海馬N-乙基馬來酰亞胺敏感因子在腸易激綜合征大鼠中的作用 *

腸易激綜合征 (irritable bowel syndrome, IBS)是臨床常見病與多發(fā)病，病人常伴有腹部疼痛和排便習(xí)慣的改變，且反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。一般認為內(nèi)臟痛覺敏化是腸易激綜合征的主要原因，其發(fā)病機制復(fù)雜且不明確

，臨床亦缺乏有效的治療方法，加重了病人及社會的醫(yī)療負擔(dān)。痛覺敏化有外周敏化和中樞敏化兩種機制，中樞敏化是脊髓或脊髓上位傷害性感覺神經(jīng)元對外周刺激過度興奮或過度反應(yīng)的狀態(tài)以致其突觸傳遞效能發(fā)生持久性改變。研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸受體、γ- 氨基丁酸受體和瞬時感受器電位香草酸亞型1 通道等多種離子通道和受體參與慢性內(nèi)臟痛的中樞敏化，尤其是谷氨酸能突觸傳遞的異常激活，是慢性疼痛中樞敏化的重要機制

。離子型谷氨酸受體AMPA 受體 (alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors, AMPAR

) 可介導(dǎo)快速興奮性突觸傳遞，在痛覺傳遞和突觸可塑性中發(fā)揮著重要作用，但具體機制還有待闡明

。

N-乙基馬來酰亞胺敏感因子(N-ethylmaleimide sensitive factor, NSF) 是ATP 酶AAA 家族的主要成員，在細胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運神經(jīng)肽類激素或突觸后膜神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，NSF 可改變突觸后AMPA 受體的分布；神經(jīng)元的細胞內(nèi)灌注合成肽可競爭NSF 和AMPA 受體亞基之間的相互作用，并降低微小興奮性突觸后電位的幅值

。我們前期研究發(fā)現(xiàn)IBS 大鼠海馬突觸可塑性增強及AMPA 受體表達增高

，推測海馬NSF 可能通過調(diào)控AMPA 受體在慢性內(nèi)臟痛中樞敏化中起著重要作用。本研究擬以IBS 模型大鼠為研究對象，通過在體與離體腦片實驗探討海馬NSF 在IBS 大鼠中的作用及其機制，為IBS 臨床治療提供新的思路。

方 法

1. 實驗材料

實驗動物：清潔級新生SD 大鼠，福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供 [實驗動物許可證號：SCXK（閩）2012-0001]。所有操作及動物處理均嚴(yán)格遵循相關(guān)動物保護及使用規(guī)定，并已通過福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批編號：2017-027）。

97 S7-200型PLC在破碎系統(tǒng)中的生產(chǎn)應(yīng)用 ………………………………………………………… 林 斌

實驗儀器：動物麻醉機（USA Matrx 公司）；RM6240 多道生理記錄儀（成都儀器廠）；腦立體定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；電泳槽（北京市六一儀器廠）；電泳轉(zhuǎn)膜儀（北京市六一儀器廠）；解剖顯微鏡（77001，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；微電極操縱儀（MX160L，成都儀器廠）；微電極放大器（SWF-2W，成都儀器廠）。

（3）NSF 抑制劑pep2m 對IBS 大鼠腹外斜肌放電活動的影響

2. 實驗方法

腹外斜肌放電檢測：用異氟烷將大鼠誘導(dǎo)麻醉后，將結(jié)直腸加壓氣囊浸少量甘油插入大鼠肛門，固定于手術(shù)臺上，氣囊導(dǎo)管的另一端與一“T”型三通管連接，三通管另外兩端分別連接血壓計及注射器。將銀絲雙極電極插入腹股溝韌帶上方、距中線1.5 cm 的一側(cè)腹外斜肌上，調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)漠惙槁樽韯┝?，使大鼠處于淺麻醉狀態(tài)，通過對大鼠結(jié)直腸擴張 (colorectal distension, CRD) 予以加壓，壓力梯度分別為40 mmHg 和60 mmHg，每次加壓10 s，休息4 min，用RM6240 多道生理信號采集處理系統(tǒng)記錄在不同CRD 壓力下大鼠腹外斜肌放電活動。通過與正常對照組大鼠的腹外斜肌放電幅值的比較分析，腹外斜肌放電幅值高于正常對照組20%為造模成功IBS 大鼠，篩選出內(nèi)臟痛覺敏化的大鼠即IBS 大鼠進行后續(xù)實驗。

海馬定位及微量注射：大鼠56 只，模型組及對照組各28 只，模型組及對照組均根據(jù)海馬注射藥物的濃度分為溶劑組、100 μM pep2m 組、200 μM pep2m 組和400 μM pep2m 組，每組7 只。用異氟烷將大鼠麻醉后俯臥位，固定于大鼠腦立體定位儀上，頂部正中切口，顯露前囟，根據(jù)大鼠腦圖譜進行定位。參照Paxinos&Watson 大鼠腦圖譜，向海馬兩側(cè)CA1 區(qū) (AP -4.0 mm，RL +/-2.5 mm，H 2.5 mm) 插入內(nèi)徑為0.35 mm、外徑為0.65 mm 的不銹鋼金屬外套管。雙側(cè)海馬CA1 區(qū)微量注射給予NSF 抑制劑pep2m 三個劑量組 (100 μM、200 μM 和400 μM) 及20%乙腈對照組，每側(cè)海馬給藥量為2 μl，給藥前后腹外斜肌放電檢測。實驗后海馬微量注射5%溴酚蘭溶液后處死，取腦行冠狀切片觀察套管軌跡，定位不準(zhǔn)確者棄去。

1）入院護理。接診護士面帶微笑迎接新患者，同時進行自我介紹，給家屬及患者留下良好的印象，建立良好的護患關(guān)系。備好床單元，護送患者至床前，通知醫(yī)生查看患者。向患者及家屬介紹責(zé)任醫(yī)生及責(zé)任護士，介紹病區(qū)環(huán)境，消除患者的陌生感，同時完成入院時身高、體重及生命體征的監(jiān)測，期間應(yīng)了解患者的主訴、癥狀、心理狀態(tài)，具有同理心，根據(jù)患者的需求提供需要。

海馬蛋白樣品的制備：用異氟烷深麻醉大鼠后斷頭，取出完整的海馬組織放入研磨器中，倒入液氮研碎，按照每10 mg 組織加入100 μl 裂解的比例加入裂解液迅速研磨，移至1.5 ml EP 管中冰上放置30 min。4℃，12,000 r/min，離心10 min，取上清液分裝于0.5 ml EP 管中，BCA 法測定蛋白濃度。

Western blot 結(jié)果顯示，對照組大鼠pep2m 灌流海馬腦片組（給藥組）GluR2 的相對光密度比值(0.93±0.15)與未給藥組(1.25±0.13)相比無顯著性差異（

＜ 0.05，見圖6）；IBS 大鼠給藥組GluR2 的相對光密度比值(0.69±0.12)與未給藥組(1.51±0.17)相比顯著降低（

＜ 0.05，見圖6），此結(jié)果提示pep2m 可抑制IBS 模型大鼠海馬GluR2的表達。

一個正常的社會不該總是在好人遭遇惡人時束縛好人而放縱壞人。昆山“反殺案”撤案是對這一現(xiàn)象的有效扭轉(zhuǎn)，是對公民同違法犯罪說不的極大鼓勵，它讓社會更有正氣、公眾更有力量、善良正直的人更有底氣和勇氣。

Western blot 結(jié)果顯示，對照組大鼠和IBS 大鼠海馬NSF 的光密度值的相對比值分別為0.73±0.04和1.01±0.05 (

= 3)，IBS 大鼠海馬NSF 的表達較對照組大鼠顯著增加（

＜ 0.05，見圖2）。

3. 統(tǒng)計學(xué)分析

IBS 慢性功能性內(nèi)臟痛大鼠模型的建立

：SD乳鼠在出生后第3 天至第21 天，每日固定時間給予一次母嬰分離刺激（不同籠、不同室），每只幼鼠分隔于單獨的小隔間里3 h。正常飼養(yǎng)至第8 周，選體重220 g 左右的雄鼠開始進行實驗。模型組和對照組大鼠各45 只。

結(jié) 果

1. IBS 模型大鼠內(nèi)臟痛覺敏化

采用新生期母嬰分離建立IBS 模型大鼠，待大鼠成年（8 周）后，IBS 大鼠在40 mmHg、60 mmHg CRD 壓力下腹外斜肌放電幅值顯著高于對照組大鼠（

＜ 0.05，見圖1），提示大鼠在新生期時給予母嬰分離應(yīng)激可致其成年后出現(xiàn)內(nèi)臟痛覺敏化。

今年是HK IWSC的十周年，大賽在參賽數(shù)量以及評審團隊的規(guī)模都錄得破紀(jì)錄的數(shù)字。今年共有35個國家（逾500個法定產(chǎn)區(qū)）參賽，而大賽亦匯聚了破紀(jì)錄60 位亞洲各地的頂級評委。HK IWSC十周年另一重點是全新推出的“Green Wine Award綠色葡萄酒獎”-表彰致力于可持續(xù)發(fā)展的優(yōu)質(zhì)葡萄酒、烈酒及清酒（獲得金獎和項目大獎的得獎酒）。

二是進一步加大工作指導(dǎo)力度，利用全區(qū)統(tǒng)籌整合涉農(nóng)資金專題培訓(xùn)班和全區(qū)財政支農(nóng)政策培訓(xùn)班等培訓(xùn)方式，不斷提高基層工作水平。

2. 海馬NSF 參與IBS 大鼠內(nèi)臟痛覺中樞敏化

（1）IBS 大鼠海馬NSF 的表達增強

第二，管理者特質(zhì)會對企業(yè)內(nèi)部控制要素的執(zhí)行效果產(chǎn)生相應(yīng)的影響。尤其是在風(fēng)險評估、管控過程中，管理者特質(zhì)會影響管理者風(fēng)險識別過程和應(yīng)對能力，且會考驗企業(yè)內(nèi)部經(jīng)營對環(huán)境的適應(yīng)性。

離體海馬腦片的制備及NSF 抑制劑pep2m 對離體海馬腦片的干預(yù)：大鼠12 只，模型組及對照組各6 只。10%水合氯醛麻醉后斷頭，迅速取出大腦，放置于低于4℃的冰人工腦脊液(ACSF)中，振動切片機將含有海馬的大腦部分切成腦片，厚度500 μm。腦片在持續(xù)充有95% O

和5% CO

混合氣體的常溫ACSF 中孵育1 h。給藥組將腦片移至界面型記錄槽，通過尼龍網(wǎng)與槽內(nèi)ACSF 接觸，以1～2 ml/min 持續(xù)灌流腦片，ACSF 灌流液中加入pep2m 灌流60 min，腦脊液溫度控制在(30±1) ℃，持續(xù)充有95% O

和5%CO

混合氣體；未給藥組正常條件下孵育。分別取腦片海馬組織，制備海馬蛋白樣品，Western blot 檢測GluR2 表達。

（2）NSF 抑制劑pep2m 對正常大鼠腹外斜肌放電活動的影響

對照組大鼠雙側(cè)海馬CA1 區(qū)微量注射溶劑（20%乙腈）、100 μM 和200 μM pep2m 30 min 后，在40、60 mmHg CRD 壓力下，腹外斜肌放電幅值與給藥前30 min 相比，差異無顯著性（見圖3AC）；雙側(cè)海馬CA1 區(qū)微量注射400 μM pep2m 30 min 后腹外斜肌放電幅值與給藥前30 min 相比顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（見圖3D），提示海馬微量注射100 μM、200 μM pep2m 對正常大鼠的內(nèi)臟痛覺敏感性無顯著影響，但高濃度的pep2m 可抑制正常大鼠腹外斜肌放電。

實驗試劑：鼠抗NSF 單克隆抗體 (ab16681, Abcam)；鼠抗GluR2 單克隆抗體 (MAB397, Millipore)；鼠抗β-actin 單克隆抗體 (E021020-03; EarthOx Life Science)；pep2m (Cat. No.1595, TOCRIS)；BCA 蛋 白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）等。

IBS 模型大鼠雙側(cè)海馬CA1 區(qū)微量注射溶劑、100 μM pep2m 30 min 后在40、60 mmHg CRD 壓力下腹外斜肌放電幅值與給藥前30 min 相比，無統(tǒng)計學(xué)差異（見圖4 A, B）。 IBS 模型大鼠雙側(cè)海馬CA1 區(qū)微量注射200 μM pep2m 后，與給藥前30 min相比，在40 mmHg 與60 mmHg CRD 壓力下腹外斜肌放電幅值均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（給藥前

給藥后：40 mmHg，323±10

241±9；60 mmHg，396±8

313±16，

＜ 0.001，見圖4C）。IBS 模型大鼠雙側(cè)海馬CA1 區(qū)微量注射400 μM pep2m后與給藥前30 min 相比，在40 mmHg 和60 mmHg CRD 壓力下測的腹外斜肌放電幅值均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（給藥前

給藥后：40 mmHg，216±10

86±6；60 mmHg，329±11

170±14，

＜ 0.001，見圖4D）。此結(jié)果提示雙側(cè)海馬CA1區(qū)微量注射200 μM、400 μM pep2m 對IBS 模型大鼠的內(nèi)臟痛覺敏感性有抑制作用。

IBS 模型大鼠海馬微量注射不同劑量 pep2m（100 μM、200 μM 和400 μM）后30 min，其 在40 mmHg CRD 壓力的抑制率分別為7%±3% 、25%±2%和60%±2%，表現(xiàn)為隨劑量的增加其抑制率顯著增加（

＜ 0.001，見圖5B）；在60 mmHg CRD 壓力的抑制率分別為7%±3%、21%±3%和48%±3%，也表現(xiàn)出隨劑量的增加其抑制率顯著增加（

＜ 0.01，

＜ 0.001，見圖5D）。此結(jié)果提示pep2m 對IBS 模型大鼠的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

對照組大鼠海馬微量注射不同劑量pep2m（100 μM、200 μM 和400 μM）后30 min，其 在40 mmHg CRD 壓力的抑制率分別為23%±5% 、24%±4%和39%±4%，在60 mmHg CRD 壓力的抑制率分別為13%±6%、25%±4%和33%±4%。對照組大鼠在40 mmHg 與60 mmHg CRD 兩個壓力下各劑量之間的抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖5A, C）。

（4）pep2m 對大鼠內(nèi)臟痛覺敏感性的抑制效應(yīng)

3. pep2m 灌流IBS 大鼠海馬腦片后GluR2 的表達降低

免疫印跡法：配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，行SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)膜，取出 PVDF膜，將膜放在5%的脫脂奶粉液里，搖床上室溫封閉2 h。將封閉好的膜分別對應(yīng)加入鼠抗NSF 一抗(1:500)、鼠抗GluR2 一抗(1:1000)及鼠抗β-actin 一抗(1:3000)，4℃孵育過夜。TBST 漂洗3 次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1:6000)，室溫孵育1 h。ECL 法顯色1～3 min，置于分子成像儀內(nèi)成像，凝膠分析軟件進行圖像分析。

1)第①種情況 將工序u移至v之后，如圖11所示，Q變?yōu)镼1={l1,l2,,lk,v,u}，求解評價值λu,v(0,w)和λu,v(w,#)的過程如下：

討 論

慢性疼痛可以影響大腦的高級功能，如感覺、情感、認知及記憶等。研究表明大腦尤其是邊緣系統(tǒng)在慢性疼痛中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，邊緣系統(tǒng)具有接受調(diào)控傷害性信息的功能。傷害性信息傳入邊緣系統(tǒng)，并由此傳向大腦皮質(zhì)，產(chǎn)生疼痛的感受和心理反應(yīng)。海馬是邊緣系統(tǒng)的重要組成，在學(xué)習(xí)與記憶、情緒情感調(diào)控以及感覺集成等方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)海馬參與了機體對慢性疼痛的調(diào)控過程，并且在痛覺信息的加工處理中起著重要作用。海馬CA1、CA2、CA3 和齒狀回顆粒細胞層內(nèi)存在傷害性敏感神經(jīng)元。在慢性疼痛病人和動物模型上均發(fā)現(xiàn)海馬功能的改變，并伴有海馬神經(jīng)元增多及行為學(xué)等多方面的變化

。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，IBS 模型大鼠海馬CA1 區(qū)LTP 比正常大鼠顯著增強，海馬微量注射PKMζ 抑制劑ZIP 和AMPARs 抑制劑CNQX 均可劑量依賴性抑制IBS 模型大鼠內(nèi)臟痛覺敏感性

，提示海馬作為內(nèi)側(cè)痛覺系統(tǒng)的組成部分，在慢性功能性內(nèi)臟痛的形成中發(fā)揮著重要的作用，海馬突觸可塑性 LTP 有助于痛記憶和痛情緒的形成，為疼痛的研究提供借鑒。

NSF 作為一種在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)能引發(fā)多種生物學(xué)效應(yīng)的膜融合蛋白，近年來受到越來越多的關(guān)注。NSF 蛋白單體包含有一個N-結(jié)構(gòu)域和兩個相互獨立ATP 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，NSF 通過N-結(jié)構(gòu)域與其他蛋白復(fù)合物互相鏈接，ATP 結(jié)合結(jié)構(gòu)域在囊泡融合的過程中催化ATP 水解為該過程供能，這三個結(jié)構(gòu)域?qū)SF 的整體活性起著不可或缺的作用

。NSF在成年大鼠大腦中廣泛表達，特別是在海馬區(qū)有著較高的表達水平。本研究應(yīng)用免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，IBS 大鼠海馬NSF 蛋白表達顯著高于正常大鼠；進一步通過雙側(cè)海馬CA1 區(qū)微量注射NSF 抑制劑pep2m，發(fā)現(xiàn)IBS 大鼠腹外斜肌放電幅值顯著下降，pep2m 可呈劑量依賴性降低IBS 模型大鼠的內(nèi)臟痛覺敏感性，提示海馬NSF 作為轉(zhuǎn)運蛋白在慢性功能性內(nèi)臟痛中樞敏化中起著重要作用。

NSF 可通過細胞質(zhì)中NSF 粘附蛋白 (soluble NSF attachment protein, SNAP) 結(jié)合到高爾基體膜上的NSF 粘附蛋白受體(SNAP receptors, SNAREs)，在細胞膜囊泡轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用

。在SNAP依賴的行為中，NSF 可與AMPARs 的GluR2 亞型C 端直接結(jié)合，這種穩(wěn)定性的結(jié)合是核苷酸依賴性的，需要NSF 的三個結(jié)構(gòu)域參與

。研究發(fā)現(xiàn)NSF 抑制劑pep2m 可引起突觸電流的迅速減少，NSF與GluR2 之間的相互作用對突觸后膜表面AMPAR 的穩(wěn)定性有著重要作用

。此外，研究還發(fā)現(xiàn)NSF也可不經(jīng)SNAP 直接與膜上AMPARs、多巴胺受體和γ-氨基丁酸受體等結(jié)合，進而調(diào)控受體在細胞質(zhì)和核內(nèi)體之間物質(zhì)傳輸?shù)淖饔?/p>

。

AMPARs 是促離子型谷氨酸受體，普遍存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，AMPARs 的GluR1 和GluR2 亞基被認為是與疼痛關(guān)系密切的受體亞型。有研究發(fā)現(xiàn)在芥子油誘發(fā)的內(nèi)臟痛模型大鼠海馬前扣帶回GluR2 的表達量顯著增加

。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)IBS 慢性內(nèi)臟痛大鼠海馬GluR2 表達增加而GluR1 表達減少，且IBS 慢性內(nèi)臟痛大鼠離體海馬腦片長時程增強后GluR2 表達明顯增加

。還有學(xué)者在神經(jīng)病理性疼痛模型中，發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射豆蔻?；囊种苿┳钄郍luR2、GluR3 亞基和NSF 之間的聯(lián)系后，能選擇性抑制外周神經(jīng)損傷時神經(jīng)病理性痛覺敏化

。

（3）一致式與隱喻式之間具有形似性。形似性原則是一條接受度較高、簡便有效的判定標(biāo)準(zhǔn)，同時也能起到我們在第一條標(biāo)準(zhǔn)里談到的限制研究范圍的作用，此處不再贅述（可參見3.2小節(jié)的例子及相關(guān)分析）。

有關(guān)學(xué)習(xí)記憶的研究表明，NSF 與GluR2 之間的相互作用是背側(cè)杏仁核恐懼記憶形成的前提條件；海馬長期記憶的維持需要NSF 與GluR2 之間的相互作用

，LTP 的維持階段AMPAR 信號通路上NSF 與GluR2 之間的相互作用上調(diào)，進而加速AMPARs 向胞膜轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致突觸后膜AMPARs 的突觸傳遞效應(yīng)增強

。疼痛被認為也是學(xué)習(xí)記憶的一種形式，說明NSF 與GluR2 之間的相互作用在疼痛形成中起著重要作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)NSF 抑制劑pep2m 的過度表達，可抑制NSF-GluR2 相互作用，降低突觸前活性區(qū)膜中GluR2 的濃度

。本研究用含有NSF 抑制劑pep2m 的人工腦脊液灌流腦片后，發(fā)現(xiàn)IBS 模型大鼠海馬中GluR2 表達顯著降低，而正常大鼠GluR2 表達水平未發(fā)生明顯變化，提示IBS 大鼠海馬NSF 的高表達，可通過NSF 與GluR2之間的相互作用，使GluR2 表達增加，導(dǎo)致IBS 大鼠中樞痛覺敏化，其具體機制有待進一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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