基于代謝組學(xué)分析的紫色和白粉色花的鹿角杜鵑呈花色物質(zhì)差異

張卉，沈守云，廖秋林，朱寧華

基于代謝組學(xué)分析的紫色和白粉色花的鹿角杜鵑呈花色物質(zhì)差異

張卉，沈守云*，廖秋林，朱寧華

(中南林業(yè)科技大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，湖南 長沙 410004)

于紫色花和白粉色花鹿角杜鵑開花過程中全綠期、露紅期、初花期、盛開期，采用超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，測定鹿角杜鵑花瓣代謝物的含量；通過正交偏最小二乘判別法(OPLS–DA)分析篩選出差異代謝物，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)差異代謝物進(jìn)行富集分析，進(jìn)一步篩選與花色相關(guān)的關(guān)鍵代謝物，通過相關(guān)性分析驗(yàn)證關(guān)鍵代謝物與鹿角杜鵑花色的相關(guān)性。結(jié)果表明：在鹿角杜鵑的花瓣中共檢測到1057種代謝物，其中差異代謝物243種，差異代謝物在類黃酮和花青素代謝通路中顯著富集；紫色花鹿角杜鵑花瓣中錦葵色素–3–O–葡萄糖苷的含量遠(yuǎn)高于白粉色花鹿角杜鵑的。推測錦葵色素–3–O–葡萄糖苷是鹿角杜鵑花瓣呈紫色的關(guān)鍵花青苷，二氫楊梅素和沒食子兒茶素可能通過類黃酮合成通路影響鹿角杜鵑花青素的合成，進(jìn)而影響鹿角杜鵑的花色。

鹿角杜鵑；花色；代謝組學(xué)；超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜；類黃酮合成通路

鹿角杜鵑的花色是其重要的觀賞性狀，常見花色為白粉色[1]。筆者所在課題組在野外調(diào)研時(shí)發(fā)現(xiàn)了紫色花鹿角杜鵑植株，隨后對(duì)其進(jìn)行遷地保護(hù)，通過定期、定株的物候觀測發(fā)現(xiàn)，紫色花鹿角杜鵑長勢良好，花色性狀穩(wěn)定，觀賞性比白粉色花的更高[2]。植物花瓣呈紫色與花青素的含量相關(guān)，紫色野生百合()主要呈色物質(zhì)為花青素[3]?；ㄇ嗨剡€是貼梗海棠()呈現(xiàn)紅色及紫色的原因[4]。王禹等[5]發(fā)現(xiàn)，多數(shù)杜鵑花科植物的花色取決于類黃酮物質(zhì)的種類，其中花青素對(duì)花色起關(guān)鍵作用，黃酮醇起輔助呈色的作用。錦繡杜鵑()花瓣中主要呈色物質(zhì)是花青素和黃酮醇[6]。白色錦繡杜鵑中也存在少量飛燕草素和矢車菊素，粉色錦繡杜鵑花瓣中的矢車菊素–3–O–蕓香糖苷是紫色錦繡杜鵑花瓣的6倍[7]。西藏東南部雪山10種高山杜鵑花瓣中花青素的含量與其花瓣的顏色相關(guān)，其中紫羅蘭色雪層杜鵑()和紫色山育杜鵑()主要呈色代謝物為錦葵色素[8]。尖葉杜鵑()花瓣中含有矢車菊素、芍藥花素、錦葵素[9]。馬纓杜鵑()花瓣含有四種3–O–糖基化的花青苷[10]。

筆者采用超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC– MS/MS)技術(shù)，測定白粉色花和紫色花鹿角杜鵑開花過程中花瓣代謝物的含量，通過正交偏最小二乘判別法(OPLS–DA)分析篩選出差異代謝物，進(jìn)一步篩選紫色花鹿角杜鵑花瓣的呈色主要代謝物，并對(duì)差異代謝物進(jìn)行富集分析，找出關(guān)鍵代謝物，通過相關(guān)性分析驗(yàn)證關(guān)鍵代謝物與鹿角杜鵑花色表型的相關(guān)性，以期為鹿角杜鵑花色改良提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

選擇湖南株洲市茶陵縣移植6年且長勢良好的紫色花、白粉色花鹿角杜鵑植株，參考YANG等[11]的研究，采集全綠期(S1)、露紅期(S2)、初花期(S3)、盛開期(S4)花瓣。

1.2　方法

1.2.1杜鵑花瓣花色的測定

用色差儀對(duì)花瓣中顏色最均勻的部位進(jìn)行測定。利用CIE體系中的Lab顏色模型對(duì)花瓣色彩進(jìn)行量化[12]。

1.2.2杜鵑花瓣代謝物的測定

參照CHEN等[13]的方法，提取杜鵑花瓣代謝物；參照楊赟[14]的方法，采用超高效液相色譜及質(zhì)譜測定代謝物的含量。

1.3　數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與分析

2.1　鹿角杜鵑的花色差異

紫色花和白粉色花鹿角杜鵑在開花過程中花瓣顏色存在色差(圖1)，紫色花和白粉色花鹿角杜鵑花瓣在露紅期的值差異不大(表1)，但在初花期紫色花瓣亮度低于白粉色花瓣，表明紫色花鹿角杜鵑進(jìn)入初花期后花色開始明顯深于白粉色花。紫色花和白粉色花鹿角杜鵑全綠期值為負(fù)數(shù)，花瓣顏色為綠，露紅期白粉色花鹿角杜鵑的值比紫色花的大，但初花期白粉色花鹿角杜鵑的值開始減少，而紫色花的值在初花期達(dá)最高，表明在初花期紫色花鹿角杜鵑紅色增加，而白粉色花鹿角杜鵑紅色開始下降，進(jìn)而導(dǎo)致了初花期和盛開期紫色花鹿角杜鵑花色比白粉色花鹿角杜鵑花色鮮艷。從值可以看出，紫色花和白粉色花鹿角杜鵑在全綠期偏黃，其他時(shí)期都幾乎偏藍(lán)，且紫色花杜鵑的藍(lán)調(diào)更重。結(jié)合圖1及表1花瓣Lab值，可以看出白粉色花、紫色花鹿角杜鵑在初花期和盛開期色差最大。由此可見，初花期和盛開期是白粉色花與紫色花鹿角杜鵑花色顯現(xiàn)差異的關(guān)鍵時(shí)期。

1　紫色花鹿角杜鵑全綠期花朵；2　紫色花鹿角杜鵑露紅期花朵；3　紫色花鹿角杜鵑初花期花朵；4　紫色花鹿角杜鵑盛開期花朵；5　白粉色花鹿角杜鵑全綠期花朵；6　白粉色花鹿角杜鵑露紅期花朵；7　白粉色花鹿角杜鵑初花期花朵；8　白粉色花鹿角杜鵑盛開期花朵。

表1　白粉色花和紫色花鹿角杜鵑花瓣色彩表型參數(shù)

同列不同字母表示材料間不同生育期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。

2.2　鹿角杜鵑花瓣代謝物的種類

從鹿角杜鵑花瓣中共檢測到1057種代謝物。最主要的代謝物為類黃酮、酚酸、氨基酸等。黃酮類代謝物285種，占26.96%；酚酸類代謝物164種，占15.52%；脂質(zhì)126種，占11.92%；氨基酸衍生代謝物96種，占9.08%；有機(jī)酸73種，占6.91%；萜類67種，占6.34%；核苷酸及其衍生物58種，占5.49%；生物堿46種，占4.35%；木脂素和香豆素30種，占2.84%；鞣質(zhì)11種，占1.04%；醌類6種，占0.56%；其他類95種，占8.99%。

2.3　不同生育期鹿角杜鵑花瓣代謝物的數(shù)量差異

將鹿角杜鵑花瓣代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS–DA分析和交叉驗(yàn)證，結(jié)果顯示，全綠期、露紅期、初花期、盛開期的2值分別為0.983、0.980、0.981、0.979，都大于0.900，表明模型建立良好。

根據(jù)–test<0.05且VIP≥1挑選差異代謝物，并對(duì)差異代謝物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在全綠期顯著差異代謝物共110種，其中上調(diào)的為29種，下調(diào)的為81種；露紅期顯著差異代謝物共110種，其中上調(diào)的為27種，下調(diào)的為83種；初花期顯著差異代謝物共100種，其中上調(diào)的為40種，下調(diào)的為60種；在盛開期顯著差異代謝物共112種，其中上調(diào)的為46種，下調(diào)的為66種。

2.4　差異代謝物的KEGG富集分析

運(yùn)用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)差異代謝物進(jìn)行富集分析(圖2)。結(jié)果表明，鹿角杜鵑各時(shí)期的差異代謝物在類黃酮通路中顯著富集，其中盛開期在花青素通路中顯著富集。

圖2　鹿角杜鵑花瓣差異代謝物代謝通路富集

Fig 2KEGG enrichment map of differential metabolites in the petals of

分析富集在類黃酮及花青素通路中的差異代謝物(表2)，發(fā)現(xiàn)全綠期及露紅期差異花青素為矢車菊素–3,5–二–O–葡萄糖苷和錦葵色素–3–O–葡萄糖苷；初花期和盛花期紫色花鹿角杜鵑花青素的含量顯著高于白粉色花的，其中芍藥花素–3–O–葡萄糖苷和錦葵色素–3–O–葡萄糖苷含量差別最大。

表2　鹿角杜鵑類黃酮及花青素合成途徑中差異代謝物的差異值

調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)可以發(fā)現(xiàn)，全綠期和露紅期，類黃酮合成通路上游代謝物如柚皮素、圣草酚、二氫山奈酚、二氫楊梅素的含量存在差異；初花期和盛開期，類黃酮合成通路下游的代謝物存在差異，如錦葵色素–3–O–葡萄糖苷、沒食子兒茶素、芍藥花素–3–O–葡萄糖苷、二氫楊梅，其中紫色花鹿角杜鵑花瓣的芍藥花素–3–O–葡萄糖苷、錦葵色素–3–O–葡萄糖苷、二氫楊梅素等代謝物的含量顯著高于白粉色花的。

圖3　鹿角杜鵑花瓣差異類黃酮可能的合成網(wǎng)絡(luò)推測

2.5　花瓣關(guān)鍵代謝物與花色的相關(guān)性

對(duì)初花期和盛開期關(guān)鍵代謝物的含量與花色表型性狀作相關(guān)性分析，結(jié)果(表3)顯示，圣草酚、二氫山奈酚、柚皮素、二氫榭皮素等與鹿角杜鵑花色的相關(guān)性較弱；二氫楊梅素、錦葵色素–3–O–葡萄糖苷、芍藥花素–3–O–葡萄糖苷與鹿角杜鵑花色的值、值呈顯著正相關(guān)；沒食子兒茶素與鹿角杜鵑顏色的值、值呈負(fù)相關(guān)。

據(jù)此，二氫楊梅素、錦葵色素–3–O–葡萄糖苷、沒食子兒茶素、芍藥花素–3–O–葡萄糖苷是影響鹿角杜鵑花瓣初花期和盛開期花色的關(guān)鍵代謝物。

表3　鹿角杜鵑花瓣關(guān)鍵代謝物與花色的Pearson相關(guān)性系數(shù)

3　結(jié)論與討論

類黃酮是調(diào)控植物花色的重要色素，花青苷又是類黃酮化合物中的關(guān)鍵呈色代謝物[20]。在白粉色花和紫色花鹿角杜鵑花瓣中共檢測到1057種代謝物，其中有285種類黃酮物質(zhì)，占總代謝物的26.96%，這2種花色的鹿角杜鵑在開花過程中的差異代謝物在類黃酮代謝通路上顯著富集，說明類黃酮代謝物含量的差異可能對(duì)鹿角杜鵑花色造成影響。

對(duì)鹿角杜鵑花色進(jìn)行量化處理，發(fā)現(xiàn)白粉色花和紫色花鹿角杜鵑花色差異大的時(shí)期是在初花期和盛開期。分析花瓣代謝物的含量，發(fā)現(xiàn)開花過程中2種花色的鹿角杜鵑在類黃酮及花青素合成通路存在差異，在初花期和盛開期含量差別最大的花青苷是錦葵色素–3–O–葡萄糖苷，這可能是紫色花鹿角杜鵑花色呈紫色的關(guān)鍵代謝物。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫繪制出鹿角杜鵑在類黃酮與花青素生物合成途徑差異代謝物的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)熱圖，發(fā)現(xiàn)白粉色花和紫色花鹿角杜鵑在二氫楊梅素代謝途徑的分支中差異很大，錦葵色素–3–O–葡萄糖苷在初花期和盛開期顯著上升，沒食子兒茶素則顯著下降，它們的合成底物均為二氫楊梅素，推測可能是由于紫色花鹿角杜鵑將二氫楊梅素轉(zhuǎn)化成有色的錦葵色素–3–O–葡萄糖苷，白粉色花則將二氫楊梅素轉(zhuǎn)化成的無色沒食子兒茶素，從而導(dǎo)致了花色的差異。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了這一推論。

有研究者對(duì)杜鵑7個(gè)亞屬的花色及花青素含量進(jìn)行研究[20]，發(fā)現(xiàn)矢車菊素能使部分杜鵑花瓣偏紅，錦葵色素和飛燕草素能使花瓣呈紫色。紅紫色及紅色的三花杜鵑主要的顯色代謝物是矢車菊素，而紫羅蘭色雪層杜鵑和紫色山育杜鵑主要色素為錦葵色素[8]。其他植物中紫色花的形成也與錦葵色素等花青苷相關(guān)，紫色報(bào)春苣苔()花瓣中含量最高的花青苷為錦葵色素[21]。紫色鴛鴦茉莉()主要呈色物質(zhì)為錦葵色素–3–O–葡萄糖苷，花瓣越紫，則錦葵色素含量越多[22]。紫色系牡丹()中含有大量芍藥色素[23]，錦葵色素–3–O–葡萄糖苷的增加會(huì)使紫鵑花瓣呈紫色[24]。這些研究從一定程度上印證了鹿角杜鵑紫色花色可能受類黃酮代謝途徑中二氫楊梅素分支的影響，其中錦葵色素–3–O–葡萄糖苷可能對(duì)鹿角杜鵑花色呈紫色的影響最大。

鹿角杜鵑的觀賞價(jià)值主要體現(xiàn)在開花及花色上，在后續(xù)研究中將以類黃酮代謝途徑中的二氫楊梅素分支為研究重點(diǎn)，從分子層面進(jìn)一步分析不同花色鹿角杜鵑錦葵色素–3–O–葡萄糖苷含量上存在差異的原因。

[1] 廖菊陽，彭春良，黃滔，等．珍稀園林植物鹿角杜鵑新品種選育[J]．湖南林業(yè)科技，2012，39(5)：57–59．

[2] 黃地歌．鹿角杜鵑遷地保護(hù)及繁育技術(shù)研究[D]．長沙：中南林業(yè)科技大學(xué)，2017．

[3] 夏婷，耿興敏，羅鳳霞．不同花色野生百合色素成分分析[J]．東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，41(5)：109–113．

[4] 張潔．四種觀賞植物花青苷分析及其花色形成機(jī)制[D]．楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011．

[5] 王禹，張廣輝，赫京生，等．杜鵑花色研究進(jìn)展[J]．世界林業(yè)研究，2020，33(5)：19–24．

[6] MIZUTA D，BAN T，MIYAJIMA I，et al．Comparison of flower color with anthocyanin composition patterns in evergreen[J]．Scientia Horticulturae，2009，122(4)：594–602．

[7] WANG S Z，HUANG S Y，YANG J，et al．Metabolite profiling of violet，white and pink flowers revealing flavonoids composition patterns inSweet[J]．Journal of Biosciences，2021，46：3．

[8] LIU L，ZHANG L Y，WANG S L，et al．Analysis of anthocyanins and flavonols in petals of 10species from the Sygera Mountains in Southeast Tibet[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2016，104(1)：250–256．

[9] 趙歌．杜鵑(M.) 花色素的研究與應(yīng)用[D]．蘇州：蘇州大學(xué)，2012．

[10] 徐僡．類黃酮–3–O–糖基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控馬纓杜鵑花色呈色的機(jī)制研究[D]．貴陽：貴州師范大學(xué)，2021．

[11] YANG F S，NIE S，LIU H，et al．Chromosome-level genome assembly of a parent species of widely cultivated azaleas[J]．Nature Communications，2020，11：5269．

[12] 廖望儀，沈芳杰，周洋麗，等．石蒜屬種質(zhì)資源花色多樣性與花色苷相關(guān)性分析[J]．植物生理學(xué)報(bào)，2021，57(10)：2024–2032．

[13] CHEN W，GONG L，GUO Z L，et al．A novel integrated method for large-scale detection，identification，and quantification of widely targeted metabolites：application in the study of rice metabolomics[J]．Molecular Plant，2013，6(6)：1769–1780．

[14] 楊赟．‘華仲12號(hào)’杜仲葉片呈紅色的代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析[D]．鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019．

[15] 尹旭敏，曾小峰，商桑，等．基于Lab色空間分析塔羅科血橙果酒陳釀中色澤的變化[J]．南方農(nóng)業(yè)，2020，14(1)：45–49．

[16] ZHU Z J，SCHULTZ A W，WANG J H，et al．Liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectro- metry characterization of metabolites guided by the METLIN database[J]．Nature Protocols，2013，8(3)：451–460．

[17] BOCCARD J，RUTLEDGE D N．A consensus orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) strategy for multiblock Omics data fusion[J]．Analytica Chimica Acta，2013，769：30–39．

[18] ZHANG Z H，HE J Q，NIN W W，et al．Biomarkers of obstructive nephropathy using a metabolomics approach in rat[J]．Chemico-Biological Interactions，2018，296：229–239．

[19] 余僉．Python語言在數(shù)據(jù)分析處理中的應(yīng)用[J]．電腦編程技巧與維護(hù)，2022(6)：18–20．

[20] DU H，LAI L M，WANG F，et al．Characterization of flower colouration in 30species via anthocyanin and flavonol identification and quantitative traits[J]．Plant Biology，2018，20(1)：121–129．

[21] 胡彬．報(bào)春苣苔屬植物花色變異的生化基礎(chǔ)及轉(zhuǎn)基因體系的構(gòu)建[D]．廣州：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，2017．

[22] 李敏，羅宇婷，盧小草，等．鴛鴦茉莉開花過程中花青素組成的變化[J]．熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2018，26(6)：627–632．

[23] 張寶智，胡永紅，韓繼剛，等．七個(gè)江南牡丹品種花瓣中類黃酮物質(zhì)分析[J]．北方園藝，2013(2)：61–65．

[24] 夏溪，龔睿，張春英．不同顏色錦繡杜鵑花瓣中花青素苷組成及呈色機(jī)制[J]．江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2022，38(1)：207–213．

Metabolomics-based analysis of flower color differences between white-pinkand purple

ZHANG Hui，SHEN Shouyun*，LIAO Qiulin，ZHU Ninghua

(College of Landscape Architecture, Central South University of Forestry and Technology, Changsha, Hunan 410004, China)

The purple flowers and white pink flowers ofwere selected during the flowering process including all-green stage, showing red stage, early flowering stage and full blooming stage. Determination of metabolites ofpetals was conducted based on ultra performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS). The differential metabolites were screened by orthogonal partial least squares discriminant analysis(OPLS-DA), and the key differential metabolites associated with flower color were screened by enrichment analysis using the KEGG database, and the correlation analysis was used to verify the correlation between the key metabolites and flower color ofThe results showed thata total of 1057 metabolites were detected in the petals of, including 243 differential metabolites, which were significantly enriched in flavonoid and anthocyanin metabolic pathways, and the content ofmalvidin-3-O-glucoside in the petals of purple-floweredwas much higher than that of white-pink-flowered.Therefore, it is speculated that malvidin-3-O-glucoside is the key anthocyanin for the purple color ofpetals. Dihydromyricetin and gallocatechin affect the synthesis of anthocyanins through the flavonoid synthesis pathway, which in turn affects the flower color of.

; petal color; metabolomics; ultra performance liquid chromatography-tandemmass spectrometry(UPLC-MS/MS); flavonoid pathway

S685.21

A

1007-1032(2022)04-0430-06

張卉，沈守云，廖秋林，朱寧華．基于代謝組學(xué)分析的紫色和白粉色花的鹿角杜鵑呈花色物質(zhì)差異[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2022，48(4)：430–435．

ZHANG H，SHEN S Y，LIAO Q L，ZHU N H．Metabolomics-based analysis of flower color differences between white-pinkand purple[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2022，48(4)：430–435．

http://xb.hunau.edu.cn

2022–02–20

2022–05–08

中央財(cái)政林業(yè)科技推廣示范項(xiàng)目(XLK202213)

張卉(1996—)，女，湖南邵陽人，碩士研究生，主要從事風(fēng)景園林規(guī)劃與設(shè)計(jì)研究，782263079@qq.com；*通信作者，沈守云，博士，教授，主要從事風(fēng)景園林規(guī)劃與設(shè)計(jì)、生態(tài)恢復(fù)工程研究，shenshouyun@sina.com

責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維