）是一種含有頂端蛋白的結(jié)構(gòu)域，充當(dāng)核心Hpo/Wts激酶級聯(lián)的上游調(diào)節(jié)器。有研究發(fā)現(xiàn)MAV可通過阻止細胞凋亡和影響細胞增殖而在巨噬細胞內(nèi)存活，其機制是干擾這些核心蛋白NF2的正常表達〔5〕。van der Woude等〔6〕觀察到巨噬細胞吞噬體分泌的PknG激酶可有效抑制吞噬體-溶酶體融合，從而提高MAV的毒力和在巨噬細胞中的存活率。Mtb基因組測序于1998年完成，發(fā)現(xiàn)了2個主要的富含甘氨酸的蛋白質(zhì)家族PE和PPE，其編碼基因約占整個Mtb基因組的10%〔7〕。PE/PPE家族蛋白質(zhì)是分枝桿菌特有的分子，以其N端保守的PE（Pro-Glu）和PPE（Pro-Pro-Glu）結(jié)構(gòu)域命名，這2個基因在Mtb基因組的染色體上非常接近〔8〕。PPE和PE基因家族編碼大量功能未知的蛋白質(zhì)，MAC基因組中具有相似的PPE和PE基因家族〔9〕。由MAC表達的一種PE蛋白，與Mtb中發(fā)現(xiàn)的PE 18和PE 19的氨基酸序列有89.9%的同源性。且基因組搜索表明，MAC可能含有6個PE基因，而Mtb中有38個PE基因〔10〕，無PE_PGRS（PE_polymorphic GC-rich sequences）基因。PE抗原也在感染MAC的抗原呈遞細胞中表達，感染或接種含PE蛋白細菌可引起與MAV MaPE蛋白交叉反應(yīng)的免疫反應(yīng)〔11〕。PE/PPE蛋白是免疫調(diào)節(jié)蛋白，可能與通過破壞Th1與Th2之間的平衡來建立或維持感染有關(guān)，從而促進Mtb存活〔8〕。

Mtb PE家族基因編碼的細胞表面蛋白以前被報道與毒力和宿主的相互作用有關(guān)，可能是介導(dǎo)細菌逃避宿主免疫攻擊的關(guān)鍵因素〔12〕。而MAV_2927蛋白質(zhì)全長同源物存在于Mtb Rv1788（PE18）中〔2〕，可預(yù)測MAV_2927蛋白質(zhì)也與MAC的毒力和宿主免疫相關(guān)，且PPE25_MAV轉(zhuǎn)錄在一個多順反子轉(zhuǎn)錄本上，該轉(zhuǎn)錄本包含MAV_2927蛋白質(zhì)，表明MAV_2927蛋白質(zhì)的功能可能轉(zhuǎn)移到了PPE25-MAV。經(jīng)Uniprot分析，Rv1788氨基酸序列長度99，MAV_2927蛋白質(zhì)（43 aa）比Mtb同系物Rv1788（99 aa）少56個殘基，其三級結(jié)構(gòu)比MAV_2927蛋白質(zhì)的復(fù)雜，相對分子量9.552 kDa屬于大分子物質(zhì)，含PE_PGRS基因。MAC可以主動破壞正常的宿主防御反應(yīng)，抑制巨噬細胞吞噬體的酸化和成熟〔13〕，還可調(diào)節(jié)宿主細胞凋亡和壞死過程，以促進細菌在巨噬細胞中的逃逸和擴散〔14〕。除此之外，MAV_2927蛋白質(zhì)中預(yù)測的α-螺旋結(jié)構(gòu)已被證明對PE蛋白與其配位及PPE蛋白的接合和相互作用有重要意義〔15〕。

本研究采用生物信息學(xué)方法預(yù)測的MAV_2927蛋白質(zhì)可能為非跨膜區(qū)蛋白質(zhì)（膜內(nèi)蛋白質(zhì)），可能存在于細胞質(zhì)基質(zhì)且該蛋白質(zhì)是穩(wěn)定蛋白質(zhì)，無跨膜結(jié)構(gòu)、無信號肽。對其疏水性進行了預(yù)測，它的氨基酸中丙氨酸數(shù)量最多，與其是疏水性蛋白質(zhì)相符。MAV_2927蛋白質(zhì)具有多個磷酸化位點，表明它可能參與了細胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。眾所周知，α-螺旋結(jié)構(gòu)在DNA模板中起著重要的作用，本研究預(yù)測MAV_2927蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)占60.5%，推測該蛋白質(zhì)可能相對保守。除此之外，MAV_2927蛋白質(zhì)具有多個抗原表位，可推測該蛋白質(zhì)具有一定的免疫原性，說明它可引起機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)且具有致病性。雖然生物信息學(xué)在預(yù)測基因含量和蛋白質(zhì)對菌體毒力方面的影響有局限性，但確定蛋白質(zhì)致病性的基礎(chǔ)是發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)與其他相關(guān)蛋白質(zhì)之間的相似點和不同點。目前，鳥-胞內(nèi)分枝桿菌基因組已經(jīng)測序完成，這讓我們得以重新審視PE和PPE蛋白質(zhì)家族的亞家族成員和MAC之間的關(guān)系和進化史，以進一步確定MAC中PE蛋白的致病特征，這對MAC的致病機制研究及其診斷有重要意義。