草魚PepT2基因的克隆及其表達(dá)分析

劉金夢，秦貝貝，黎航航，肖調(diào)義，蘇建明

草魚基因的克隆及其表達(dá)分析

劉金夢1,2，秦貝貝1,2，黎航航2，肖調(diào)義1,2，蘇建明3*

(1.湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

采用RT–PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆草魚()II型小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體()基因全長cDNA序列，對其進(jìn)行生物信息學(xué)和共線性分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測分析健康草魚基因在不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明：草魚基因的cDNA序列全長為2733 bp，包括開放閱讀框2169 bp(編碼722個(gè)氨基酸殘基)，5′非編碼區(qū)82 bp和3′非編碼區(qū)482 bp；草魚基因結(jié)構(gòu)含有20個(gè)外顯子和19個(gè)內(nèi)含子；預(yù)測蛋白相對分子質(zhì)量為8.032×104，等電點(diǎn)為6.01，該蛋白具有與哺乳動(dòng)物同源蛋白類似的12個(gè)螺旋跨膜結(jié)構(gòu)，并且在跨膜區(qū)9和10之間有1個(gè)大的外環(huán)，跨膜區(qū)氨基酸高度保守，含有6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)N–糖基化位點(diǎn)；預(yù)測的PepT2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)包含有18個(gè)α–螺旋和21個(gè)β–折疊；氨基酸序列同源性分析結(jié)果顯示，草魚PepT2氨基酸序列與斑馬魚()的同源性最高，為86.65%，與其他所比較的物種的同源性則為52.83%～68.15%；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，草魚與斑馬魚的親緣關(guān)系最近；與斑馬魚相比，草魚所在的染色體保留著大多數(shù)基因，具有保守的基因塊；實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析表明，草魚在腸道中的表達(dá)量最高，在腎臟中的表達(dá)量次之。

草魚；小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體；；克??；生物信息學(xué)分析；共線性分析；組織表達(dá)

草魚()隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)雅羅魚亞科(Leuciscinae)草魚屬()，是中國產(chǎn)量最大的大宗淡水魚類養(yǎng)殖品種，其生長速度快、經(jīng)濟(jì)效益高，是淡水經(jīng)濟(jì)魚類養(yǎng)殖重要的組成部分。2019年，中國草魚產(chǎn)量約為5.53×106t[1]。飼料的消化、吸收與利用是影響魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)的主要因素之一。在魚類飼料中，蛋白質(zhì)是關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)之一。飼用蛋白質(zhì)經(jīng)消化道消化分解為游離氨基酸和小肽，分別由氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體吸收轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入體內(nèi)[2]。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體屬于依賴質(zhì)子的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(POT)家族成員[3]，它們以H+梯度為動(dòng)力，將腸腔和其他組織中的小肽從胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，對小肽的吸收起關(guān)鍵作用[4]。1994年，F(xiàn)EI等[5]從兔cDNA文庫中克隆了小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體，并將其命名為Ⅰ型肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體()；同年，LIU等[6]在人腎臟cDNA庫中發(fā)現(xiàn)并克隆了II型小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體()基因；2006年，ROMANO等[7]在斑馬魚中鑒定出PepT2型肽轉(zhuǎn)運(yùn)體。研究[5,8]表明，PepT1是低親和力、高容量的蛋白，主要在腸上皮細(xì)胞中表達(dá)，對小肽的吸收起重要作用。PepT2是一種高親和力、低容量的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，除能夠轉(zhuǎn)運(yùn)二肽和三肽之外，還轉(zhuǎn)運(yùn)一些類肽類藥物[9–10]。廣泛分布于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，主要在腎臟[11]、大腦[12]、肺[13]及乳腺組織中表達(dá)[14]，在視網(wǎng)膜、心臟、肝臟、脾臟、胰腺、骨骼肌、結(jié)腸、生殖道也有分布[15]，并在這些組織中發(fā)揮重要作用。PepT2作為小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體，在哺乳動(dòng)物中的研究比較廣泛，但在魚類中的報(bào)道少見。本研究中，采用RT–PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)克隆草魚小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因全長cDNA序列，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測分析健康草魚基因在不同組織中的表達(dá)情況，旨在為小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系及其在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)小肽的分子機(jī)理研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　供試材料

供試草魚采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，平均體質(zhì)量為(161±5) g，個(gè)體健康，發(fā)育良好。隨機(jī)選取草魚5尾，用MS–222(50 mg/L)麻醉后解剖，取肝臟、脾臟、腎臟、頭腎、鰓、皮膚、肌肉、腸道、腦、心臟等，先用DEPC(焦碳酸二乙酯)處理過的滅菌水清洗，再在液氮中速凍，于–80 ℃冰箱保存，備用。

1.2　主要試劑

總RNA提取試劑(Trizol Reagent)購自Invitrogen；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA synthesis Kit)購自Fermentas(MBI)；SMARTer RACE cDNA Amplification Kit購自Clontech；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit)購自Qiagen；pMD19–T、DL2000 Maker、 LA?DRR002A、Premix Ex?Version 2.0聚合酶、SYBR Premix ExTM II(Tli RNaseH Plus)均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3　草魚PepT2基因cDNA全長的克隆及測序

根據(jù)已知魚類基因序列的保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)簡并引物CiPepT2–F和CiPepT2–R(表1)，采用PCR擴(kuò)增出中間部分片段，經(jīng)測序、同源比對，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)3ˊRACE特異性引物CiPepT2–3ˊ和5′RACE特異性引物CiPepT2–5ˊ(表1)。參照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit使用說明書，反轉(zhuǎn)錄合成5ˊRACE和3ˊRACE所需的cDNA第一鏈模板，并進(jìn)行RACE擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。RACE擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒回收目的片段，再與pMD19–T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后用氨芐青霉素抗性平板篩選陽性克隆并進(jìn)行菌液PCR鑒定，最后將陽性克隆送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

表1　草魚PepT2基因的克隆及表達(dá)分析所用的引物

1.4　草魚PepT2基因序列的生物信息學(xué)分析

所獲序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast同源性比對確定后，對中間片段序列、正向和反向序列進(jìn)行剪切拼接，獲得草魚基因全長cDNA序列，運(yùn)用EditSeq進(jìn)行開放閱讀框(ORF)預(yù)測和氨基酸序列翻譯。運(yùn)用ExPASy(http://www.expasy.org/)預(yù)測蛋白相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)理化性質(zhì)；運(yùn)用SWISS-MODE (https://www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)；運(yùn)用Gene Structure Display Server 2.0 (http://gsds.gao-lab.org/)分析基因組結(jié)構(gòu)；運(yùn)用SMART(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測和分析蛋白跨膜域；運(yùn)用SignalP(http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測編碼蛋白信號(hào)肽。通過Blast在線工具查找數(shù)據(jù)庫中的同源序列，運(yùn)用ClastalW2.1對同源序列進(jìn)行比對，并以MEGA6.0中的鄰接法(Neighbor–joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。所用物種包括人(，NM_021082)，恒河猴(，NM_001032953)，家兔(，NP_001076169)，小鼠(，AF111811)，原雞(，KF366604)，鸚鵡(，KQK83957)，非洲爪蟾(，NM_001086929)，海龜(，XP_ 007071949)，斑馬魚(，NM_001039828)，青鳉(，XP_023806227)，大黃魚(，XP_019108521)，北極紅點(diǎn)鮭(，XP_023862343)。

1.5　共線性分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫，從草魚基因組數(shù)據(jù)中獲得基因的上、下游基因序列[16]，并從Ensembl數(shù)據(jù)庫獲得斑馬魚、紅鰭東方鲀、大菱鲆、斑點(diǎn)叉尾鮰的上、下游基因，在UCSC、Vega及Ensemble數(shù)據(jù)庫上比對基因信息，進(jìn)行及其周邊基因的共線性關(guān)系的分析。

1.6　草魚PepT2基因的組織表達(dá)分析

根據(jù)草魚基因序列(登錄號(hào)為M25013.1)設(shè)計(jì)熒光定量PCR內(nèi)參引物Ciβ–actin–F、Ciβ– actin–R，根據(jù)草魚基因序列的ORF區(qū)序列設(shè)計(jì)熒光定量特異性引物qCiPepT2–F和qCiPepT2–R (表1)。以正常草魚肝臟、脾臟、腎臟、頭腎、鰓、皮膚、肌肉、腸道、腦、心臟等的組織樣品的cDNA為模板，檢測基因在各個(gè)組織的表達(dá)情況。參照SYBR Premix ExTM II的說明書，在Light- Cycler480熒光定量PCR儀上分析基因的組織表達(dá)情況。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火40 s，40個(gè)循環(huán)；65 ℃變溫5 s。每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。采用2–ΔΔCt法結(jié)合SPSS17.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　草魚PepT2基因序列的分析結(jié)果

將獲得的片段用SeqMan進(jìn)行拼接，得到2733 bp的全長cDNA序列(GenBank登錄號(hào)為MK860203.1)，經(jīng)BLAST和同源比對分析，確認(rèn)為草魚基因。該序列包含82 bp的5′端非編碼區(qū)(UTR)、2169 bp的ORF、482 bp的3′UTR(圖1)。

下劃線示起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)；方框示N–糖基化位點(diǎn)；灰色底紋示蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)。

在3′UTR，有5個(gè)RNA不穩(wěn)定信號(hào)ATTTA，但沒有典型的polyA加尾信號(hào)AATAAA。PepT2的ORF編碼722個(gè)氨基酸殘基，Expasy預(yù)測的蛋白相對分子質(zhì)量約為8.032×104，等電點(diǎn)約為6.01。SignalP分析表明，其不存在信號(hào)肽序列；TMHMM分析顯示，PepT2蛋白存在12個(gè)跨膜區(qū)域，且與哺乳動(dòng)物同源蛋白類似，在跨膜結(jié)構(gòu)9和10之間有1個(gè)大細(xì)胞外環(huán)，跨膜區(qū)氨基酸高度保守，含有6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)N–糖基化位點(diǎn)(圖1)。SMART分析顯示，草魚PepT2蛋白有2個(gè)PTR2基序，與斑馬魚相同(圖2)。SWISS–MODEL三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，PepT2蛋白有18個(gè)α–螺旋和21個(gè)β–折疊(圖3)。草魚和斑馬魚基因結(jié)構(gòu)均由外顯子和內(nèi)含子組成，草魚包含有20個(gè)外顯子和19個(gè)內(nèi)含子，斑馬魚包含有23個(gè)外顯子和22個(gè)內(nèi)含子，草魚與斑馬魚外顯子和內(nèi)含子數(shù)量存在差異。

圖2　草魚PepT2蛋白的預(yù)測二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖3　草魚PepT2蛋白的預(yù)測三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.2　草魚PepT2氨基酸同源序列比對與進(jìn)化分析結(jié)果

經(jīng)同源性分析(圖4)可知，草魚PepT2氨基酸序列與斑馬魚、大黃魚、青鳉的同源性分別為86.65%、68.15%和67.05%；與兩棲動(dòng)物非洲爪蟾和鳥類原雞的同源性分別為60.27%和59.18%；與哺乳動(dòng)物小鼠、人類、恒河猴和家兔的同源性分別為52.97%、53.95%、52.83%和53.23%。從圖5可知，草魚PepT2與斑馬魚PepT2親緣關(guān)系最近，與北極紅點(diǎn)鮭、大黃魚、青鳉的親緣關(guān)系較近；進(jìn)化樹中哺乳類、爬行類、鳥類、兩棲類、魚類分支與傳統(tǒng)的分類方法所得結(jié)果一致。

圖4　草魚與其他脊椎動(dòng)物的PepT2的氨基酸序列比對分析結(jié)果

圖5　基于PepT2氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.3　PepT2基因共線性分析結(jié)果

根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫獲得的nanos2所在區(qū)域的基因組序列，繪制了草魚、斑馬魚、紅鰭東方鲀、大菱鲆、斑點(diǎn)叉尾鮰的及其上、下游臨近7個(gè)基因的共線性圖(圖6)。從圖7可知，草魚基因定位于第16號(hào)染色體上；與斑馬魚相比，草魚所在的染色體保留著大多數(shù)基因，具有保守的基因塊。在草魚基因附近的和基因分別在斑馬魚第9號(hào)染色體、紅鰭東方鲀第1號(hào)染色體、大菱鲆第16號(hào)染色體、斑點(diǎn)叉尾鮰第6號(hào)染色體上，它們在基因組中的定位呈現(xiàn)高度保守的同線性。斑馬魚缺失了草魚基因附近的和基因，而和基因在紅鰭東方鲀、大菱鲆、斑點(diǎn)叉尾鮰中都缺失，說明不同魚類在進(jìn)化過程中存在染色體基因的擴(kuò)張或丟失現(xiàn)象。

圖6　草魚PepT2基因與其鄰近基因保守的共線性關(guān)系

2.4　草魚PepT2基因的組織表達(dá)情況

在草魚被檢測的不同組織中均有表達(dá)，在肝臟、脾臟、腎臟、頭腎、鰓、皮膚、肌肉、腸道、腦、心臟的mRNA相對表達(dá)量分別為0.001 176、0.000 436、0.065 178、0.000 190、0.000 468、0.019 108、0.002 598、0.864 026、0.000 686、0.009 064，其中，在腸道中的相對表達(dá)量最高，其次是腎臟中的，在腸道和腎臟的組織中的相對表達(dá)量顯著(<0.05)高于其他組織的，在脾臟、頭腎、鰓和腦的組織中表達(dá)相對較弱。

3　結(jié)論與討論

本研究中，克隆了草魚基因全長cDNA序列，并對其氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，草魚PepT2氨基酸序列中含有3個(gè)N–糖基化位點(diǎn)、12個(gè)跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，在跨膜結(jié)構(gòu)9和10之間具有1個(gè)大細(xì)胞外環(huán)，與斑馬魚PepT2氨基酸序列結(jié)構(gòu)類似[4]。在大鼠PepT2中，其轉(zhuǎn)運(yùn)體也有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，在第9和10跨膜結(jié)構(gòu)域之間有1個(gè)大細(xì)胞外環(huán)，但大鼠PepT2存在4個(gè)N–連接糖基化位點(diǎn)[9]。草魚PepT2氨基酸序列與斑馬魚、大黃魚、青鳉的同源性較高；草魚與魚類物種聚合相近，這與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致，說明在不同動(dòng)物中基因進(jìn)化相對保守。

草魚全基因組序列分析結(jié)果顯示，草魚全基因含有20個(gè)外顯子和19個(gè)內(nèi)含子。草魚基因定位于Chr16號(hào)染色體上，基因共線性分析結(jié)果顯示，在草魚基因附近的和基因分別在斑馬魚第9號(hào)染色體、紅鰭東方鲀第1號(hào)染色體、大菱鲆第16號(hào)染色體、斑點(diǎn)叉尾鮰第6號(hào)染色體上，它們在基因組中的定位呈現(xiàn)高度保守的同線性。但在斑馬魚中缺失了草魚基因附近的和基因，和基因在紅鰭東方鲀、大菱鲆、斑點(diǎn)叉尾鮰中都缺失，推測草魚在進(jìn)化過程中存在染色體基因的擴(kuò)張現(xiàn)象。

運(yùn)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測基因在草魚各組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，草魚基因在各組織中均有表達(dá)，但組織之間表達(dá)差異明顯。在哺乳動(dòng)物中，主要在腎臟[11]、大腦[12]、肺[13]及乳腺組織表達(dá)[14]，而草魚主要在腸道、腎臟中表達(dá)，在大腦、脾臟中表達(dá)較低。可見，不同物種中基因的表達(dá)模式存在較大差異，這可能與物種生存特性有關(guān)。在斑馬魚[5]、鯉魚[17]腸道中表達(dá)較高，本研究中在草魚腸道中的表達(dá)情況與其相符。在魚類腸道中的表達(dá)較高，可能與魚類生活的環(huán)境及對營養(yǎng)消化、吸收的特點(diǎn)有關(guān)。與哺乳動(dòng)物相比，水產(chǎn)動(dòng)物消化道分化簡單，消化道較短，消化酶數(shù)量較少，腸壁轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的載體數(shù)量不足，消化吸收功能較弱[18]。水產(chǎn)動(dòng)物以小肽的形式轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，以彌補(bǔ)消化道分化的不足。在草魚腸道中表達(dá)最高，推測PepT2可能在草魚腸道中廣泛參與了小肽的轉(zhuǎn)移與吸收，后期可進(jìn)一步闡明PepT2的分子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，對開展小肽營養(yǎng)飼料添加劑或功能活性肽用于水產(chǎn)動(dòng)物生產(chǎn)具有重要意義。

[1] 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局，全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，中國水產(chǎn)學(xué)會(huì)．2020中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2020．

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Cloning and expression analysis of thegene in

LIU Jinmeng1,2，QIN Beibei1,2，LI Hanghang2，XIAO Tiaoyi1,2，SU Jianming3*

(1.Hunan Province Characteristic Aquatic Resources Utilization Engineering Technology Research Center, Changsha, Hunan 410128, China; 2.College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 3.College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China)

Type II small peptide transporter(2) gene of thewas cloned using RT-PCR and RACE methods, and analyzed using bioinformatics and collinearity methods. The expression ofgene in different tissues of healthywas detected and analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that the full-length cDNA sequence ofhad 2733 bp, including 2169 bp as an open reading frame encoding a 722-amino-acid peptide, 82 bp at 5′UTR and 482 bp at 3′UTR.gene ofcontained 20 exons and 19 introns. The predicted relative molecular mass was 8.032×104and pI at 6.01. The protein had 12 helical transmembrane structures similar to the mammalian homologous proteins, and there was a large outer ring between the transmembrane regions 9 and 10. The transmembrane amino acid region was highly conserved, and contained 6 protein kinase C phosphorylation sites and 3 N-glycosylation sites. The tertiary structure of PepT2 protein was predicted to contain 18 α-helices and 21 β-folds. The amino acid sequence homology analysis results showed that the PepT2 amino acid sequence ofhad the highest homology with(86.65%), and the homology with other species were 52.83%-68.15%. Phylogenetic tree analysis showed thatandwere the most closely related. Compared with, most genes were retained in thechromosome ofwith conserved gene blocks. Real-time fluorescence quantitative expression analysis showed that theexpression level ofwas the highest in the intestinal tract, followed by the kidney.

;small peptide transporter;; clone; bioinformatics analysis; collinearity analysis; tissue expression

S917.4；S965.112；Q786

A

1007-1032(2022)04-0488-08

劉金夢，秦貝貝，黎航航，肖調(diào)義，蘇建明．草魚基因的克隆及其表達(dá)分析[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2022，48(4)：488–495．

LIU J M，QIN B B，LI H H，XIAO T Y，SU J M．Cloning and expression analysis of thegene in[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2022，48(4)：488–495．

http://xb.hunau.edu.cn

2021–03–01

2022–02–22

國家大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS–45–48)

劉金夢(1995—)，女，天津人，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)遺傳育種與繁殖研究，1559176106@qq.com；*通信作者，蘇建明，博士，副教授，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖與魚類遺傳育種研究，sjmauhn@hunau.edu.cn

責(zé)任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正