組合策略提高枯草芽孢桿菌漆酶在大腸桿菌中的胞外表達(dá)

劉松,韓徐悅

1(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江南大學(xué) 未來(lái)食品科學(xué)中心，江蘇 無(wú)錫，214122)

漆酶(EC 1.10.3.2)是一種多銅氧化酶，可氧化包括酚類、非酚類物質(zhì)和一些無(wú)機(jī)化合物等在內(nèi)的多種底物[1]。因其催化反應(yīng)過(guò)程的唯一副產(chǎn)物是水，被認(rèn)為是一種環(huán)保型綠色催化劑[2]，在食品[3]、紡織[4]、環(huán)境修復(fù)[5]和造紙[6]等方面有重要應(yīng)用。漆酶來(lái)源廣泛，在細(xì)菌[7]、真菌[8]、植物[9]和動(dòng)物[10]中均有發(fā)現(xiàn)，但是，野生型漆酶的總體產(chǎn)酶水平較低，不利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

隨著基因工程和酶工程的迅速發(fā)展，大腸桿菌(Escherichiacoli)因其發(fā)酵周期短、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高等優(yōu)勢(shì)，已成為重組蛋白生產(chǎn)的常用宿主[11]。雖然包括Klebsiellapneumoniae[12]、Proteushauseri[13]和Streptomycescyaneus[14]等多種細(xì)菌漆酶均成功表達(dá)于E.coli中，但是表達(dá)形式主要還是胞內(nèi)酶。針對(duì)胞內(nèi)酶，可通過(guò)添加溶菌酶或者超聲波破碎法回收，但前者增加了處理成本，而后者會(huì)因操作過(guò)程中不可控的機(jī)械作用或者破碎后產(chǎn)生的細(xì)胞碎片大小不一而影響蛋白回收效果，均存在弊端。有研究通過(guò)共表達(dá)磷脂酶C[15]或者α-溶血素分泌系統(tǒng)和YebF分泌系統(tǒng)[16]能將漆酶從胞內(nèi)分泌至胞外，前者胞外酶活力可達(dá)到1 257.22 U/L而后者可達(dá)2 401.3 U/L。上述研究雖實(shí)現(xiàn)了胞外表達(dá)，但是產(chǎn)量不高。

在細(xì)菌中，核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site，RBS)和其他調(diào)節(jié)性RNA序列是翻譯起始和蛋白質(zhì)表達(dá)的有效控制元件[17]，適當(dāng)調(diào)整RBS序列可以大大提高蛋白質(zhì)的表達(dá)水平[18]。有研究通過(guò)RBS策略組合優(yōu)化了四氫嘧啶合成的3個(gè)途徑酶，將四氫嘧啶的產(chǎn)量提升至521.24 mg/L[19]。源自噬菌體phi X174的裂解蛋白E可以幫助細(xì)胞裂解，原理是通過(guò)在革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜上形成一個(gè)跨膜孔道結(jié)構(gòu)，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)容物會(huì)在滲透壓的作用下從該孔道排出[20]。此時(shí)，細(xì)菌會(huì)變成不含核酸、核糖體及其他內(nèi)容物的空殼，能有效實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)酶的胞外生產(chǎn)。

本研究將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)來(lái)源的漆酶CotA表達(dá)于E.coliBL21(DE3)，通過(guò)核糖體結(jié)合位點(diǎn)、誘導(dǎo)表達(dá)條件及共表達(dá)裂解蛋白，顯著提高了CotA的分泌表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株E.coliJM109，E.coliBL21(DE3)和質(zhì)粒pCDF Duet-E保存于本研究室。委托蘇州金唯智公司按照E.coli密碼子偏好性將漆酶CotA(Accession WP_003243170.1)合成于載體pET24a中，宿主為E.coliJM109。

1.1.2 試劑

柱回收試劑盒，Thermo fisher公司；大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒、Prime STAR Max DNA聚合酶，大連TaKaRa公司；卡那霉素、質(zhì)粒提取試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、ABTS，上海生工生物工程(上海)股份有限公司；一步克隆試劑盒，南京諾唯贊公司；酵母粉、胰蛋白胨，英國(guó)OXOID公司；蛋白marker，上海翊圣生物公司；蛋白電泳Loading buffer、Bis-Tris 預(yù)制凝膠，Invitrogen 公司。其他常規(guī)試劑及藥品為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分裝。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，瓊脂粉20，自然pH。

LB液體種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，自然pH。

TB液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母粉24，丙三醇5，KH2PO42.31，K2HPO412.54，自然pH。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)漆酶重組菌株的構(gòu)建與表達(dá)

委托蘇州金唯智公司按照E.coli密碼子偏好性合成CotA(Accession WP_003243170.1)，所用載體為pET24a，宿主為E.coliJM109。將菌株E.coliJM109/pET24a-CotA接種至含有卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中37 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)12 h后，按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒pET24a-CotA，將漆酶表達(dá)質(zhì)粒pET24a-CotA轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)，得到重組菌株CotA-RBS。將CotA-RBS接種于含有卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，按照2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)接種量接種于TB培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)至OD600約為0.8時(shí)，加入1 mmol/L Cu2+和0.1 mmol/L IPTG，20 ℃，220 r/min條件下繼續(xù)發(fā)酵至28 h。定時(shí)取樣測(cè)定酶活力和OD600，將最高酶活力對(duì)應(yīng)的樣品處理后進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證。

1.2.2 重組RBS菌株的構(gòu)建與表達(dá)

基于在線軟件RBS Calculator和RBS Library Calculator(https://www.denovodna.com/software/)預(yù)測(cè)具有不同翻譯起始效率的RBS序列(表1)。以pET24a-CotA為模板，采用一步克隆法將質(zhì)粒pET24a-CotA上原始RBS序列替換成所選RBS序列，按照表2所示引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)34次；最后72 ℃延伸10 min。得到擴(kuò)增片段后回收純化，步驟參考柱回收說(shuō)明書(shū)。將經(jīng)過(guò)純化的片段轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞E.coliJM109中，挑取3～5個(gè)轉(zhuǎn)化子送公司進(jìn)行驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的菌株重新活化培養(yǎng)12 h后，參考質(zhì)粒提取說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pET24a-CotA-RBS1、pET24a-CotA-RBS2、pET24a-CotA-RBS3、pET24a-CotA-RBS4和pET24a-CotA-RBS5。

表1 本研究所選RBS序列Table 1 The sequence of selected RBS in this study

表2 本研究所用引物Table 2 The primers used in this study

將各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中，構(gòu)成重組RBS替換菌株CotA-RBS1、CotA-RBS2、CotA-RBS3、CotA-RBS4和CotA-RBS5。將重組菌株CotA-RBS和各重組RBS替換菌株劃線至含有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中活化，按照2%接種量轉(zhuǎn)接至TB發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)至OD600約為0.8時(shí)，依次加入終濃度為1 mmol/L Cu2+和0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在20 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)20 h后取樣測(cè)定胞內(nèi)酶活力，確定最優(yōu)RBS替換菌株。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化誘導(dǎo)條件

為了進(jìn)一步提高重組漆酶的表達(dá)水平，以誘導(dǎo)OD600、發(fā)酵溫度、IPTG誘導(dǎo)濃度和Cu2+添加濃度為因素，設(shè)計(jì)如表3所示正交實(shí)驗(yàn)表。在正交實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)酵CotA-RBS5并比較不同條件對(duì)酶表達(dá)水平的影響。通過(guò)計(jì)算各條件下的k值和極差R，確定影響CotA表達(dá)的關(guān)鍵因素及最佳誘導(dǎo)條件。

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experimental test

1.2.4 共同表達(dá)裂解蛋白E釋放胞內(nèi)酶

為促進(jìn)漆酶的胞外生產(chǎn)，將裂解蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCDF Duet-E與pET24a-CotA-RBS5共同轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中，得到重組共表達(dá)菌株CotA-RBS5-E。利用最優(yōu)誘導(dǎo)條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。分別發(fā)酵至不同OD600時(shí)加入終濃度為2 mmol/L的阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)裂解蛋白E，定時(shí)取樣測(cè)定胞外酶活力和OD600。

1.2.5 漆酶活性測(cè)定

漆酶活性測(cè)定采用ABTS法：總體系為3 mL，將100 mmol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.5)和底物1 mmol/L ABTS放入30 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min后向石英比色皿中依次加入2.4 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.5)、0.1 mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液及0.5 mL底物ABTS。每分鐘氧化1 μmol底物ABTS所需要的酶含量為一個(gè)漆酶活力單位(U)。酶活力按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：ΔOD/Δt,每分鐘吸光值的變化；ε,顯色物的摩爾消光系數(shù)L/(mmol·cm)。底物ABTS在420 nm處的摩爾消光系數(shù)為ε=36 L/(mmol·cm)。

1.2.6 SDS-PAGE電泳分析

發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min后的上清液即為胞外可溶部分，菌體部分用檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(pH 6.0)重懸進(jìn)行超聲波破壁，超聲波細(xì)胞破碎儀工作條件為：超聲波2 s, 暫停4 s，總時(shí)長(zhǎng)5 min。將破碎后的樣品低溫高速離心20 min，上清液即為重組菌株胞內(nèi)可溶部分，菌體沉淀為胞內(nèi)不溶部分，沉淀用檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(pH 6.0)重懸，將所有樣品進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳驗(yàn)證。蛋白樣品上樣量為30 μL，V(蛋白樣品上樣量)∶V(4×SDS蛋白上樣緩沖液)=3∶1混合、95 ℃煮沸15 min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，設(shè)置恒壓120 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)漆酶重組菌株的構(gòu)建與表達(dá)

基于E.coli密碼子偏好性合成漆酶CotA(Accession WP_003243170.1)基因，并克隆至pET24a的RBS序列之后，得到表達(dá)質(zhì)粒pET24a-CotA(圖1)。

圖1 漆酶表達(dá)質(zhì)粒pET24a-CotAFig.1 The plasmid pET24a-CotA expressed for laccase

將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中得到產(chǎn)漆酶重組菌株CotA-RBS。為探究漆酶CotA的表達(dá)情況，設(shè)定基本誘導(dǎo)條件為：誘導(dǎo)起始OD6000.8，誘導(dǎo)劑IPTG終濃度0.1 mmol/L，Cu2+添加終濃度1 mmol/L，20 ℃、220 r/min條件下發(fā)酵28 h，測(cè)定其發(fā)酵過(guò)程曲線。如圖2-a所示，隨著細(xì)胞密度的增加，胞內(nèi)酶活力不斷升高；發(fā)酵20 h，酶活力達(dá)到最大(449 U/L)。SDS-PAGE分析顯示，胞內(nèi)可溶和不溶部分均有CotA條帶(理論量58.5 kDa)，且胞內(nèi)不溶部分條帶明顯粗于可溶部分(圖2-b)。上述結(jié)果表明，CotA在E.coli成功表達(dá)，但大部分以包涵體形式存在。大量的研究表明，翻譯速率過(guò)快導(dǎo)致酶分子錯(cuò)誤折疊是包涵體形成的首要原因。本研究采用了T7強(qiáng)啟動(dòng)子及其RBS，可能使CotA的轉(zhuǎn)錄和翻譯均處于較高水平。此外，Cu2+有助于漆酶的折疊與組裝[21]。重組菌采用的發(fā)酵培養(yǎng)基中的Cu2+濃度并不高(1 mmol/L)。因此，進(jìn)一步優(yōu)化RBS序列及誘導(dǎo)表達(dá)條件將有助于CotA的活性表達(dá)。

a-發(fā)酵過(guò)程曲線;b-SDS-PAGE驗(yàn)證圖2 重組菌株CotA-RBS的表達(dá)情況分析Fig.2 Expression analysis of the recombinant strain CotA-RBS

2.2 重組RBS替換菌株的構(gòu)建與表達(dá)

蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程的速率主要由翻譯起始速率和翻譯延伸速率決定，其中起始速率主要受mRNA上的RBS序列、起始密碼子及翻譯起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)影響[22]。為了進(jìn)一步提高漆酶的表達(dá)水平，對(duì)RBS序列進(jìn)行優(yōu)化，探究不同翻譯起始速率對(duì)表達(dá)水平的影響。在T7啟動(dòng)子和CotA序列條件下，在線軟件RBS Calculator推薦的RBS序列(RBS1)的翻譯起始速率是原始RBS序列(RBS0)的87.2倍(表1)。在上述同樣的鄰近序列條件下，RBS Library Calculator共推薦具有不同翻譯起始速率的364個(gè)RBS序列。為提高所選RBS序列的代表性，基于翻譯起始速率將上述RBS序列分為4組(160 000～100 000、100 000～50 000、50 000～10 000、10 000～0)，依次選取RBS2、RBS3、RBS4和RBS5進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證(表1)。構(gòu)成重組RBS替換菌株后測(cè)定胞內(nèi)漆酶的表達(dá)水平。如圖3所示，重組菌株胞內(nèi)CotA-RBS5較出發(fā)菌株的449 U/L提高了1.75倍，達(dá)到1 236 U/L，而其他翻譯起始速率高于出發(fā)菌株的重組菌株的胞內(nèi)酶活力均有不同程度的降低。上述結(jié)果表明，較低的翻譯起始速率有利于漆酶的高效表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中，過(guò)高的翻譯起始速率可能降低核糖體與mRNA翻譯起始區(qū)域結(jié)合的穩(wěn)定性[23]。此外，高的翻譯起始速率還會(huì)導(dǎo)致后續(xù)翻譯過(guò)程中核糖體之間發(fā)生碰撞的概率提高，引起核糖體脫落及表達(dá)效率下降[23]。因此，在后續(xù)工作中將進(jìn)一步分析比RBS5翻譯起始速率更低或者接近的RBS對(duì)漆酶表達(dá)水平的影響。

RBS0-出發(fā)菌株CotA-RBS胞內(nèi)酶；RBS1-CotA-RBS1胞內(nèi)酶； RBS2-CotA-RBS2胞內(nèi)酶；RBS3-CotA-RBS3胞內(nèi)酶； RBS4-CotA-RBS4胞內(nèi)酶；RBS5-CotA-RBS5胞內(nèi)酶圖3 重組RBS替換菌株胞內(nèi)可溶部分酶活力Fig.3 The intracellular soluble enzyme activity of recombinant strains with RBS substitutions

2.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化誘導(dǎo)條件提高漆酶表達(dá)水平

誘導(dǎo)條件優(yōu)化是有效提高蛋白表達(dá)的策略之一。選擇合適的起始誘導(dǎo)OD600、發(fā)酵溫度和IPTG添加濃度可以幫助減少包涵體的生成，Cu2+作為輔助因子可以幫助激發(fā)漆酶活性[24]。為進(jìn)一步提高重組菌株胞內(nèi)酶的表達(dá)水平，對(duì)24 h時(shí)各組胞內(nèi)酶活力的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，分別計(jì)算各因素下的k值和極差R，確定最佳誘導(dǎo)條件。如表4所示，Cu2+濃度、誘導(dǎo)OD600、發(fā)酵溫度和IPTG濃度對(duì)CotA表達(dá)的影響依次降低，Cu2+添加濃度的極差R遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他影響因素的極差。所有添加2 mmol/L Cu2+濃度的實(shí)驗(yàn)組胞內(nèi)酶活力均高于其他相同IPTG添加濃度、發(fā)酵溫度或者起始誘導(dǎo)OD600的實(shí)驗(yàn)組，說(shuō)明Cu2+添加濃度對(duì)CotA胞內(nèi)表達(dá)水平的影響最大。證實(shí)了Cu2+是漆酶催化中心的重要組成部分，Cu2+的存在有助于漆酶的折疊與組裝[21]，其作為輔助因子可激發(fā)漆酶的活性[24]。

表4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Table 4 Results of the orthogonal experimental test

由圖4可知，最佳的誘導(dǎo)條件組合為誘導(dǎo)起始OD600為0.8，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L，Cu2+添加濃度為2 mmol/L，發(fā)酵溫度為30 ℃。在此條件下，胞內(nèi)酶活力可達(dá)到7 926 U/L，較未優(yōu)化前(1 236 U/L)提高了5.4倍。

圖4 重組菌株CotA-RBS5正交實(shí)驗(yàn)胞內(nèi)酶活力Fig.4 The intracellular activity of the orthogonal experimental test of recombinant strain CotA-RBS5

為探究誘導(dǎo)條件和RBS對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及漆酶胞外生產(chǎn)的影響。基于此，我們對(duì)比了重組菌株CotA-RBS和CotA-RBS5誘導(dǎo)條件優(yōu)化前后的細(xì)胞生長(zhǎng)和胞外酶活力情況。由圖5可知，替換最優(yōu)RBS和優(yōu)化誘導(dǎo)條件均會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。誘導(dǎo)條件優(yōu)化前，CotA-RBS和CotA-RBS5僅在發(fā)酵32 h后產(chǎn)生胞外漆酶(圖5-a和圖5-c)。誘導(dǎo)條件優(yōu)化后，CotA-RBS和CotA-RBS5胞外酶活力分別提前至發(fā)酵24 h和10 h。其中，重組菌株CotA-RBS5發(fā)酵24 h胞外漆酶活力達(dá)到最大值(4 984 U/L)，比CotA-RBS高117.6倍(圖5-b和圖5-d)。值得注意的是，CotA并沒(méi)有融合分泌信號(hào)，且相同誘導(dǎo)條件下CotA-RBS5的菌體生長(zhǎng)明顯低于CotA-RBS。因此，在優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件下CotA-RBS5細(xì)胞可能發(fā)生了裂解，使胞內(nèi)的CotA釋放至胞外。大量的研究表明，外源基因的過(guò)量表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成脅迫甚至裂解[25]。如圖3和圖4所示，RBS及誘導(dǎo)條件優(yōu)化均提高了胞內(nèi)的CotA表達(dá)水平。因此，較高的CotA胞內(nèi)表達(dá)水平導(dǎo)致了CotA-RBS5細(xì)胞的裂解。

a-重組菌株CotA-RBS發(fā)酵條件優(yōu)化前；b-重組菌株CotA-RBS發(fā)酵條件優(yōu)化后； c-重組菌株CotA-RBS5發(fā)酵條件優(yōu)化前；d-重組菌株CotA-RBS5發(fā)酵條件優(yōu)化后圖5 重組菌株CotA-RBS和CotA-RBS5胞外酶活力和OD600Fig.5 The extracellular activity and OD600 of recombinant strains CotA-RBS and CotA-RBS5

2.4 共表達(dá)裂解蛋白E促進(jìn)漆酶的胞外生產(chǎn)

為簡(jiǎn)化下游分離提取過(guò)程，更好地實(shí)現(xiàn)漆酶的胞外生產(chǎn)，探索含有噬菌體裂解蛋白E的重組菌CotA-RBS5-E的誘導(dǎo)表達(dá)條件，考察細(xì)胞裂解對(duì)漆酶胞外生產(chǎn)的影響。向感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中共同轉(zhuǎn)化裂解蛋白E表達(dá)質(zhì)粒pCDF Duet-E(圖6)和RBS優(yōu)化后的漆酶表達(dá)質(zhì)粒pET24a-CotA-RBS5，構(gòu)成重組菌株CotA-RBS5-E。

在優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件下，分別培養(yǎng)至OD600=3.0、3.5和4時(shí)(分別對(duì)應(yīng)圖7-b～圖7-d)時(shí)加入終濃度為2 mmol/L的阿拉伯糖，在30 ℃、220 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定OD600、胞外可溶部分酶活力。漆酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，加入阿拉伯糖開(kāi)始誘導(dǎo)裂解蛋白E后，胞外很快能檢測(cè)到漆酶活性。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，除較早開(kāi)始誘導(dǎo)(OD600=3時(shí)誘導(dǎo))的重組菌株的OD600先上升后下降外(圖7-b)，其他實(shí)驗(yàn)組的OD600均很快下降并最終維持穩(wěn)定；胞外漆酶活性由急至緩上升，幅度明顯，說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生裂解，裂解蛋白E成功發(fā)揮作用。當(dāng)OD600=3.5時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)裂解蛋白，重組菌CotA-RBS5-E發(fā)酵至30 h時(shí)，胞外酶活力達(dá)到最高(10 283 U/L)，是對(duì)照組(5 695 U/L)的1.8倍。由此可知，共表達(dá)裂解蛋白E可以使細(xì)胞裂解作用加強(qiáng)，促進(jìn)漆酶的胞外生產(chǎn)。

圖6 裂解蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCDF-Duet-EFig.6 The plasmid pCDF-Duet-E expressed for lysis protein

a-對(duì)照組；b-OD600=3；c-OD600=3.5；d-OD600=4圖7 不同OD600時(shí)誘導(dǎo)裂解蛋白后胞外CotA活性及OD600分析Fig.7 The analysis of extracellular activity and OD600 after inducing lysis protein at different OD600

為進(jìn)一步探究RBS優(yōu)化、誘導(dǎo)條件優(yōu)化和裂解蛋白E對(duì)胞內(nèi)酶的表達(dá)和裂解效率的影響，測(cè)定發(fā)酵至20 h時(shí)各個(gè)樣品中胞內(nèi)外漆酶的分布情況。如圖8所示，誘導(dǎo)條件優(yōu)化前后出發(fā)菌株CotA-RBS均僅在胞內(nèi)產(chǎn)酶且優(yōu)化效果不明顯，替換最優(yōu)RBS后若不經(jīng)誘導(dǎo)條件優(yōu)化，重組菌株CotA-RBS5僅在胞內(nèi)產(chǎn)酶。經(jīng)誘導(dǎo)條件優(yōu)化后，胞外可檢測(cè)到漆酶活性，占總酶活力比例約為27%，說(shuō)明需要在最優(yōu)RBS和誘導(dǎo)條件的共同作用下，細(xì)胞才會(huì)提前發(fā)生破裂釋放胞內(nèi)酶。通過(guò)共表達(dá)裂解蛋白E，胞外酶的占比大幅提高。其中，OD600=4時(shí)誘導(dǎo)裂解蛋白E的裂解效率最高，可達(dá)93%，說(shuō)明在裂解蛋白E的作用下，細(xì)胞破裂的程度加劇，胞內(nèi)酶的釋放作用加強(qiáng)。此外，誘導(dǎo)裂解蛋白的時(shí)間也是影響細(xì)胞產(chǎn)酶的重要因素，過(guò)早或者過(guò)晚誘導(dǎo)，體系中的總酶活力會(huì)有不同程度的下降。推測(cè)可能是由于過(guò)早誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在密度不夠充足的情況下發(fā)生裂解作用，影響細(xì)胞的積累進(jìn)而漆酶總產(chǎn)量低；過(guò)晚誘導(dǎo)時(shí)，裂解蛋白表達(dá)量較多，細(xì)胞裂解過(guò)度致使細(xì)胞生長(zhǎng)情況變差，不利于后期胞內(nèi)酶的產(chǎn)生與積累。

a-誘導(dǎo)條件優(yōu)化前;b-誘導(dǎo)條件優(yōu)化后;c-誘導(dǎo)條件優(yōu)化后，CotA-RBS5和CotA-RBS5-E在不同OD600誘導(dǎo)裂解蛋白E圖8 發(fā)酵20 h時(shí)各樣品胞內(nèi)和胞外CotA酶活力分析情況Fig.8 Activity analysis of intracellular and extracellular CotA in each sample when fermented at 20 h

3 結(jié)論

大腸桿菌作為常用的原核表達(dá)系統(tǒng)之一，擁有周期短、成本低、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，常被用來(lái)異源表達(dá)漆酶蛋白，然而漆酶在大腸桿菌宿主中常常以胞內(nèi)酶的形式出現(xiàn)，無(wú)法分泌至胞外，往往需要通過(guò)破壁的手段得到目的蛋白，增加了下游分離提取的成本。本研究成功通過(guò)RBS序列優(yōu)化，將胞內(nèi)CotA從449 U/L提升至1 236 U/L。利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定了最佳誘導(dǎo)條件為細(xì)胞培養(yǎng)至OD600約為0.8時(shí)加入終濃度為2 mmol/L Cu2+和0.1 mmol/L IPTG，于30 ℃繼續(xù)誘導(dǎo)，并確定了Cu2+在發(fā)酵過(guò)程中起到了激發(fā)漆酶活性的關(guān)鍵性作用。最佳誘導(dǎo)條件下，胞外CotA酶活力可達(dá)7 926 U/L，較優(yōu)化前提升了5.4倍；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)降低翻譯起始速率和優(yōu)化誘導(dǎo)條件，細(xì)胞提前裂解，胞內(nèi)酶釋放至胞外，胞外酶活力可達(dá)4 984 U/L。最后，通過(guò)共表達(dá)裂解蛋白E，促進(jìn)了細(xì)胞裂解，提高了胞外酶的產(chǎn)量，在菌體濃度OD600達(dá)到3.5時(shí)誘導(dǎo)裂解蛋白E表達(dá)，胞外CotA酶活力在發(fā)酵30 h達(dá)到10 283 U/L。研究結(jié)果為漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。