畢赤酵母高效表達(dá)外源蛋白的分子水平策略

張欣然，凌焱，楊英*

1(軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京，100850)2(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定，071000)

巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)作為被應(yīng)用最廣泛的工程菌之一，已有超過5 000種外源蛋白利用其表達(dá)并進(jìn)行工業(yè)化制備。其中不僅包括脂肪酶、植酸酶、甘露聚糖酶等應(yīng)用范圍廣泛的工業(yè)酶，還包括人血清白蛋白、胰島素、乙肝表面抗原等具有重要應(yīng)用價值的藥物相關(guān)蛋白。畢赤酵母在重組蛋白表達(dá)方面的成功是由于其易于實現(xiàn)工業(yè)化大批量發(fā)酵生產(chǎn)，且自分泌的蛋白較少，相較于原核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母還具有翻譯后修飾等功能。但是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)仍存在著表達(dá)效率低、外源基因不穩(wěn)定、蛋白在細(xì)胞內(nèi)易被降解等問題。為解決上述問題，學(xué)者從外源基因的特性、菌種、表達(dá)環(huán)境和發(fā)酵技術(shù)等多個方面對畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行改造，以期望達(dá)到更高效的外源蛋白表達(dá)效果。本文著眼于分子水平上的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)加工、蛋白質(zhì)降解模塊以及轉(zhuǎn)運(yùn)分泌4個模塊，對利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)通過優(yōu)化為畢赤酵母偏嗜型密碼子、插入多拷貝數(shù)的外源基因、選擇合適的啟動子以及高效率的引導(dǎo)肽、敲除相關(guān)蛋白酶的基因、共表達(dá)促折疊因子等方式使外源蛋白高效率表達(dá)的相關(guān)分子水平策略進(jìn)行了簡要綜述。

1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)簡介

酵母菌是一種當(dāng)前被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物的菌種。在酵母菌細(xì)胞中，蛋白質(zhì)的表達(dá)機(jī)制與哺乳動物細(xì)胞中的相似。與細(xì)菌相比，酵母細(xì)胞具有生長速度快、翻譯后修飾、分泌表達(dá)、易于遺傳操作等優(yōu)點(diǎn)。目前已經(jīng)有超過5 000種異源蛋白可以利用畢赤酵母成功表達(dá)[1]。不同于其他表達(dá)系統(tǒng)，選擇畢赤酵母作為表達(dá)外源蛋白菌株的優(yōu)勢主要有以下幾點(diǎn)：

(1)高表達(dá)。區(qū)別于釀酒酵母的GAL1啟動子，畢赤酵母具有的AOX1啟動子是強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動子，其蛋白表達(dá)水平是釀酒酵母的10～100倍，甲醇可作為其唯一碳源，實現(xiàn)高效的異源表達(dá)，大量外源蛋白表達(dá)量達(dá)到g/L水平，如人血清白蛋白表達(dá)量能達(dá)到10 g/L[2]，木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶表達(dá)量能達(dá)到5 g/L[3]。

(2)高分泌。由α-因子信號肽引導(dǎo)，將外源蛋白分泌至胞外。外源蛋白的含量占培養(yǎng)基中總蛋白量的80%～90%，并且畢赤酵母較少分泌內(nèi)源性蛋白，這就對后期目的蛋白的分離純化提供了極大的便利。

(3)高穩(wěn)定性。在釀酒酵母中，質(zhì)粒復(fù)制進(jìn)行游離表達(dá)；然而，在畢赤酵母中，質(zhì)粒整合在宿主染色體上，因此重組菌株非常穩(wěn)定，即使沒有外界抗生素的篩選壓力，外源基因仍能穩(wěn)定存在于宿主染色體基因組[4]。

(4)糖基化程度低。雖然釀酒酵母和畢赤酵母的N-連接糖基化都是甘露糖形式，但畢赤酵母翻譯后將長度為8～14個甘露糖殘基的寡糖鏈添加到蛋白上去，相比于釀酒酵母翻譯后添加到蛋白上的50～150個甘露糖殘基要短很多。除此之外，畢赤酵母的O-連接糖基化也非常少[5]。

(5)培養(yǎng)成本低。畢赤酵母對培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求低，可使用成本低廉的培養(yǎng)基進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，又因為其好氧生長速度快，適合高密度培養(yǎng)，十分有利于工業(yè)化放大生產(chǎn)[6]。

2 影響外源蛋白表達(dá)的因素

畢赤酵母不僅具有許多原核生物容易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)[7]，同時克服了許多釀酒酵母系統(tǒng)存在的缺陷[8]，十分適合高水平外源基因的表達(dá)，目前被廣泛用于生產(chǎn)各種工業(yè)酶[9]和藥用蛋白[10]。然而，使用畢赤酵母進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)仍存在許多限制，如需要易燃化學(xué)物質(zhì)甲醇來誘導(dǎo)表達(dá)、延長發(fā)酵時間和低表達(dá)水平。因此，可根據(jù)限制畢赤酵母高效表達(dá)的因素，通過合理設(shè)計實驗條件[11]、開發(fā)強(qiáng)啟動子、優(yōu)化蛋白質(zhì)分泌途徑[12]、改變蛋白質(zhì)糖基化[13]和轉(zhuǎn)錄因子的共表達(dá)[14]等方式來增強(qiáng)外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)效率。表1總結(jié)了影響畢赤酵母表達(dá)外源蛋白效率的因素以及對應(yīng)的提高表達(dá)效率的方法。

表1 影響畢赤酵母表達(dá)外源蛋白效率的因素Table 1 Factors affecting the expression efficiency of exogenous proteins in Pichia pastoris

3 高效表達(dá)的分子水平策略

3.1 基因轉(zhuǎn)錄模塊

基因轉(zhuǎn)錄模塊主要分為密碼子的優(yōu)化、基因劑量的優(yōu)化、啟動子的選擇與優(yōu)化3個部分。密碼子的優(yōu)化主要采用的方法是將外源基因的密碼子設(shè)計成畢赤酵母偏好的密碼子；基因劑量的優(yōu)化主要是增加外源基因拷貝數(shù)，通過體外構(gòu)建法或者體內(nèi)構(gòu)建法來達(dá)到高效表達(dá)外源蛋白的目的；而啟動子優(yōu)化是通過人為選擇，利用轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度高且制約因素少的啟動子來表達(dá)外源蛋白，從而提高表達(dá)效率。

3.1.1 密碼子優(yōu)化

外源基因的密碼子和其mRNA的二級結(jié)構(gòu)影響了外源蛋白表達(dá)效率的高低。畢赤酵母有其偏好的一套表達(dá)密碼子，構(gòu)建表達(dá)載體時需將外源基因按照其偏好的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，如果外源基因的密碼子與畢赤酵母偏好的密碼子不一致，將會在mRNA翻譯時導(dǎo)致順序錯位無法正常譯出，甚至提前終止。除此之外，mRNA的5′非翻譯區(qū)(5′ untranslated region，5′UTR)序列對外源基因的表達(dá)水平起關(guān)鍵調(diào)控作用，使用AOX1基因的5′UTR可顯著提高外源基因的表達(dá)量。

密碼子優(yōu)化是在確保外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列不發(fā)生變化的基礎(chǔ)上，改造為畢赤酵母偏好的外源基因密碼子類型。李富強(qiáng)等[32]通過密碼子優(yōu)化將豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的表達(dá)量由近乎為0提高到155 mg/mL。顧莉莉等[33]通過密碼子合理優(yōu)化將黑曲霉的Ⅱ型脂肪酶表達(dá)量提高了174.5 U/L。通過優(yōu)化外源基因的密碼子也可以實現(xiàn)多種外源蛋白的共表達(dá)。唐小雁等[34]通過密碼子優(yōu)化UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1和蔗糖合成酶AtSUS基因，實現(xiàn)了雙酶在畢赤酵母中的胞內(nèi)共表達(dá)。因此，通過優(yōu)化密碼子可以提高畢赤酵母中外源蛋白質(zhì)的合成速率。

3.1.2 基因劑量的優(yōu)化

提高外源基因劑量的主要方法是增加基因拷貝數(shù)。一般情況下，單拷貝的基因在畢赤酵母中的表達(dá)量普遍較低，可以通過體內(nèi)構(gòu)建或者體外構(gòu)建來適當(dāng)增加基因拷貝數(shù)使效率提高。

體內(nèi)構(gòu)建法是在體外逐步地串聯(lián)外源基因的表達(dá)盒，以此得到多拷貝數(shù)的表達(dá)質(zhì)粒。主要依賴于限制性內(nèi)切同尾酶的作用，但由于載體分子質(zhì)量本身較大，隨著拷貝數(shù)增加其操作也變得越來越困難，一般情況下最多只能構(gòu)建到6拷貝左右。王義春等[35]通過密碼子優(yōu)化、體外多拷貝構(gòu)建的方法，將外源基因與α-因子信號肽編碼序列一起合成，通過酶切酶連構(gòu)建含1～6個表達(dá)盒的表達(dá)質(zhì)粒，獲得玉米赤霉烯酮降解酶的重組菌株，其重組蛋白表達(dá)的分子質(zhì)量為28.9 kDa。劉潔等[36]優(yōu)化β-胡蘿卜素合成限速酶的基因拷貝數(shù)，構(gòu)建了β-胡蘿卜素產(chǎn)量為3.7 mg/g菌體干重的新菌株P(guān)p-EYBI+(YB) 3H。呂星星等[37]使用同尾酶法構(gòu)建了鱖魚β-防御素(Sinipercachuatsiβ-defensin, ScBD)基因的2拷貝和4拷貝表達(dá)盒載體pPICZαA-ScBDn(n=2或4),分別電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33后成功篩選到各種重組菌株。結(jié)果表明，含1拷貝、2拷貝和4拷貝表達(dá)盒載體的重組菌株的基因組中ScBD基因的拷貝數(shù)分別為1.19×105、2.56×105和5.29×105，證明載體所含的表達(dá)盒數(shù)目與嵌合進(jìn)畢赤酵母基因組中的ScBD基因拷貝數(shù)之間存在正相關(guān)關(guān)系，也由此證明了多拷貝表達(dá)盒載體的構(gòu)建是提高目的基因拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄水平的有效方法。增加基因的數(shù)量可以在一定范圍內(nèi)增加外源蛋白質(zhì)的合成，但是過多的拷貝會增加宿主的代謝負(fù)荷。WU等[38]表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化蛋白時的拷貝數(shù)超過5時，表達(dá)水平顯著降低。

體外構(gòu)建法通常是通過抗生素壓力篩選得到多拷貝外源基因菌株，如提高G418抗性的濃度，能篩選到基因拷貝數(shù)為7～12的表達(dá)菌株。SCORER等[39]在含有不同濃度的G418平板上涂布畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，通過測出每塊板上轉(zhuǎn)化子的外源蛋白的表達(dá)水平，提出了外源基因的拷貝數(shù)和G418篩選濃度存在正相關(guān)性的觀點(diǎn)。目前一種新的篩選方法則是利用熒光蛋白作為分子信標(biāo)，直觀快速地做高表達(dá)菌株的篩選，虞維紅[40]通過2A肽將綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白分別與抗菌肽PR39多拷貝進(jìn)行融合表達(dá)，篩選得到的D-PR39-Y菌株表達(dá)量提高了69.4%。陳永安等[19]通過檢測菌株的熒光值代替檢測重組蛋白的表達(dá)水平和活性，根據(jù)綠色熒光值的高低對包含不同植酸酶表達(dá)水平的重組菌株的菌群進(jìn)行分選，從而實現(xiàn)多拷貝菌株的篩選，大大提高了其應(yīng)用的便捷性及通用性。

3.1.3 啟動子的選擇和優(yōu)化

啟動子是基因表達(dá)的關(guān)鍵元件。啟動子的強(qiáng)度與外源基因的mRNA水平及外源蛋白的表達(dá)量直接相關(guān)，選擇適用的啟動子有利于外源蛋白的高效合成。啟動子可分為需要誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)型啟動子和不需要誘導(dǎo)劑的組成型啟動子。AOX1基因的啟動子——PAOX1是常用的誘導(dǎo)型啟動子，該啟動子受甲醇的誘導(dǎo)，被葡萄糖和甘油抑制，因此可通過更換不同的碳源(甘油或甲醇)，使細(xì)胞生長與外源蛋白合成2個過程分開，有利于平衡生物量與積累外源蛋白。在畢赤酵母PAOX1控制下，外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量能達(dá)到20 g/L，其分泌表達(dá)量可達(dá)到15 g/L。MOMBENI等[41]用甲醇氧化酶基因(pMOX)的啟動子區(qū)域在蛋白酶缺陷型和野生型畢赤酵母菌株中探索異源表達(dá)外源蛋白情況。MOX的啟動子區(qū)被分離出來，并用pPINK-HC質(zhì)粒中的pAOX1取代。引入了pMOX這種新的小而強(qiáng)的無甲醇啟動子，用于在畢赤酵母中生產(chǎn)重組蛋白。

目前不同來源的多種誘導(dǎo)型啟動子被發(fā)現(xiàn)并被利用，如磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的啟動子PPHO89(磷酸缺少時被誘導(dǎo))、異檸檬酸裂合酶基因的啟動子PICL1(乙醇誘導(dǎo))等。甘油醛三磷酸脫氫酶基因的啟動子PGAP是最常用的組成型啟動子，其在葡萄糖和甲醇條件下具有相同的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度。PGCW14是畢赤酵母中發(fā)現(xiàn)具有最高轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的組成型啟動子，當(dāng)葡萄糖是唯一碳源時，將EGFP用作報告蛋白，其表達(dá)量比PGAP控制下的表達(dá)量提高了10倍，當(dāng)甘油為唯一碳源時，表達(dá)量提高了5倍。

3.2 蛋白加工模塊

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核生物中蛋白分泌表達(dá)加工折疊的主要場所，即使可從多種高效的引導(dǎo)肽中選擇最合適的引導(dǎo)肽，其新合成蛋白的通量增加會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊和錯誤折疊的蛋白積累，使外源蛋白在畢赤酵母細(xì)胞中滯留，當(dāng)表達(dá)水平高時，尤其如此。當(dāng)在細(xì)胞中合成大量的外源蛋白質(zhì)并且沒有被及時折疊時，會給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)造成壓力，當(dāng)未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量積累，遠(yuǎn)超過分子伴侶輔助折疊的能力，超出降解系統(tǒng)清除錯誤蛋白的限度時，往往會造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫，也叫內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。嚴(yán)重時還會引起其他細(xì)胞器的損傷、細(xì)胞自噬，甚至造成細(xì)胞死亡。

為了解決這個問題，可以通過導(dǎo)入促折疊因子基因使得菌株過表達(dá)促折疊因子，及時促進(jìn)折疊和分泌大量的外源蛋白質(zhì)，這些促折疊因子對提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量有顯著作用。王晨蕾等[42]在重組菌株中分別過量表達(dá)蛋白質(zhì)折疊(BIP、ERO1)、囊泡運(yùn)輸(SEC53、SEC1)、脅迫應(yīng)激(Hac1、GCN4)相關(guān)的6種分子伴侶，結(jié)果顯示，共表達(dá)這6種分子伴侶對分泌表達(dá)漆酶的菌株P(guān)P-L的正常生長沒有影響；共表達(dá)BIP使重組菌胞外酶活力提高359%，共表達(dá)ERO1胞外酶活力反而降低22%；共表達(dá)其他4種分子伴侶胞外酶活力提高18%～53%。組合共表達(dá)BIP和Hac1的重組菌較之前胞外酶活力提高了602%，酶活力達(dá)到3 896 U/L。但是，此類折疊因子的表達(dá)也將占據(jù)一定量的細(xì)胞資源，需要進(jìn)一步的實驗來確定實際的促進(jìn)折疊的作用和最佳的促進(jìn)分泌的劑量。

此外，真核細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)途徑來應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力并維持蛋白質(zhì)折疊的穩(wěn)態(tài)。UPR信號傳導(dǎo)是一個進(jìn)化上保守的通路，尤其是在酵母和絲狀真菌中表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?，由?nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的未折疊蛋白累積造成脅迫來自然激活。如圖1所示通路上的轉(zhuǎn)錄因子Hac1p在激活、維持這一信號途徑中起著關(guān)鍵作用，通過依賴于UPR信號響應(yīng)元件(unfolded protein reaction element，UPRE)調(diào)節(jié)蛋白折疊或降解等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過程，來緩解產(chǎn)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的這種脅迫。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白的增加會減少分子伴侶Kar2，導(dǎo)致形成具有激酶和核酸酶活性的Ire1成形二聚體，該二聚體與未折疊蛋白結(jié)合。磷酸化后，它可以激活并影響其核酸酶活性，對轉(zhuǎn)錄因子Hac1的mRNA進(jìn)行特異性的非經(jīng)典剪切，使Hac1去除內(nèi)含子來正常表達(dá)(通過將Hac1轉(zhuǎn)換為Hac1i)。然后，轉(zhuǎn)錄因子Hac1進(jìn)入細(xì)胞核，與UPR靶基因啟動子的響應(yīng)元件結(jié)合，并啟動UPR靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而使細(xì)胞能夠抵消內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力響應(yīng)因子的共表達(dá)或用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工的分子伴侶和相關(guān)酶的過表達(dá)都有助于提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工的水平，因此能夠進(jìn)一步提高產(chǎn)量。閔琪等[43]利用畢赤酵母表達(dá)甘露糖聚酶ManA(Accession No.KJ806637)時，將Hac1與ERO1、PDI、PDI1、CPR5、BiP這5種與蛋白折疊相關(guān)的分子伴侶共表達(dá)，使酶活力提高了26%，最高達(dá)到1 014 U/mL。

圖1 酵母UPR的激活Fig.1 Activation of UPR in yeast

目前的研究熱點(diǎn)多集中在提高外源基因拷貝數(shù)以及共表達(dá)分子伴侶，這2種方案都需要向酵母基因組中整合新的質(zhì)粒片段，而這樣的基因操作是有次數(shù)限制的：宿主能接受多少種篩選壓力，類似的片段整合就能進(jìn)行多少次。之前的研究中，有學(xué)者嘗試針對一種抗生素通過不斷提高其濃度反復(fù)進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，進(jìn)而篩選多拷貝宿主，但這種方法極易產(chǎn)生假陽性，且篩選轉(zhuǎn)化子的工作量非常大。對于畢赤酵母而言，能夠被實際運(yùn)用于基因工程的標(biāo)記基因數(shù)量有限，進(jìn)行多次基因操作時會受到限制，所以篩選經(jīng)多次基因修飾的重組菌株時就會相對困難。同時，利用多個標(biāo)記基因篩選重組菌株也會增加前期載體構(gòu)建的復(fù)雜程度，因此可以通過有效地消除標(biāo)記基因克服這些難題。利用無標(biāo)記基因操作的方法可實現(xiàn)基因的敲入、敲除、定點(diǎn)突變等基因操作，篩選標(biāo)記回收后還可以重復(fù)利用，從而對同一個宿主菌株進(jìn)行多次基因修飾且不會引入多余的標(biāo)記基因。牛碩等[44]利用kFPR1基因作為反向篩選標(biāo)記，建立了一種適用于畢赤酵母的無標(biāo)記基因操作方法，實現(xiàn)篩選標(biāo)記在基因操作過程中的回收以及靶基因的成功整合，克服了篩選標(biāo)記選擇的限制，以實現(xiàn)外源基因在畢赤酵母中的高效合成。

3.3 蛋白降解模塊

在表達(dá)外源蛋白期間，畢赤酵母的胞內(nèi)或胞外都存在著蛋白酶。因此，大多數(shù)的外源蛋白都存在著被蛋白酶降解的風(fēng)險。一旦被蛋白酶水解，不僅會使外源蛋白表達(dá)量大大降低，同時也會使其后續(xù)純化變得十分困難。胞內(nèi)蛋白酶主要降解蛋白質(zhì)前體以產(chǎn)生具有活性的蛋白質(zhì)，或者從膜上運(yùn)輸后切割蛋白質(zhì)的信號肽，使調(diào)節(jié)蛋白、變異體或不需要的蛋白質(zhì)失活，參與分解蛋白質(zhì)，提供營養(yǎng)、前體和能量。胞外蛋白酶分泌的較少，主要分解某些蛋白質(zhì)以提供營養(yǎng)，例如氨基酸和肽。

改造蛋白降解相關(guān)途徑可大大減緩目的蛋白被降解的概率，從而提高產(chǎn)量。目前，最常用的避免蛋白酶降解的方式就是敲除相關(guān)蛋白酶的基因。近年來基因編輯技術(shù)作為代謝工程的一個重要工具受到廣泛關(guān)注，除了傳統(tǒng)的同源重組外，許多新型基因編輯技術(shù)也應(yīng)運(yùn)而生，比較熱門的技術(shù)包括鋅指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)技術(shù)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技術(shù)和CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas endonuclease)系統(tǒng)，其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前比較熱門且使用較多的技術(shù)，其作用機(jī)制如圖2所示?？衫肅RISPR/Cas9編輯技術(shù)，通過外源DNA修復(fù)DNA雙鏈斷裂形式，讓外源基因在某一個點(diǎn)發(fā)生突變，或利用gRNA串聯(lián)形式可以同時對多個靶位點(diǎn)定點(diǎn)修飾。同時設(shè)計外源片段，可以定位插入到靶位點(diǎn)，實現(xiàn)畢赤酵母本身特定基因的插入、敲除、替換。谷洋[45]構(gòu)建了RNA pol Ⅲ啟動子控制下的CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于高效表達(dá)人血清白蛋白，這一新系統(tǒng)的編輯效率高達(dá)80%。蔣秋琪等[46]使用CRISPR/Cas9技術(shù)分別敲除谷胱甘肽降解途徑中的3個基因DUG1(YFR044c)，DUG2(YBR281c)和DUG3(YNL191w)。其中，敲除DUG3基因的畢赤酵母，谷胱甘肽產(chǎn)量從160 mg/g提高到了224 mg/g。

圖2 CRISPR/Cas9的作用機(jī)制Fig.2 Mechanism of action of CRISPR/Cas9

避免被蛋白酶降解還可以向甲醇補(bǔ)料溶液中添加特異性蛋白酶抑制劑。SHI等[47]使用巴斯德畢赤酵母表達(dá)一種抗馬氏桿菌絲氨酸蛋白酶抑制劑單鏈抗體時，發(fā)現(xiàn)添加絲氨酸蛋白酶抑制劑使發(fā)酵液的總蛋白酶活性降低了53%，而天冬氨酸蛋白酶抑制劑降低了總蛋白酶活性30%。

除了敲除蛋白酶基因和添加蛋白酶抑制劑以外，還可以將目的蛋白與蛋白酶抑制劑或者畢赤酵母中的穩(wěn)定的蛋白伴侶共表達(dá)。此外，將目的蛋白運(yùn)輸至過氧化物酶體也可避免其被降解，只需在目的蛋白上連接一個過氧化物酶體靶向信號，這種方法同時減少了外源蛋白對宿主細(xì)胞可能具備的毒性副作用。

3.4 轉(zhuǎn)運(yùn)分泌模塊

在畢赤酵母中重組蛋白分泌到胞外必須經(jīng)過信號肽的引導(dǎo)。由于信號肽與目的蛋白融合表達(dá)，從而使目的蛋白在加工折疊后被引導(dǎo)分泌到胞外。常用的酵母信號肽有α交配因子信號肽(MF-α)、酸性磷酸脂酶信號肽(PHO1)、蔗糖酶信號肽(SUCZ)、Killer毒素信號肽和菊粉酶信號肽(INU)等。MF-α是畢赤酵母表達(dá)重組蛋白時應(yīng)用最廣泛的一種信號肽，最常用的分泌型表達(dá)載體pPIC9K和pPICZα-A的信號肽就是MF-α。MF-α對引導(dǎo)小分子多肽和蛋白的分泌非常有效，但對于引導(dǎo)大分子蛋白的分泌效果并不明顯。研究表明，分泌信號肽是影響外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的重要因素。苗楊利等[48]通過Signal P4.1在線預(yù)測軟件預(yù)測出9種具有分泌潛力的畢赤酵母內(nèi)源信號肽序列：FLO10、CPR5、PRY2、DSE4、NUP145、MSB2、SSP120、FRE2、FLO9。以MF-α信號肽為對照，考察這9種內(nèi)源信號肽對EGFP和米黑根毛霉脂肪酶(RhizomucormieheiLipase，RML)在蛋白酶缺陷型Pichia PinkTM表達(dá)系統(tǒng)的分泌效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FLO10、PRY2、DSE4、MSB2、SSP120、FRE2能有效介導(dǎo)EGFP分泌，且PRY2、DSE4、MSB2、FRE2介導(dǎo)EGFP的分泌水平優(yōu)于MF-α，分別是MF-α的2.15倍、1.15倍、1.33倍、1.3倍；FLO10、PRY2、DSE4、FRE2能有效介導(dǎo)RML的分泌，且FLO10介導(dǎo)RML的分泌水平最高，是MF-α的1.5倍，證明了內(nèi)源信號肽FLO10更能有效分泌RML。

N端信號肽的序列會影響蛋白易位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的效率，通過修飾N-末端或通過去除額外的接頭肽可以提高外源蛋白分泌的效率。隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的加工和折疊通量的增加，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體和細(xì)胞膜的下游運(yùn)輸通量已成為外源蛋白分泌和表達(dá)的瓶頸?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)因子的過表達(dá)來改善下游分泌通量并增加外源蛋白的表達(dá)。畢赤酵母中分泌小泡蛋白Sec4的過度表達(dá)使米根霉來源的葡糖淀粉酶的分泌和表達(dá)增加了一倍。調(diào)節(jié)分泌和碳源反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子Aft1的過表達(dá)也可以顯著增加外源蛋白的表達(dá)量。王儒昕等[49]采用共表達(dá)分子伴侶二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)或轉(zhuǎn)錄因子Aft1的方法來提高重組人溶菌酶(human lysozyme，HLY)的表達(dá)量，共表達(dá)PDI的HLY表達(dá)量增加了8.3%，共表達(dá)Aft1的HLY的胞外總蛋白增加了46.5%。

4 展望

畢赤酵母作為一種重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其比傳統(tǒng)的原核表達(dá)系統(tǒng)具有許多顯著優(yōu)勢，備受歡迎，針對畢赤酵母高效表達(dá)外源蛋白的優(yōu)化改造等研究工作也陸續(xù)展開。研究人員已從外源基因表達(dá)盒、分泌途徑、出發(fā)菌株、基因編輯與發(fā)酵過程控制等方面建立多種方法來提高表達(dá)效率。特別是在分子水平上，使用有效的分子操作方法和工具對畢赤酵母表達(dá)菌株和外源基因進(jìn)行修飾，這樣可以使外源基因更加適應(yīng)宿主菌的表達(dá)偏好。從分子水平上改造外源基因的方法不僅節(jié)省了時間和成本，而且顯著提高了目的蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)效率，使蛋白表達(dá)量大幅增加。此外，還可通過啤酒酵母等相近酵母菌株合成天然大分子產(chǎn)物(如青蒿素、大麻二酚等)的實例得到啟發(fā)，對于較難合成的外源蛋白如何在分子水平上對其基因或者宿主菌進(jìn)行改造有了新思路。另一方面，基因組測序技術(shù)的發(fā)展，能夠為非常規(guī)酵母提供完善的基因組注釋信息。轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)等技術(shù)從宏觀角度反映工程菌代謝網(wǎng)絡(luò)信息，揭示工程菌體內(nèi)調(diào)控模式，為代謝工程改造提供靶點(diǎn)。由于對畢赤酵母生理生化特性認(rèn)識有限，在目前模式生物構(gòu)建一碳同化效率低的背景下，從組學(xué)角度出發(fā)，可能能夠更好地探索和闡釋一碳同化機(jī)制，提高甲醇同化效率，為構(gòu)建高效畢赤酵母細(xì)胞工廠提供指導(dǎo)。

分子生物學(xué)不斷發(fā)展，各種相關(guān)技術(shù)也在不斷推陳出新，研究人員將通過更多的途徑以及更有效的分子操作方法和工具來改造畢赤酵母表達(dá)菌株，獲得表達(dá)效果更好的生產(chǎn)菌株，相信未來會有更多稀有蛋白通過畢赤酵母被大量地生產(chǎn)出來。