捕食扶桑綿粉蚧的異色瓢蟲(chóng)腸道菌群分析

高 萍，王巖松，郭龍秀，李保平

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095）

昆蟲(chóng)腸道中存在大量的微生物[1]，這些微生物群落對(duì)宿主昆蟲(chóng)有重要作用，主要包括抵御外來(lái)病原菌侵襲、參與多重營(yíng)養(yǎng)關(guān)系、引起昆蟲(chóng)免疫反應(yīng)等[2-4]。共生菌可為宿主昆蟲(chóng)提供多種必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括一些常見(jiàn)維生素、特殊的固醇和大多數(shù)氨基酸等[5-7]。此外，腸道共生菌也能增強(qiáng)昆蟲(chóng)種間和種內(nèi)交流[8,9]。環(huán)境因素特別是食物資源對(duì)昆蟲(chóng)腸道微生物組成發(fā)揮著重要作用[10,11]。目前，關(guān)于宿主的食物對(duì)微生物群落組成的影響有三個(gè)假說(shuō)：（1）微生物具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，取食后不會(huì)影響腸道菌群結(jié)構(gòu)[12]；（2）獵物體內(nèi)的微生物被取食后在捕食者腸道中定殖[13]；（3）取食獵物后宿主腸道的物理化學(xué)條件改變可能導(dǎo)致環(huán)境衍生微生物類(lèi)群重構(gòu)，這類(lèi)微生物可能是來(lái)自于獵物或是原本存在于宿主體內(nèi)且含量較低[14]。迄今，雖有這些假說(shuō)得到某些實(shí)證研究支持，但尚需更多證據(jù)。

異色瓢蟲(chóng)Harmonia axyridis(Pallas)（鞘翅目Coleoptera：瓢蟲(chóng)科Coccinellidae）對(duì)蚜蟲(chóng)、葉螨、介殼蟲(chóng)、粉蚧等重要害蟲(chóng)具有很強(qiáng)的捕食能力，作為一種重要的生防天敵, 不僅在原產(chǎn)地東亞的農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，而且被引入北美和歐洲防治蚜蟲(chóng)[15,16]。近年來(lái)，異色瓢蟲(chóng)腸道微生物菌群開(kāi)始得到關(guān)注。Dudek等[17]研究發(fā)現(xiàn)，異色瓢蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)菌菌群以共生菌為主，且這類(lèi)共生菌在環(huán)境中廣泛分布。Schmidtberg等[18]研究發(fā)現(xiàn)，異色瓢蟲(chóng)消化道中的沙雷氏菌屬Serratia和乳酸菌屬Lactococcus能夠調(diào)節(jié)反射性出血中的信息化學(xué)物質(zhì)合成。目前，尚不清楚長(zhǎng)時(shí)間取食單一獵物對(duì)異色瓢蟲(chóng)腸道菌群有何影響。

本研究旨在探明，當(dāng)異色瓢蟲(chóng)轉(zhuǎn)向取食非本土的扶桑綿粉蚧后，其腸道菌群是否隨之發(fā)生變化。該研究不僅可檢驗(yàn)上述幾個(gè)假說(shuō)，而且可為認(rèn)識(shí)異色瓢蟲(chóng)與共生菌群互作關(guān)系提供基本依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

豌豆修尾蚜于2020年4月采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南京試驗(yàn)地邊的野豌豆Vicia gigantea植株上，采回后在養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)用盆栽蠶豆苗Vicia faba上的豌豆修尾蚜繼代飼養(yǎng)。扶桑綿粉蚧于2018年8月采自浙江省杭州市臨安區(qū)，采回后在養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)用馬鈴薯Solanum tuberosum苗繼代飼養(yǎng)。異色瓢蟲(chóng)于2020年5月采自南京市南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬試驗(yàn)基地內(nèi)的野豌豆上，在養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)用豌豆修尾蚜繼代飼養(yǎng)1代后用于試驗(yàn)。養(yǎng)蟲(chóng)室環(huán)境溫度（26±1）℃，相對(duì)濕度（60±10）%，光周期16L:8D。

1.2 方法

養(yǎng)蟲(chóng)籠（邊長(zhǎng)40 cm的正方形）中放置4～5株有豌豆修尾蚜的蠶豆苗，釋放20頭異色瓢蟲(chóng)成蟲(chóng)，每2～3 d更換1次蠶豆苗，每天收集卵并放入培養(yǎng)皿（直徑6 cm，高1.5 cm）中待幼蟲(chóng)孵化。將剛孵化的1齡幼蟲(chóng)隨機(jī)分為兩個(gè)飼喂處理組：“食蚜蟲(chóng)組”用豌豆修尾蚜飼喂；“食粉蚧組”用扶桑綿粉蚧飼喂。當(dāng)其生長(zhǎng)發(fā)育至成蟲(chóng)20 d后，取單頭瓢蟲(chóng)饑餓24 h后浸泡于75%酒精1 min，隨后用無(wú)菌水清洗蟲(chóng)體表面2～3次，再放置于無(wú)菌的PBS緩沖液中用滅菌的解剖工具在體視鏡下解剖獲得腸道組織，放于體積1.5 mL的離心管中保存于- 80 ℃冰箱中。每個(gè)處理組重復(fù)6頭雌和6頭雄成蟲(chóng)。

1.3 DNA提取及PCR擴(kuò)增

根據(jù)DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒（QIAGEN，Hilden，Germany）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA提取，DNA濃度和純度利用紫外分光光度計(jì)（Nanodrop one，Theromo Scientific）進(jìn)行檢測(cè)，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA 提取質(zhì)量；用 338F 和 806R（338F：3′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-5′；806R：3′-GGACT ACHVGGGTWTCTAAT-5′）引物對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，32個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s），最后72 ℃延伸5 min（PCR儀：TC-96/G/H(b)C型）。擴(kuò)增體系為50 μL，25 μL聚合酶，19 μL無(wú)菌水，4 μL引物，2 μL DNA模板。

用2%瓊脂糖凝膠回收 PCR 產(chǎn)物，利用 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用Synergy2（BioTek，USA）進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù) Illumina MiSeq 平臺(tái)（Illumina，SanDiego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300的文庫(kù)。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

鑒于異色瓢蟲(chóng)雌、雄蟲(chóng)腸道菌群組成近似，將雌、雄蟲(chóng)的測(cè)序數(shù)據(jù)合并后分析。原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用 FLASH 軟件進(jìn)行拼接：（1）設(shè)置 50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開(kāi)始截去后端堿基，去除質(zhì)控后長(zhǎng)度低于50 bp的序列；（2）barcode 需精確匹配，引物允許2個(gè)堿基的錯(cuò)配，去除模糊堿基；（3）根據(jù)重疊堿基 overlap 將兩端序列進(jìn)行拼接，overlap 需大于10 bp。去除無(wú)法拼接的序列。使用的UPARSE 軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/），根據(jù) 97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行 OTU聚類(lèi)；使用 UCHIME軟件剔除嵌合體。利用 RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)葘?duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

采用RDP classifier軟件（version 2.2）的貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并分別在各分類(lèi)階元上統(tǒng)計(jì)物種組成，默認(rèn)置信度閾值為0.7。采用mothur 軟件（version 1.30.1）在OUT水平上計(jì)算食粉蚧組和食蚜蟲(chóng)組的菌群豐富度實(shí)際觀(guān)測(cè)值（Sobs 指數(shù)）、菌群豐富度（Chao指數(shù)）和菌群多樣性（Shannon指數(shù)），此外還根據(jù)Sobs指數(shù)繪制稀釋曲線(xiàn)。用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較Sobs、Chao和Shannon指數(shù)在兩處理組之間的差異，用非參數(shù)Wilcoxon秩和測(cè)驗(yàn)比較兩處理組間的物種差異?；贐ray-Curtis距離算法，用主坐標(biāo)分析（PCoA）比較兩處理間群落組成的相似性，并用Adonis分析（置換999次）對(duì)兩處理進(jìn)行差異性檢驗(yàn)。采用PICRUSt中的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)推測(cè)腸道菌群功能，采用Welch’st測(cè)驗(yàn)比較兩處理間腸道菌群功能的差異。作圖用STAMP軟件（version 2.0.6），數(shù)據(jù)分析用R軟件[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU數(shù)量比較

從取食不同獵物的異色瓢蟲(chóng)24個(gè)腸道樣本中，經(jīng)過(guò)質(zhì)量過(guò)濾和去除嵌合體后，得到848129條高質(zhì)量序列，每條序列平均長(zhǎng)度為427 bp。按照最小樣本數(shù)序列19390進(jìn)行抽平，在97%相似度下將其聚類(lèi)為用于物種分類(lèi)的747個(gè)OTUs（圖1C）。其中，食粉蚧組異色瓢蟲(chóng)腸道菌群OTU為673個(gè)，食蚜蟲(chóng)組異色瓢蟲(chóng)腸道菌群為297個(gè)；兩個(gè)獵物處理組共有OTU為223個(gè)，占29.85%；食粉蚧組異色瓢蟲(chóng)特有OTU為450個(gè)，占60.24%；食蚜蟲(chóng)組瓢蟲(chóng)特有OTU為74個(gè)，占9.91%。

圖1 飼喂不同獵物處理下異色瓢蟲(chóng)成蟲(chóng)的腸道菌群組成Fig. 1 Microbiota composition in the gut of adults feeding on different prey species in H. axyridis

2.2 群落組成比較

總共注釋到23個(gè)門(mén)、54個(gè)綱、138個(gè)目、229個(gè)科、414個(gè)屬和595個(gè)種。在注釋到的23個(gè)門(mén)中，兩處理組共有 16個(gè)門(mén)，豐度較高的依次為變形菌門(mén) Proteobacteria、厚壁菌門(mén) Firmicutes、放線(xiàn)菌門(mén)Actinobacteria、異常球菌門(mén)Deinococcota和擬桿菌門(mén)Bacteroidetes；變形菌門(mén)在兩組瓢蟲(chóng)腸道內(nèi)最為豐盛，在食粉蚧組占比73.15%，在食蚜蟲(chóng)組占比88.75%（圖1A）。食粉蚧組瓢蟲(chóng)有7個(gè)特有門(mén)，食蚜蟲(chóng)組瓢蟲(chóng)沒(méi)有特有門(mén)。

在屬階元水平，兩個(gè)處理組異色瓢蟲(chóng)的腸道菌群出現(xiàn)較大的差異（圖1B）。在共注釋到的414個(gè)屬中，兩處理組共有169個(gè)屬；食粉蚧組有210個(gè)特有屬，食蚜蟲(chóng)組有35個(gè)特有屬；食粉蚧組瓢蟲(chóng)腸道菌群中豐度最高的屬依次為騰沖菌屬Vulcaniibacterium、腸桿菌屬Enterobater、貪銅菌屬Cupriavidus、短芽孢桿菌屬Brevibacillus和葡萄球菌屬Staphylococcus，食蚜蟲(chóng)組中依次是腸桿菌屬、沙雷氏菌屬Serratia、騰沖菌屬、葡萄球菌屬和地芽孢桿菌屬Geobacillus。兩組瓢蟲(chóng)在14個(gè)屬上存在顯著差異（圖1D）。

2.3 菌群多樣性

每個(gè)分析樣品的稀釋曲線(xiàn)都趨于平緩（圖2A），說(shuō)明檢測(cè)到了樣本中絕大多數(shù)微生物類(lèi)群。Sobs豐富度指數(shù)在兩處理組之間存在顯著差異（P＜0.01）：食粉蚧組Sobs指數(shù)（171.20）比食蚜蟲(chóng)組的（112.60）高52%（圖2C）。Chao豐富度指數(shù)在兩處理間有顯著差異（P＜0.01）：食粉蚧組的Chao指數(shù)（188.69）比食蚜組的（135.20）高 40%（圖2D）；Shannon多樣性指數(shù)在兩處理間有顯著性差異（P＜0.01），食粉蚧組的Shannon指數(shù)（2.63）比食蚜蟲(chóng)組的（1.51）高74%（圖2E）。兩處理組異色瓢蟲(chóng)腸道菌群組成表現(xiàn)出明顯的聚類(lèi)（R2＝0.49，P＜0.01）（圖2B）。

圖2 飼喂不同獵物的異色瓢蟲(chóng)腸道菌群的Alpha和Beta多樣性比較Fig. 2 Alpha and Beta diversity of microbiota in the gut of adults feeding on different prey species in H. axyridis

2.4 功能預(yù)測(cè)

食粉蚧組和食蚜蟲(chóng)組異色瓢蟲(chóng)的腸道菌群的功能相似，主要為代謝、環(huán)境信息處理和基因信息處理等，代謝功能主要包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝和能量代謝，其中碳水化合物代謝和氨基酸代謝功能豐度遠(yuǎn)高于其他代謝功能（圖3A，3B）。食粉蚧組和食蚜蟲(chóng)組腸道代謝通路在功能豐度上具有一定差異性，食粉蚧組的代謝功能比食蚜蟲(chóng)組豐度更高，但環(huán)境信息處理功能豐度更低。在代謝功能里，食粉蚧組的氨基酸代謝和能量代謝功能比食蚜蟲(chóng)組豐度更高，但碳水化合物代謝功能豐度更低（圖3A，3B）。

圖3 不同飼喂獵物的異色瓢蟲(chóng)腸道菌群的KEGG功能豐度統(tǒng)計(jì)Fig. 3 Statistics of functional abundances based on the KEGG pathway for gut microbiota of adults feeding on different prey species in H. axyridis

3 討論

本研究總共注釋到23個(gè)門(mén)、54個(gè)綱、138個(gè)目、229個(gè)科、414個(gè)屬和595個(gè)種。取食扶桑綿粉蚧后的異色瓢蟲(chóng)腸道菌群中檢測(cè)出23個(gè)門(mén)、379個(gè)屬、673個(gè)OTU；取食豌豆修尾蚜后的異色瓢蟲(chóng)腸道菌群中檢測(cè)出16個(gè)門(mén)、204個(gè)屬、297個(gè)OTU。比較兩飼喂食物處理的宿主瓢蟲(chóng)菌系組成后發(fā)現(xiàn)，取食扶桑綿粉蚧后出現(xiàn)了新的細(xì)菌階元：7個(gè)門(mén)、210個(gè)屬，并多出2.3倍的OTU。

本研究發(fā)現(xiàn)，異色瓢蟲(chóng)取食扶桑綿粉蚧后腸道菌群在豐富度和多樣性指數(shù)上遠(yuǎn)高于取食豌豆修尾蚜，PCoA聚類(lèi)表明不同處理下的菌群明顯分化，在豐度位居前15的屬中除沙雷氏菌屬外，其余屬的物種差異在兩處理間均有明顯不同，說(shuō)明異色瓢蟲(chóng)取食不同獵物后腸道菌群組成受到了影響。在其他類(lèi)昆蟲(chóng)的研究中也有同樣發(fā)現(xiàn)，例如，植食性茄二十八星瓢蟲(chóng)Epilachna vigintioctopunctata在取食不同植物后，腸道菌群組成發(fā)生明顯變化[20]；食譜可影響德國(guó)小蠊Blattella germanica的腸道菌群組成[21]；灰屋蜘蛛Badumna longinqua腸道菌群在取食果蠅Drosophila hydei和取食灶馬蟋Gryllodes sigillatus后明顯不同[22]。進(jìn)一步對(duì)獵物的菌群分析發(fā)現(xiàn)（未發(fā)表），扶桑綿粉蚧的菌群的豐富度和多樣性指數(shù)顯著高于豌豆修尾蚜，與取食不同獵物后異色瓢蟲(chóng)腸道菌群多樣性的結(jié)果類(lèi)似。豌豆修尾蚜的原生共生菌Buchnera占優(yōu)，這和其他蚜蟲(chóng)類(lèi)似[23-26]。而扶桑綿粉蚧的優(yōu)勢(shì)屬為Candidatus tremblaya，這和其他學(xué)者對(duì)扶桑綿粉蚧的研究一致[27-29]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，從異色瓢蟲(chóng)腸道組織中并沒(méi)有檢測(cè)到在扶桑綿粉蚧和豌豆修尾蚜體內(nèi)占優(yōu)勢(shì)的微生物類(lèi)群，這說(shuō)明扶桑綿粉蚧和豌豆修尾蚜能夠塑造異色瓢蟲(chóng)的腸道菌群，但獵物菌群并沒(méi)有水平傳播定殖到異色瓢蟲(chóng)體內(nèi)。推測(cè)異色瓢蟲(chóng)腸道菌群不同的原因，可能與取食扶桑綿粉蚧和豌豆修尾蚜后引起自身生理代謝的變化致使腸道菌群組成發(fā)生變化所致。但這一推測(cè)仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

腸道菌群參與宿主生理代謝活動(dòng)，包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝和環(huán)境信息處理等。本研究發(fā)現(xiàn)，食粉蚧組瓢蟲(chóng)菌群的氨基酸代謝和能量代謝功能比食蚜蟲(chóng)瓢蟲(chóng)的豐度更高，而行使碳水化合物代謝功能的豐度較低。昆蟲(chóng)在遇到食物缺乏、營(yíng)養(yǎng)匱乏以及某些食物不能消化等問(wèn)題時(shí)，昆蟲(chóng)體內(nèi)的共生菌則可以直接或間接地為宿主昆蟲(chóng)的生存提供必需氮源、氨基酸、甾醇類(lèi)和B族維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[30]。在橘臀紋粉蚧Planococcus citri(Risso)體內(nèi)氨基酸代謝功能是由嵌套菌Candidatus moranella endobia和C.tremblaya princeps共同參與[31,32]。厚壁菌門(mén)參與能量吸收，該類(lèi)微生物的增加能夠影響捕食者從獵物中獲取能量[33]。而環(huán)境信息功能很大程度是由寄主提供，因?yàn)閮?nèi)共生菌生存環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定[34]。異色瓢蟲(chóng)腸道菌群的具體功能有待進(jìn)一步解析。

本研究結(jié)果說(shuō)明，腸道菌群可能在其宿主異色瓢蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)生態(tài)學(xué)中發(fā)揮著重要的作用。這意味著瓢蟲(chóng)腸道菌群可快速響應(yīng)食物的變化，從而賦予該瓢蟲(chóng)對(duì)環(huán)境表現(xiàn)出很強(qiáng)的適應(yīng)性，不僅在原產(chǎn)地廣泛分布且在群落中占優(yōu)勢(shì)地位，而且成功入侵北美洲和歐洲。對(duì)此，有必要開(kāi)展進(jìn)一步深入研究。