尿素解離試驗(yàn)在減少新型冠狀病毒抗體假陽(yáng)性中的應(yīng)用價(jià)值

李小鳳，王 靜，張海燕，薛成軍，付 曉，羅 明，夏 云

WHO于2020年1月30日宣布新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019, COVID-19）疫情為國(guó)際關(guān)注的全球突發(fā)公共衛(wèi)生事件，并于2020年2月28日將其風(fēng)險(xiǎn)程度評(píng)估從“高”上調(diào)至“非常高”[1]。此后，COVID-19在全球范圍內(nèi)出現(xiàn)大流行。目前，COVID-19的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括核酸檢測(cè)、抗體檢測(cè)和抗原檢測(cè)3種?；诜崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）技術(shù)的核酸檢測(cè)方法是COVID-19診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[2]，但采樣部位、采樣方式和病毒載量都會(huì)顯著影響核酸檢測(cè)的敏感度[3]。血清學(xué)試驗(yàn)可有效檢測(cè)宿主針對(duì)病毒的免疫反應(yīng)[4]，在一定程度上彌補(bǔ)核酸檢測(cè)的不足，但該方法往往受到其他冠狀病毒抗體或自身非特異性抗體潛在交叉反應(yīng)的限制[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，自身免疫性疾?。╝utoimmune diseases, ADs）患者血清的新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）抗體檢測(cè)存在假陽(yáng)性[6]。血清抗體檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果通常是由于自身抗體、嗜異性抗體或血清中的補(bǔ)體等與檢測(cè)試劑中的抗原非特異性結(jié)合所致。已有研究發(fā)現(xiàn)，尿素可作為抗原-抗體反應(yīng)非特異性結(jié)合的解離物質(zhì)[7]。本研究采用尿素對(duì)ADs患者的血清進(jìn)行解離，評(píng)價(jià)其減少SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體假陽(yáng)性結(jié)果的效果，同時(shí)探討尿素解離試驗(yàn)對(duì)COVID-19確診患者SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測(cè)結(jié)果的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2020 年2月1日—2021年2月28日在重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心和重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的350例患者和健康體檢者作為研究對(duì)象，其中ADs患者（自免組）200例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)定義的ADs診斷標(biāo)準(zhǔn)[8-11]；②自身抗體陽(yáng)性；③依據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》[12]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，RT-PCR檢測(cè)SARS-CoV-2核酸為陰性，無(wú)COVID-19的流行病學(xué)接觸史、影像學(xué)及臨床實(shí)驗(yàn)室指征。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他冠狀病毒感染；②既往感染SARS-CoV-2或接種SARS-CoV-2疫苗的患者。COVID-19患者（COVID-19組）100例，其中發(fā)病時(shí)間≤7 d 35例、8～14 d 31例、≥15 d 34例，納入標(biāo)準(zhǔn)：RT-PCR檢測(cè)SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他冠狀病毒感染；②自身抗體陽(yáng)性患者。健康體檢者（健康組）50例，所有健康體檢者RT-PCR 檢測(cè)SARS-CoV-2核酸均為陰性。本研究經(jīng)重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施（批件號(hào)：2020-079-KY）。

1.2 試劑和儀器 膠體金免疫層析法SARS-CoV-2 IgM/IgG 抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)于英諾特生物科技有限公司?；瘜W(xué)發(fā)光特異性SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測(cè)試劑盒和化學(xué)發(fā)光免疫分析儀均來(lái)自博奧塞斯公司?？购丝贵w譜（IgG）檢測(cè)試劑盒（歐蒙印跡法）購(gòu)自德國(guó)歐蒙有限公司。SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自達(dá)安生物科技股份有限公司。尿素購(gòu)自sigma公司。

1.3 SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測(cè) 采集自免組、COVID-19組與健康組靜脈血，3500 rpm/min 離心10 min 后，取上層血清置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。采用膠體金免疫層析法檢測(cè)3組的SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體，具體操作如下：向樣本孔中加10 μl血清樣本和2滴樣本稀釋劑，并在15～20 min內(nèi)觀察T線（測(cè)試線）和C線（質(zhì)控線）中的結(jié)果，陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：T線和C線位置同時(shí)出現(xiàn)肉眼可見的顯色條帶；弱陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：C線位置出現(xiàn)肉眼可見的顯色條帶比T線位置出現(xiàn)的顯色條帶顯著清晰；陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)：僅C線位置出現(xiàn)出現(xiàn)肉眼可見的顯色條帶。COVID-19組中膠體金免疫層析法SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體結(jié)果為弱陽(yáng)性的標(biāo)本，采用化學(xué)發(fā)光法復(fù)測(cè)SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體。SARS-CoV-2核酸檢測(cè)采用RT-PCR技術(shù)。所有的檢測(cè)均嚴(yán)格按照試劑和儀器說(shuō)明書操作。

1.4 尿素解離試驗(yàn) 稱取一定質(zhì)量尿素，用磷酸鹽緩沖液溶解配制不同濃度的尿素溶液（0、2、4、6、8、10 mol/L）待使用。所有SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體陽(yáng)性標(biāo)本均進(jìn)行膠體金免疫層析法尿素解離試驗(yàn)，其中自免組SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體陽(yáng)性標(biāo)本采用不同濃度尿素進(jìn)行解離，COVID-19組SARS-CoV-2 IgM/IgG陽(yáng)性抗體標(biāo)本采用6 mol/L尿素進(jìn)行解離。COVID-19組中膠體金免疫層析法SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體結(jié)果為弱陽(yáng)性的標(biāo)本采用化學(xué)發(fā)光法復(fù)測(cè)后，進(jìn)行尿素解離試驗(yàn)，尿素濃度采用6 mol/L。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料呈正態(tài)分布，采用±s 表示，組間比較采用F檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用四格表χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基本情況 自免組患者200例，包含50例系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus, SLE）患者、50例干燥綜合征（sjogren's syndrome, SS）患者、50例自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis, AIH）患者、50例混合性結(jié)締組織?。╩ixed connective tissue disease, MCTD）患者。其中男性22例，女性178例，年齡范圍19～87歲，平均年齡為（46.84±14.62）歲。COVID-19組患者100例，其中男性15例，女性85例，年齡范圍23～78歲，平均年齡為（43.28±15.49）歲。健康組50例，其中男性5例，女性45例，年齡范圍17～78歲，平均年齡為（43.20±15.90）歲，各組之間性別和年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 3組患者基本資料比較（±s）Table 1 Comparison of basic data in 3 groups (±s)

表1 3組患者基本資料比較（±s）Table 1 Comparison of basic data in 3 groups (±s)

注：*. F值

項(xiàng)目 COVID-19組(n=100) 自免組(n=200) 健康組(n=50) F/χ2值 P值年齡 (歲 ) 43.28±15.49 46.84±14.62 43.20±15.90 0.229* 0.797性別[例(%)]1.231 0.540男15(15) 22(11) 5(10)女85(85) 178(89） 45(90)

2.2 健康組和自免組SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測(cè)結(jié)果 健康組SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體特異度均為100%（50/50）。自免組SARS-CoV-2 IgM 和IgG抗體特異度分別為100%（200/200）和97%（194/200），其中6例SARS-CoV-2 IgG抗體陽(yáng)性患者中，SLE患者3例，SS、MCTD和AIH患者各1例，且每例患者均存在抗核抗體（antinuclear antibody, ANA），其中2例患者僅ANA陽(yáng)性，另外4例存在3種及以上自身抗體。

2.3 COVID-19組SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測(cè)結(jié)果 膠體金免疫層析法檢測(cè)COVID-19組SARSCoV-2 IgM/IgG抗體的敏感度分別為56%（56/100）和77%（77/100），IgM/IgG抗體總敏感度為85%（85/100）。

2.4 尿素解離試驗(yàn)對(duì)ADs患者SARS-CoV-2 IgG抗體檢測(cè)結(jié)果的影響 不同濃度尿素解離6例SARS-CoV-2 IgG抗體陽(yáng)性的ADs患者血清結(jié)果顯示：2 mol/L尿素解離后，1例SARSCoV-2 IgG抗體陽(yáng)性者轉(zhuǎn)為陰性；4 mol/L尿素解離后，2例SARS-CoV-2 IgG抗體陽(yáng)性者轉(zhuǎn)為陰性；6 mol/L、8 mol/L和10 mol/L尿素分別解離后，均有5例SARS-CoV-2 IgG抗體陽(yáng)性者轉(zhuǎn)為陰性，即6 mol/L為最佳尿素解離濃度，其特異度為99.5%（199/200）。見表2。

表2 不同濃度尿素解離對(duì)ADs患者SARS-Cov-2 IgG抗體檢測(cè)結(jié)果影響Table 2 Effect of urea dissociation at different concentrations on the detection of SARS-CoV-2 IgG antibody in patients with ADs

2.5 尿素解離試驗(yàn)對(duì)COVID-19患者SARSCoV-2 IgM/IgG抗體檢測(cè)結(jié)果的影響 COVID-19組中有36例患者SARS-CoV-2 IgG抗體呈弱陽(yáng)性，6 mol/L尿素解離后，1例發(fā)病7 d內(nèi)的患者SARS-CoV-2 IgG抗體轉(zhuǎn)為陰性，弱陽(yáng)性標(biāo)本轉(zhuǎn)陰率為2.78%（1/36），發(fā)病≥8 d的患者標(biāo)本仍為陽(yáng)性，SARS-CoV-2 IgG抗體弱陽(yáng)性和陽(yáng)性標(biāo)本總體轉(zhuǎn)陰率為1.30%（1/77）。COVID-19組患者中有38例患者SARS-CoV-2 IgM抗體呈弱陽(yáng)性，18例呈陽(yáng)性，均未出現(xiàn)轉(zhuǎn)陰現(xiàn)象。膠體金免疫層析法檢出的SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體弱陽(yáng)性標(biāo)本，經(jīng)6 mol/L尿素解離前后，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。

3 討 論

自2020年COVID-19的全球大流行已造成數(shù)億人感染，并導(dǎo)致數(shù)百萬(wàn)人死亡。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)在《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[13]中首次提出COVID-19疑似病例具備血清SARS-CoV-2特異性 IgM抗體和IgG抗體陽(yáng)性；血清SARS-CoV-2特異性IgG 抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性或恢復(fù)期較急性期 4 倍及以上升高作為確診病例。SARS-CoV-2特異性抗體血清學(xué)檢測(cè)具有準(zhǔn)確、方便的特點(diǎn)，可用于監(jiān)測(cè)急性期COVID-19患者病情轉(zhuǎn)歸過(guò)程中的免疫狀況，也可用于評(píng)估健康人接種COVID-19疫苗后產(chǎn)生抗體的情況[14-15]。因此排除SARS-CoV-2特異性抗體檢測(cè)的干擾因素、消除假陽(yáng)性，對(duì)COVID-19臨床診斷和疫情防控具有重要意義。

已有研究顯示，高類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor, RF）水平可能是導(dǎo)致SARS-CoV-2特異性抗體血清學(xué)檢測(cè)假陽(yáng)性的重要因素[16]。本研究檢測(cè)200例ADs患者血清，SARS-CoV-2 IgM抗體均為陰性，6例SARS-CoV-2 IgG抗體為陽(yáng)性，其中SLE患者3例，SS、MCTD和AIH患者各1例，與既往研究的結(jié)果一致[6]，說(shuō)明自免組患者中容易出現(xiàn)SARS-CoV-2抗體假陽(yáng)性問(wèn)題。Aristov等[17]發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2棘突蛋白抗體和核蛋白抗體與線粒體、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、核抗原、甲狀腺過(guò)氧化物酶、可提取核抗原和髓鞘堿性蛋白呈強(qiáng)反應(yīng)性。同時(shí)，Aristov等[17]還發(fā)現(xiàn)5例血清SARS-CoV-2 IgG和IgM抗體均為假陽(yáng)性的非COVID-19患者標(biāo)本中有3例ANA、肌動(dòng)蛋白和線粒體抗體顯著升高。由此推測(cè)，當(dāng)人患ADs時(shí)，血液中的自身抗體與膠體金免疫層析法的硝酸纖維素膜包被的SARS-CoV-2抗原發(fā)生交叉反應(yīng)是導(dǎo)致結(jié)果假陽(yáng)性的可能原因。尿素作為一種解離劑，具有溶解和變性蛋白質(zhì)的功能[18]。為尋找減少ADs患者假陽(yáng)性結(jié)果的最佳尿素濃度，本研究采用不同濃度尿素對(duì)ADs患者SARS-CoV-2 IgG抗體陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行解離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著尿素濃度增加，SARSCoV-2 IgG抗體轉(zhuǎn)陰率在增加，但尿素濃度增加到6 mol/L、8 mol/L和10 mol/L時(shí)轉(zhuǎn)陰率均為83.33%，本研究將尿素6 mol/L作為最佳解離濃度并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，主要是基于有研究提示特異性抗原抗體親和力隨著尿素解離濃度的增加而降低[19]，因此，在同等效用下，選擇濃度較低者作為最佳解離濃度。

Benner等[20]發(fā)現(xiàn)COVID-19患者在感染早期，SARS-CoV-2 抗體的親和力較低，且隨著感染持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。由于COVID-19患者在發(fā)病不同階段其抗體的親和力會(huì)有所不同[19]，而尿素解離的效果與抗原抗體的親和力有關(guān)，由此推測(cè)尿素對(duì)各發(fā)病時(shí)期抗原抗體復(fù)合物的影響也可能有差異。本研究用尿素解離不同發(fā)病時(shí)間的COVID-19患者SARS-CoV-2 抗體陽(yáng)性血清，發(fā)現(xiàn)1例發(fā)病7 d內(nèi)患者SARS-CoV-2 IgG抗體由弱陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性，可能原因是親和力低，說(shuō)明尿素對(duì)膠體金免疫層析法檢測(cè)早期確診患者抗體的敏感度可能存在一定的影響。張鵬等[21]發(fā)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)SARS-CoV-2抗體的檢出率優(yōu)于膠體金免疫層析法，因此本研究將尿素運(yùn)用到化學(xué)發(fā)光法中去檢測(cè)弱陽(yáng)性標(biāo)本，未發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體轉(zhuǎn)為陰性。同時(shí)本研究存在一定的局限性，首先，納入研究ADs和COVID-19患者數(shù)量較少，其次，未研究尿素解離試驗(yàn)減少SARSCoV-2特異性抗體假陽(yáng)性結(jié)果的機(jī)制。

綜上所述，采用尿素解離試驗(yàn)，可減少因抗原抗體交叉反應(yīng)引起的假陽(yáng)性問(wèn)題，提高檢測(cè)的特異度，但該方法可能會(huì)降低COVID-19確診患者弱陽(yáng)性SARS-CoV-2 IgG抗體的敏感度。