長足大竹象超長鏈脂肪酸延長酶家族的全基因組鑒定及其分子進(jìn)化

付 春,甘東平，楊瑤君

［竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點(diǎn)實(shí)驗室（樂山師范學(xué)院），四川 樂山 614000］

0 引言

長足大竹象，屬鞘翅目(Coleoptera)象蟲科(Curculionidea)彎頸象屬(Cyrtotrachelus)，主要分布于我國的西南地區(qū)、沿海地區(qū)廣東和上海、等地以及東南亞越南、泰國等國家[1-2]。該蟲完全變態(tài)，需要經(jīng)歷成蟲、卵、幼蟲和蛹四個階段[3]。成蟲是靠取食竹筍補(bǔ)充營養(yǎng)，該蟲的卵產(chǎn)在筍殼下，幼蟲孵化后再鉆食竹筍并咬破竹筍后在土里化蛹并以成蟲越冬,而由卵發(fā)育成五齡幼蟲大約只需15 d，且長足大竹象為寡食性昆蟲，主要取食叢生幼嫩的竹筍尖部[4-5]。長足大竹象的隱蔽性很強(qiáng)且是當(dāng)前竹林的主要害蟲之一，在2003年國家林業(yè)局將該蟲列為我國林業(yè)主要有害生物之一[6]。

超長鏈脂肪酸延長酶（Elongation of very long chain fatty acids protein)在植物中，名為FAE[7]，在昆蟲及真菌酵母中，名為ELO[8]，而在魚類以及哺乳動物中，名為ELOVL[9]，是脂肪酸延伸反應(yīng)第一步的限速性縮合酶[8]。超長鏈脂肪酸(VLCFA)合成時碳鏈的縮合延長過程是類似于β-氧化逆反應(yīng)的循環(huán)過程，以脂酰CoA(fatty acyl-CoA)作為起始點(diǎn)，通過縮合、加氫、脫水、再加氫四個步驟循環(huán)完成碳鏈的延伸，其中脂肪酸碳鏈的延伸主要發(fā)生在線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體中[10]。其中的縮合反應(yīng)是由ELO 催化，丙二酸單酰CoA 提供2 個碳原子，使脂肪酸碳鏈延長，而活性位點(diǎn)與賴氨酸殘基之間的距離決定ELO 脂肪酸的長度[11]。由此可見ELO 對脂肪酸代謝調(diào)控以及脂類的生物合成起著至關(guān)重要的作用。昆蟲領(lǐng)域研究中，Chertemps 等首次報道了昆蟲的ELO基因并命名為elo68α 和一種在雌果蠅中特異性表達(dá)的ELO，命名為eloF[12]。對ELO研究主要集中在黑腹果蠅，其中主要包括在ELO對形成受精卵過程中生殖能力的影響[13]、對表皮功能的影響[14]、對運(yùn)動功能影響，降低其生存力[15]、對絳色細(xì)胞的影響[16]，以及在信息素合成中影響合成酯類、烴類和醇類化合物等信息素。研究發(fā)現(xiàn)ELO對意大利蜂(Apis mellifera)中表皮轉(zhuǎn)錄功能也有影響[17]。Juárez 研究了德國小蠊(Blatella germanica)表皮中ELO的功能[18]。在黃粉蟲中也略有報道，其中主要集中在ELO可以干擾黃粉蟲幼蟲的基因，影響黃粉蟲的成長從而導(dǎo)致黃粉蟲死亡率的增加[19]。

目前對于長足大竹象的研究主要集中在消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生活習(xí)性、以及防治方法等方面[20-24]。而對于長足大竹象遺傳學(xué)方面的研究還相對較少，主要為汪振宇等研究的染色體核型分析[25]。尚且沒有關(guān)于長足大竹象全基因組的研究報道，而解密基因組里的遺傳信息是研究長足大竹象的分子進(jìn)化、生理結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。本研究以長足大竹象超長鏈脂肪酸延長酶全基因組為材料，采用生物信息學(xué)方法，研究長足大竹象全基因組中的CbuELO 蛋白的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位情況、跨膜域結(jié)構(gòu)、蛋白親水性疏水性、磷酸化位點(diǎn)情況、蛋白二級結(jié)構(gòu)、蛋白三級結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)以及染色體定位。同時構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析基因間的同源性以及種族間親緣關(guān)系。為深入分析長足大竹象的生物學(xué)功能提供可靠的數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

長足大竹象基因組序列、其所有蛋白質(zhì)序列文件和注釋文件均來自于本科研團(tuán)隊完成的全基因組測序數(shù)據(jù)[26]。同時在InsectBase2.0 數(shù)據(jù)庫(http://v2.insect-genome.com/)通過查找下載所有鞘翅目昆蟲的ELO 蛋白序列用于構(gòu)建長足大竹象與其他鞘翅目昆蟲的ELO基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹(表1)。

表1 用于本研究的鞘翅目昆蟲物種名稱

1.2 方法

1.2.1 長足大竹象ELO基因家族鑒定、染色體定位預(yù)測及基因結(jié)構(gòu)的分析

利用ELO基因家族的Pfam 模型對長足大竹象全基因組的編碼蛋白質(zhì)序列PfamSearch 檢索其基因組中所有ELO基因家族的蛋白編碼序列，然后結(jié)合SMART 工具對經(jīng)pfam 鑒定的所有蛋白成員序列檢索保守結(jié)構(gòu)域，剔除不存在ELO保守結(jié)構(gòu)域的序列后即為ELO基因家族的所有蛋白質(zhì)序列。從長足大竹象的gff 信息中獲得ELO基因所在染色體和基因起始位置，然后利用MapChart 軟件對CbuELO基因家族進(jìn)行染色體定位分析。利用在線網(wǎng)站Gene Structure Display Server2.0(http://gsds.gao-lab.org)分析基因結(jié)構(gòu)中外顯子與內(nèi)含子的情況。

1.2.2 CbuELO 蛋白理化性質(zhì)的分析與亞細(xì)胞定位

利用EXPASY-ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測CbuELO蛋白理化性[27]?？梢苑治龀龅鞍椎姆肿恿看笮　被釘?shù)目、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)、等電點(diǎn)、總平均親水性以及正負(fù)帶電荷殘基總數(shù)。利用CELL:Subcellular(http://cello.life.nctu.edu.tw/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位[28]。

1.2.3 CbuELO 蛋白的跨膜域分析、親疏水分析以及蛋白氨基酸序列的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

利用TMHMM-2.0-Services(https://services.healthtech.dtu.dk/service.)進(jìn)行蛋白的跨膜域分析，利用EXPASY-Proscale(https://web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行蛋白親疏水分析[29]。用NetPhos-3.1-Services(https://services.healthtech.dtu.dk/service.)預(yù)測磷酸化位點(diǎn)，輸入的是蛋白質(zhì)序列fasta格式，默認(rèn)參數(shù)[30]。

1.2.4 CbuELO 蛋白的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)以及保守結(jié)構(gòu)的分析

利用SOPMA Secondary Structure Prediction(https://npsa-prabi.ibcp.fr/) 預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié) 構(gòu)，利 用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，利用MEME-Submission Form(https://meme-suite.org/)分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)，初始基序數(shù)目設(shè)置為10，輸入的蛋白質(zhì)序列是fasta 格式[31]。

1.2.5 CbuELO 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

為了了解長足大竹象ELO基因與其他物種的ELO基因的進(jìn)化關(guān)系，利用在線網(wǎng)站InsectBase 中下載與長足大竹象同科、同目的物種的ELO基因的蛋白序列，并通過MEGA11 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，其蛋白序列為fasta 格式，采用鄰接法（Neighbor-Joining），采用bootstrap 方法進(jìn)行重復(fù)檢驗，bootstrap 次數(shù)設(shè)置為1000。采用最大似然法（MaxmummLikelihood,ML)構(gòu)建多個物種的ELO 蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹[32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 長足大竹象ELO 基因的鑒定及染色體定位

通過對長足大竹象ELO基因的鑒定，已知長足大竹象ELO基因共有15 個，按照基因順序，分別命名為CbuELO01-CbuELO15(表2)。利用MapChart 軟件對CbuELO基因家族進(jìn)行染色體定位分析可知，CbuELO的基因分別位于0、5、8、9 號染色體上，其中0 號染色體占比最多，共有11 個CbuELO基因，其基因分別為CbuELO01-CbuELO11。而基因CbuELO12-15分別位于5 號、8 號、9 號染色體上(圖1)。

圖1 長足大竹象ELO 基因家族染色體定位圖

表2 長足大竹象CbuELO 家族基因的基本信息

續(xù)表2

利用在線網(wǎng)站Gene Structure Display Server2.0分析CbuELO基因結(jié)構(gòu)可知，每個CbuELO基因的序列長度與編碼長度之間不是完全相同的，15 個CbuELO基因的序列長度的在1958～31756 bp 之間，而編碼長度則在863～29913 bp 之間。由圖2 可知CbuELO家族蛋白成員都含有外顯子(CDS)；除了CbuELO12沒有內(nèi)含子(Intron)外，其余家族成員都有內(nèi)含子；除了CbuELO04沒有非編碼區(qū)(UTR)外，其余家族成員都有非編碼區(qū)。每個家族成員含有外顯子的數(shù)量為1～10 個，內(nèi)含子的數(shù)量為0～9 個，非編碼區(qū)為0～2 個。其中成員CbuELO14含有最多的外顯子和內(nèi)含子，分別為10、9 個。

圖2 長足大竹象ELO 家族基因結(jié)構(gòu)圖

2.2 長足大竹象ELO 基因家族蛋白理化性質(zhì)分析

基于長足大竹象ELO的氨基酸序列，利用EXPASY-ProtParam tool 對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定性等)進(jìn)行分析。結(jié)果表明CbuELO 蛋白家族的氨基酸數(shù)目在219～368 之間，其中所含氨基酸數(shù)目最多的是CbuELO03 蛋白，為368。所含氨基酸最少的是CbuELO02 蛋白，為219，而整個CbuELO 家族里的蛋白平均氨基酸含量為285.4。CbuELO 蛋白家族的分子量在25.99～43.33kDa 之間。其中分子量最大的是CbuELO03，為43.33 kDa。分子量最小的是CbuELO，為25.99kDa。而整個CbuELO 蛋白家族的平均分子量為33.67 kDa。CbuELO 蛋白家族的理論等電點(diǎn)在9.22～9.68 之間。由此可知，整個CbuELO 蛋白家族為堿性蛋白，此結(jié)果與黃粉蟲ELO 基因家族一致[11]?；诶碚摬环€(wěn)定指數(shù)大于40 的為不穩(wěn)定性蛋白，小于四十的為穩(wěn)定性蛋白。由此可得，不穩(wěn)定性蛋白的有6個分別為CbuELO03、CbuELO04、CbuELO06、CbuELO07、CbuELO10、CbuELO12。其余的皆為穩(wěn)定性蛋白，總體上穩(wěn)定性蛋白數(shù)量大于不穩(wěn)定性蛋白。脂肪族氨基酸指數(shù)總體含量范圍在72.28～120.22 之間，說明CbuELO 蛋白家族之間熱穩(wěn)定性差異較大。從總平均親水性上分析，負(fù)值代表親水性，正值代表疏水性，絕對值代表其親疏水性大小。除了CbuELO03 蛋白為親水性蛋白外，其余蛋白皆為疏水性蛋白，整體CbuELO蛋白家族親水性平均系數(shù)為0.433，說明其為疏水性蛋白。從帶正負(fù)電荷數(shù)分析，整體CbuELO蛋白家族帶正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)要遠(yuǎn)大于帶負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)，說明CbuELO 蛋白家族整體是帶正電荷。利用CELL:Subcellular進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明CbuELO 蛋白家族全定位在細(xì)胞膜上，說明CbuELO 蛋白家族在 細(xì)胞膜上發(fā)揮著生物學(xué)作用(表3)。

表3 長足大竹象CbuELO 蛋白的理化性質(zhì)

2.3 CbuELO 蛋白的跨膜域分析、親疏水以及蛋白氨基酸序列的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

利用TMHMM-2.0-Services進(jìn)行CbuELO蛋白家族的跨膜域分析，結(jié)果表明蛋白家族中的每個成員都有數(shù)量不一的跨膜結(jié)構(gòu)，其中蛋白CbuELO01、CbuELO003、CbuELO05～CbuELO008、CbuELO15都含有最多的跨膜結(jié)構(gòu)，7 個(表4、圖3)。因此可以推斷CbuELO 蛋白家族為跨膜蛋白。

圖3 長足大竹象CbuELO 蛋白的跨膜域分析

表4 長足大竹象CbuELO 蛋白的跨膜域分析

利用EXPASY-Proscale 進(jìn)行CbuELO 蛋白家族親疏水分析，結(jié)果表該蛋白家族最大疏水性的數(shù)值范圍在2.311～3.378 之間，成員CbuELO05有最大數(shù)值3.378。而最大親水范圍在-3.344～-2.067 之間，成員CbuELO01 有最小數(shù)值-3.344(表5)。由分值絕對值代表親疏水性大小可知疏水性氨基酸殘基數(shù)量遠(yuǎn)大于親水性氨基酸殘基(圖4)，可知，ELO 蛋白為疏水性蛋白，因此可以推斷出為不溶性蛋白。

圖4 長足大竹象ELO 疏水性分析結(jié)果

表5 長足大竹象CbuELO 蛋白的親水性/疏水性分析

用NetPhos-3.1-Services 預(yù)測磷酸化作用位點(diǎn)，結(jié)果表明CbuELO 蛋白家族具有多個不同的磷酸化位點(diǎn)，總體上該蛋白家族共有247個絲氨酸可磷酸化位點(diǎn)、125 個蘇氨酸可磷酸化位點(diǎn)、102 個酪氨酸可磷酸化位點(diǎn)。其中成員CbuELO03 蛋白含有最多的磷酸化位點(diǎn)，為51 個，而成員CbuELO10 含有最少的磷酸化位點(diǎn)，為15 個。含絲氨酸磷酸化位點(diǎn)最多的是成員CbuELO12，有29 個，而含量最少的是成員CbuELO13，有9 個，其中極有可能的磷酸化位點(diǎn)位于27、276 上，其數(shù)值為0.996(遠(yuǎn)大于閾值0.500)；含蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)最多的是成員CbuELO13、14，有13 個，含量最少的是成員CbuELO10，僅有1 個，其中極有可能的磷酸化位點(diǎn)位于85 上，其數(shù)值為0.964；含酪氨酸磷酸化位點(diǎn)最多的是成員CbuELO03，有16 個，而含量最少的是成員CbuELO10，僅有1 個，其中極有可能的磷酸化位點(diǎn)位于147 上，其數(shù)值為0.973(表6)。

表6 長足大竹象CbuELO 蛋白氨基酸序列的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

2.4 CbuELO 蛋白的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)以及保守結(jié)構(gòu)的分析

利用SOPMA Secondary Structure Prediction 預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，CbuELO 家族整體上的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，由2064 個氨基酸殘基組成，占整體的48.51%；擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)由802 個氨基酸殘基組成，占整體的18.72%；β-轉(zhuǎn)角由126 個氨基酸殘基組成，占整體的2.98%；而無規(guī)則卷曲由1289 個氨基酸組成，占整體的29.79%。其中α-螺旋中，CbuELO10 蛋白占比最高，有55.84%是α-螺旋，由129 個氨基酸殘基組成，而最少的是CbuELO14 蛋白有42.39%是α-螺旋，由156 個氨基酸殘基組成；在擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)中，CbuELO04 蛋白占比最高，有24.64%是擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)，由65 個氨基酸殘基組成，而占比最少的是CbuELO13 僅有15.13%是擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)，由46 個氨基酸殘基組成；在β-轉(zhuǎn)角中，CbuELO12占比最高，有4.53%是β-轉(zhuǎn)角，由13 個氨基酸殘基組成；而占比最少的是CbuELO01，僅有1.67%是β-轉(zhuǎn)角，由5 個氨基酸殘基組成；在無規(guī)則卷曲中，占比最高的是CbuELO05，所含量35.92%，由111 個氨基酸殘基組成，而占比最少的是CbuELO10，所含量有22.08%，由51 個氨基酸殘基組成(表7、圖5)。

表7 CbuELO 蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析

圖5 大竹象CbuELO 蛋白的二級結(jié)構(gòu)

利用SWISS-MODEL 預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，根據(jù)結(jié)構(gòu)的相似程度共分為四類，為了方便觀察每張圖按順序用A、B、C、D、E、F、G、H、I、G、K、L、M、N、O 表示。首先第一類是I、J、K、L、M、N、O，數(shù)目最多，有7個，分別對應(yīng)蛋白CbuELO04、CbuELO06～08、CbuELO10、CbuELO13、CbuELO15；第二類是E、F、G、H，分別對應(yīng)蛋白CbuELO09、CbuELO11、CbuELO12、CbuELO14；第三類是B、C、D，分別對應(yīng)蛋白CbuELO01、CbuELO03、CbuELO05；第四類僅有1個A所對應(yīng)蛋白為CbuELO02。從三級結(jié)構(gòu)圖中可以看出，CbuELO蛋白家族中α-螺旋與無規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)元件，而無β-轉(zhuǎn)角則零星散落，這一點(diǎn)結(jié)構(gòu)預(yù)測與二級結(jié)構(gòu)分析一致(圖6)。

圖6 長足大足象ELO 蛋白的三級結(jié)構(gòu)圖

利用MEME-Submission Form分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，CbuELO 蛋白家族共鑒定出10 個保守基序，其基序長度在10～50aa之間。在CbuELO 蛋白家族中有最重要的4個保守基序，分別為motif1、motif2、motif3、motif4，其中motif4 在每個成員中都存在。蛋白CbuELO06～09 含有最多的保守基序，都有9 個，而含有最少的保守基序是蛋白CbuELO12，僅有1 個保守基序(表8、圖7)。

表8 保守基序序列l(wèi)ogo

續(xù)表8

圖7 保守基序序列

2.5 CbuELO 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

通過MEGA11 軟件構(gòu)建CbuELO 蛋白家族進(jìn)化樹，校驗參數(shù)Bootstrap 重復(fù)1000 次。結(jié)果表明，15 個家族成員根據(jù)其在進(jìn)化樹中的聚集程度分成了3 個亞家族（依此標(biāo)記為Group1、Group2、Group3）。其中Group1 家族成員最多，有6 個家族成員，占整體的40%；而Group2 家族成員最少，有四個家族成員，占整體的26%。根據(jù)進(jìn)化樹的自展值可以得到基因的同源性，可以看出，蛋 白CbuELO02 與CbuELO10，CbuELO06與CbuELO07、CbuELO11、CbuELO15 這些基因的自展值均為100%。在整個家族中Group2 是最原始的，而Group3 則是進(jìn)化最快的(圖8)。

圖8 長足大竹象ELO 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

長足大竹象與中歐山松大小蠹的ELO 蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。把兩者之間的進(jìn)化關(guān)系分為了四組（標(biāo)記為Group1、Group2、Group3、Group4）。在1組里面有4個CbuELO成員分別為CbuELO01、CbuELO08、CbuELO09、CbuELO14；2組里面也有4個CbuELO成員分別為CbuELO03、CbuELO06、CbuELO07、CbuELO10；3組有3個，分別為CbuELO05、CbuELO12、CbuELO13；4組里面有4個，分別為CbuELO02、CbuELO04、CbuELO11、CbuELO15。而中歐山松大小蠹的ELO蛋白在Group1～4的數(shù)量分別為3、1、4、1。根據(jù)進(jìn)化樹自展值得到了長足大竹象與中歐山松大小蠹的直系同源基因?qū)?，如CbuELO08與DpoELO07，CbuELO05 與DpoELO05、DpoELO06，CbuELO12與DpoELO04，這些基因?qū)Φ淖哉怪稻笥?5%(圖9)。

圖9 長足大竹象和中歐山松大小蠹的ELO 基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

長足大竹象與紅棕象甲的ELO 蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。根據(jù)進(jìn)化分析，把兩者之間的進(jìn)化關(guān)系分為了四組（標(biāo)記為Group1、Group2、Group3、Group4）。在1 組里面有5 個CbuELO成員分別為CbuELO01、CbuELO08、CbuELO09、CbuELO12、CbuELO13；2 組里面也有2 個CbuELO成員分別為CbuELO02、CbuELO05；3組有3個，分別為CbuELO03、CbuELO10、CbuELO14；4組里面有5個，分別為CbuELO04、CbuELO06、CbuELO07、CbuELO11、CbuELO15。而紅棕象甲的ELO 蛋白在Group1～4的數(shù)量分別為5、3、1、4。根據(jù)進(jìn)化樹自展值得到了長足大竹象與紅棕象甲的直系同源基因?qū)?，如CbuELO12 與RfeELO03，CbuELO13 與RfeELO04，CbuELO09與 RfeELO10、RfeELO12，CbuELO05 與RfeELO01、RfeELO07、RfeELO08 這些基因?qū)Φ淖哉怪稻笥?9%(圖10)。

圖10 長足大竹象和紅棕象甲的ELO 基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

長足大竹象與赤擬谷盜的ELO蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，研究其進(jìn)化關(guān)系。根據(jù)進(jìn)化分析，把兩者之間的進(jìn)化關(guān)系分為了5組（標(biāo)記為Group1、Group2、Group3、Group4、Group5）。在1組里面有1個CbuELO成員為CbuELO05；2組里面也有3個CbuELO成員分別為CbuELO08、CbuELO12、CbuELO13；3組有5個，分別為CbuELO04、CbuELO06、CbuELO07、CbuELO011、CbuELO15；4組里面有1個，為CbuELO02；5組有5個，分別為CbuELO01、CbuELO03、CbuELO09、CbuELO10、CbuELO12。而赤擬谷盜的ELO蛋白在Group1～5的數(shù)量分別為8、1、4、1、4。其中Group2 最原始，而Group1 進(jìn)化最快。根據(jù)進(jìn)化樹自展值得到了長足大竹象與赤擬谷盜的直系同源基因?qū)?，如CbuELO05 與TcaELO14，CbuELO12 與TcaELO02，CbuELO09 與TcaELO01這些基因?qū)Φ淖哉怪稻?00(圖11)。

圖11 長足大竹象和赤擬谷盜的ELO 基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

長足大竹象ELO 家族蛋白與中歐山松大小蠹、紅棕象甲、咖啡果小蠹、象鼻蟲、光臀八齒小蠹、云杉八齒小蠹、米象的ELO 序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。根據(jù)進(jìn)化分析，把兩者之間的進(jìn)化關(guān)系分為了5 組標(biāo)記為(Group1、Group2、Group3、Group4、Group5）。在1 組里面有2 個CbuELO成員為CbuELO05、CbuELO12；2組也有5個，分別為CbuELO06、CbuELO07、CbuELO11、CbuELO13、CbuELO15；4組里面有5個，為CbuELO01～4、CbuELO09；5 組有3 個，分別為CbuELO10、CbuELO08、CbuELO14。從整個發(fā)育樹來看長足大竹象ELO 家族蛋白與赤擬谷盜的親緣關(guān)系最近，除此之外中歐山松大小蠹和象鼻蟲也近(圖12)。

圖12 長足大竹象和所有象蟲科昆蟲的ELO 基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

長足大竹象ELO 家族蛋白與所有鞘翅目的ELO 序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)CbuELO 與所有鞘翅目的ELO 家族蛋白的進(jìn)化關(guān)系，共分為了8 個亞家族(分別用Group1、Group2、Group3、Group4、Group5、Group6、Group7 和Group8 標(biāo)記。其中CbuELO 家族蛋白在Group1 中有3 個成員；在Group3 中有1 個成員；在Group5 中有2 個成員，在Group7 中有3 個成員；Group8 含有最多成員，有6 個。由圖13 可以看出，Group1 進(jìn)化最快，而Group8 則最為原始(圖13)。

圖13 長足大竹象和所有鞘翅目的ELO 基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

3 討論

長足大竹象在四川1年發(fā)生1代，以成蟲在土中蛹室內(nèi)越冬[33]。成蟲在清晨活動性較弱但隨著溫度的升高，活動性會增強(qiáng)且飛行能力較強(qiáng)[34]。幼蟲、成蟲均會食竹筍，導(dǎo)致有大量斷頭竹和畸形竹的出現(xiàn)，且成蟲有假死性，壽命一般在50～70 d，竹林中成蟲于10 月上旬絕跡[35]。長足大竹象是主要的林業(yè)害蟲,危害率可達(dá)50%～80%，嚴(yán)重的達(dá)100%[36]。主要危害青皮竹(Bambusa textilis)、慈竹(Neosino Calamusaffinis)等叢生竹竹筍[36]。

超長鏈脂肪酸延伸酶(ELO)參與長鏈脂肪酸（C16、C18 和C20）的生成[37]，在ELO 的作用下形成超長鏈脂肪酸，此反應(yīng)需要NADPH 提供能量[38]。近年，ELO 在脂肪酸的具體作用得到廣泛的關(guān)注。在哺乳動物中，ELOVL 家族蛋白不僅可以控制脂肪酸碳鏈的長度外，其中ELOVL2 對雄性鼠的精子成熟有影響[39]。除此之外研究發(fā)現(xiàn)ELOVL 家族蛋白與糖尿病[40]、肥胖癥[41]、癌癥[42]等疾病都有所關(guān)聯(lián)。在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，發(fā)現(xiàn)了三條編碼脂肪酸延伸酶基因，對其功能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)它們可以將C14 催化生成不同長度的長鏈脂肪酸[43]。在昆蟲中，ELO參與交配、繁殖、信息素生物合成以及表皮形成等生命活動過程[44]。同一種昆蟲中，不同的ELO具有不同的底物偏好性和組織特異性表達(dá)。如今，對于ELO 在昆蟲這方面的研究主要集中在果蠅上，共發(fā)現(xiàn)了20 條ELO 家族蛋白并研究出ELO是果蠅發(fā)育過程中的關(guān)鍵基因[45]。研究白紋伊蚊（Aedes albopictus）ELO 發(fā)現(xiàn)，ELO 家族蛋白對于其滯育卵和抵抗干燥具有重要作用[46]。在褐飛虱中，共鑒定出20 條ELO 家族蛋白，它們具有不同的表達(dá)部位和表達(dá)圖譜，從而行使不同的生物學(xué)功能[44]。盡管ELO 基因在一些昆蟲中有了深入的研究，但在長足大竹象中ELO 基因的研究還是一個空白。

本研究利用生物信息學(xué)手段對長足大足象ELO 全基因家族進(jìn)行了全面分析。對其基因家族鑒定發(fā)現(xiàn)，CbuELO 蛋白家族共有15 個成員，15個成員位于4 條染色體上。通過Gene Structure Display Server2.0 分析基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，CbuELO 家族蛋白成員都含有外顯子(CDS)；除了CbuELO12沒有內(nèi)含子(Intron)外，其余家族成員都有內(nèi)含子；除了CbuELO04沒有非編碼區(qū)(UTR)外，其余家族成員都有非編碼區(qū)。通過EXPASY-ProtParam預(yù)測蛋白理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)CbuELO 蛋白家族的理論等電點(diǎn)在9.22～9.68 之間，總體穩(wěn)定性蛋白數(shù)量大于不穩(wěn)定性蛋白，脂肪系數(shù)在72.28～120.22 之間。整體CbuELO 蛋白家族親水性平均系數(shù)為0.433，說明其為疏水性蛋白，這與苗璐等研究預(yù)測一致[46]。整體CbuELO 蛋白家族Arg+Lys 總數(shù)要遠(yuǎn)大于Asp+Glu，說明CbuELO 蛋白家族整體是帶正電荷。利用CELL:Subcellular 進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，CbuELO 蛋白家族全定位在細(xì)胞膜上。利用TMHMM-2.0-Services 進(jìn)行CbuELO 蛋白家族的跨膜域分析，結(jié)果表明蛋白家族中的每個成員均有跨膜結(jié)構(gòu)，因此可以推斷CbuELO 蛋白家族為跨膜蛋白，這與雷娜娜研究預(yù)測一致[47]。用在線軟件NetPhos 預(yù)測磷酸化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)該蛋白家族有多個磷酸化位點(diǎn)。用SWISS-MODEL 預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)CbuELO 蛋白家族中α-螺旋與無規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)元件。利用MEME分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，CbuELO 蛋白家族共鑒定出10 個保守基序，其中motif4 在每個成員中都存在，這與郭兵研究預(yù)測一致[48]。通過MEGA11 軟件構(gòu)建CbuELO 蛋白家族進(jìn)化樹分析，長足大竹象ELO 家族蛋白與赤擬谷盜多個基因序列同源性達(dá)到100%，說明長足大竹象與赤擬谷盜的ELO 蛋白家族親緣關(guān)系最近，除此之外與中歐山松大小蠹和象鼻蟲最近。

4 結(jié)語

綜上所述，本文對長足大竹象ELO基因家族進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)研究，研究結(jié)果為揭示長足大竹象分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時也為害蟲綠色防治提供了新的靶標(biāo)[49]。