汞脅迫對脊尾白蝦肌肉組織損傷及免疫相關酶活性的影響

王林華，歐陽樂飛，高威，段健誠，張慶起，高煥,2,3

（1.江蘇海洋大學海洋科學與水產學院，江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222001；3.江蘇省農業(yè)種質資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014；4.連云港贛榆佳信水產開發(fā)有限公司，江蘇 連云港 222100）

汞的毒性極強，已被我國和世界衛(wèi)生組織等諸多國家和機構列為優(yōu)先控制污染物[1,2]。人類活動過程中向大自然排放了大量的重金屬汞及其化合物[3]。汞在自然界中主要以單質汞、有機汞化合物和無機汞化合物三種形態(tài)存在，形態(tài)不同，毒性也不同[4]。自然界中無機汞較少，毒性相對較小，但長期暴露在其中會引起慢性中毒[4]。目前有關汞對水產動物的毒性研究主要集中于汞對水產動物酶活性的影響及其機制[5]。研究表明，汞能與大西洋鮭（Salmo salar）等水產動物體內的谷胱甘肽過氧化物酶等相結合，降低其清除自由基的能力，使體內的脂質過氧化物含量升高，導致細胞死亡[6,7]。汞還能顯著影響抗氧化物酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶等酶的活性[8,9]和金屬硫蛋白[10]等蛋白的結構和表達。Li 等[11]研究了低溫下汞脅迫下草魚抗氧化防御系統(tǒng)和基因表達情況。這些研究主要從生理響應角度展開，但對機體的物理結構損傷還鮮見報道。

脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）是我國特有經(jīng)濟蝦之一，以黃渤海產量最高。脊尾白蝦由于具有繁殖力強、生長快、味道鮮美和環(huán)境適應性廣等特點，已成為我國沿海地區(qū)重要的混養(yǎng)種類之一，其產量僅次于中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）和中國毛蝦（Acetes chinensis）[12-14]。目前關于脊尾白蝦的研究主要集中在養(yǎng)殖技術[15]和生物學特性[16]等方面，汞對脊尾白蝦影響的研究還較少，關于汞對脊尾白蝦的肌肉組織結構影響的研究還未見報道。近年來，隨著工業(yè)的發(fā)展，水域環(huán)境受污染日益嚴峻，嚴重威脅水產品質量安全[17]。養(yǎng)殖水體中重金屬污染嚴重影響?zhàn)B殖對象的生理機能和組織形態(tài)，且生物長期暴露在低濃度污染的水體中，會引起多種組織病理學變化，根據(jù)生物體的組織結構病理變化來監(jiān)測養(yǎng)殖水體的污染程度及危害程度[18]。而肌肉組織細胞是維持肌肉組織正常功能的基本單位，一旦肌肉組織無法正常工作，會影響動物取食和避敵能力，影響其生存能力[19]。脊尾白蝦可食用部分主要是肌肉，而肌肉質量占全蝦質量最多，其所含有害金屬含量百分比較高[20]。肌肉組織中的酶活力變化可以反映肌肉損傷程度[21]。本文通過檢測超氧化物歧化酶（SOD）活力，用石蠟切片和H.E.染色的方法觀察了不同濃度汞脅迫下脊尾白蝦肌纖維的變化特征，以期為揭示重金屬對甲殼類的毒害作用及其機制提供幫助。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用脊尾白蝦平均體長（4.5±0.5）cm，平均體質量（1.5±0.5）g，來自江蘇省連云港市本地養(yǎng)殖場，經(jīng)兩周實驗室暫養(yǎng)。暫養(yǎng)期間鹽度26，水溫（25±1）℃，pH8.2～8.3，溶解氧在5 mg/L 以上，每天早上8 點和晚上6 點投喂餌料，自然光照。將體質健壯、體色正常、規(guī)格一致的健康脊尾白蝦隨機分組進行脅迫實驗。實驗前24 h 停止投喂。

1.2 方法

根據(jù)參考文獻[22]，實驗設3 個汞離子濃度梯度：0 g/L（對照組）、1×10-6g/L，3×10-6g/L 和1×10-5g/L，汞（Hg2+）溶液由氯化汞（HgCl2）配置。每組設三個重復，每個重復放22 尾蝦。實驗期間不間斷充氧，溶解氧在5 mg/L 以上，鹽度26，水溫（25±1）℃，實驗容器為60 L（50 cm×40 cm×30 cm）的藍色水箱。自然光照，早8 點和晚6 點清理糞便和死蝦。實驗期間不換水，不投喂，分別在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 和96 h 記錄各組試驗蝦的中毒癥狀及死亡情況，每個時間點每組取3 尾蝦，取0.2 g 肌肉組織先用液氮速凍，再放入-80℃保存，用于測定SOD活性；另取0.5 cm3肌肉組織用Bouin’s 固定液固定，用于組織切片。

1.2.1 脊尾白蝦肌肉組織中SOD 活力的測定

取0.2 g 肌肉組織加入1.8 mL 的生理鹽水，冰浴下勻漿，2 500 r/min 離心10 min，取上清液用生理鹽水按照1∶4 稀釋成2%的組織勻漿，待測。根據(jù)南京建成生物工程研究所SOD 試劑盒采用羥胺法測定SOD 活性，即每mg 組織蛋白在1 mL 反應液中SOD 抑制率達50%時所對應的SOD 量為一個SOD 活力單位（U/mg）。

1.2.2 脊尾白蝦肌肉組織切片

迅速取出肌肉組織放入Bouin’s 固定液中固定24 h，乙醇梯度脫水，用二甲苯透明，石蠟包埋，KD-1508A 輪轉式切片機連續(xù)切片，切片厚度為6 μm，蘇木素-伊紅染色，Nikon 90i（日本）全自動電動顯微鏡觀察拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用mean±SD 表示，用統(tǒng)計分析軟件SPSS 18.0 進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和多重比較（LSD 法），差異顯著水平設為P<0.05。數(shù)據(jù)結果用Origin 2018 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度汞脅迫對脊尾白蝦肌纖維結構的影響

不同濃度的汞脅迫后，脊尾白蝦的肌纖維變化如圖1 所示。對照組脊尾白蝦（圖1-a）肌纖維在不同區(qū)域聚集成束狀，排列緊密。在濃度為1×10-6g/L、3×10-6g/L 和1×10-5g/L Hg2+的脅迫下，脊尾白蝦肌纖維結構在6 h、12 h、24 h 和48 h 變化不明顯。汞脅迫72 h 后，養(yǎng)殖水體中Hg2+的濃度為1×10-6g/L 時，脊尾白蝦的肌纖維變化不明顯（圖1，72-2）；而Hg2+的濃度為3×10-6g/L 時，脊尾白蝦肌纖維有溶解的現(xiàn)象（圖1，72-3）；Hg2+的濃度為1×10-5g/L時，脊尾白蝦肌纖維比3×10-6g/L 時溶解的區(qū)域更多（圖1，72-4）。脊尾白蝦經(jīng)過Hg2+脅迫96 h 后，Hg2+的濃度為1×10-6g/L 時，脊尾白蝦的肌纖維有溶解現(xiàn)象（圖1，96-2）；Hg2+的濃度為3×10-6g/L時，脊尾白蝦肌纖維比1×10-6g/L 溶解的區(qū)域更多（圖1，96-3）；當Hg2+的濃度增加到1×10-5g/L 時，脊尾白蝦肌纖維有部分斷裂（圖1，96-4）。

2.2 不同濃度汞脅迫脊尾白蝦SOD 活力的變化特征

不同濃度汞脅迫下，脊尾白蝦SOD 活力的變化特征如圖2 所示。不同濃度Hg2+脅迫后，隨時間的變化，脊尾白蝦肌肉組織中的SOD 活力先下降后上升，24 h 時達到最低值，各濃度汞脅迫組（1×10-6g/L、3×10-6g/L 和1×10-5g/L）的最低值分別為6.65 U/mg、6.42 U/mg 和6.89 U/mg。本研究表明，與空白對照組相比，在72 h 之前，各Hg2+濃度脅迫組的脊尾白蝦肌肉組織中SOD 活力顯著下降（P<0.05），而在72～96 h 時，各Hg2+濃度脅迫組的SOD 活力明顯上升。Hg2+的濃度為1×10-6g/L 時，在96 h 時SOD活力達到最高，為24.639 U/mg，而Hg2+的濃度為3×10-6g/L 和1×10-5g/L 時，在72 h 時SOD 活力達最高，分別為21.744 U/mg 和25.780 U/mg。與對照組相比，在6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 和96 h 時，脅迫組（1×10-6g/L、3×10-6g/L 和1×10-5g/L）與對照組差異顯著（P<0.05）。

3 討論

3.1 重金屬對水生動物機體物理損傷的影響

重金屬主要是通過水生動物的呼吸、吞食和皮膚進入體內，通過一系列化學反應將重金屬轉變成水溶性高且易于排出體外的化合物[23]。但是，有研究表明，水生動物中肌肉組織中的重金屬比鰓、胃腸和肝臟更難排出體外[24]，而更容易積累在肌肉組織中。肌原纖維會隨重金屬處理時間的延長出現(xiàn)斷裂[25,26]。脊尾白蝦肌肉組織不僅給人類提供營養(yǎng)物質，同時也承擔著運動功能。因此，脊尾白蝦的肌肉損傷影響了食品的品質和安全，也降低其運動功能和免疫功能[27]。Lourduraj 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，重金屬可使蟹的肌肉等組織畸形，隨重金屬濃度升高，損害程度加強。背角無齒蚌（Anodonta woodiana）經(jīng)過Cu2+脅迫后，腎臟組織出現(xiàn)腺上皮細胞分布散亂，甚至破碎等現(xiàn)象[29]。隨著銅鎘的濃度增加，鯽（Carassius auratus）的肌纖維溶解和斷裂，嚴重損傷肌肉組織[27]。這與本實驗結果一致，可能是隨著汞對脊尾白蝦脅迫時間的增加，汞在脊尾白蝦體機體內的濃度升高，肌纖維受損，導致肌纖維受損，出現(xiàn)溶解和斷裂現(xiàn)象。而李濤[21]研究結果表明，鯽受重金屬污染，脾臟組織結構發(fā)生改變，而肌肉組織沒有病理學特征。這與本實驗結果有所不同，這可能與物種差異和養(yǎng)殖環(huán)境的影響有關。

本研究中，在72 h 和96 h 時，各個組均與48 h及以前的肌肉結構有一定差異，這可能是汞對脊尾白蝦肌肉組織的損傷不僅存在劑量效應，還存在時間效應，即隨著汞濃度的增加和脅迫時間的延長，肌肉組織的損傷程度均明顯加重，這與王蘭[25]和涂葉綠[27]等的研究結果一致。

3.2 不同濃度汞脅迫脊尾白蝦SOD 活力的變化特征

氧通過還原反應生成一些活性氧（ROS）代謝物，如超氧陰離子自由基（O2-）和羥自由基（HO-）等[30]。一般情況下，機體代謝需要少量ROS 來參與，但是也存在清除ROS 的過程，因此生物體內ROS 含量在一定范圍內保持動態(tài)平衡[30,31]。當生物體受到環(huán)境脅迫時，機體ROS 產生過多，超過機體本身的清除能力，導致機體受損。水產動物在進化過程中形成了有效的抗活性氧系統(tǒng)[32,33]，包括酶和非酶系統(tǒng)，酶系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等[34]。汞可以通過抑制水產動物的抗氧化酶活性來影響其防御機制[5]，而SOD 是抗活性氧的第一道防線，廣泛存在于生物體當中[35,36]。SOD 通過將O2-歧化成O2和H2O2來清除超氧陰離子，保持ROS 系統(tǒng)的平衡，這對機體預防損傷和抗氧化有重要作用[30,37,38]。脊尾白蝦受到汞脅迫時，體內會產生相應的酶來抵抗體內的重金屬離子，其中SOD 能歧化超氧陰離子自由基產生H2O2，清除機體有害自由基[39]。Morcillo 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，汞等重金屬會導致硬骨魚細胞產生過量的活性氧，導致抗氧化酶系統(tǒng)失去平衡，引起細胞凋亡。

管越強等[41]研究表明，肌肉SOD 活力隨低氧脅迫時間延長先降低后升高，在8 h 達到最低，9.5 h之后有所上升，這與本實驗SOD 活力變化相似。而呼光富等[31]研究表明，隨著鎘脅迫時間延長，肝胰腺和觸角腺的SOD 活力先上升后下降，48 h 時達到最高，在72 h 時最低，但是仍然高于對照組。這與本試驗的研究結果有所不同，這可能是汞脅迫使脊尾白蝦體產生大量O2-被超氧化物歧化酶還原成H2O2，O2-的減少和H2O2的大量產生，導致SOD 活性下降[31]。SOD 活性隨著汞脅迫時間的延長而有上升趨勢，可能是在過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的作用下，H2O2被分解成O2和H2O，抑制解除，使得脊尾白蝦機體內的ROS 處于動態(tài)的平衡之中[37]，SOD 活力的變化反應機體清除O2-能力。

不同濃度的汞脅迫對脊尾白蝦SOD 活力和肌肉組織有毒性作用，并存在一定的“時間-效應”關系。SOD 活性間接反應了機體清除自由基的能力；隨著脅迫時間延長，脊尾白蝦機體內汞的濃度升高，肌纖維開始溶解和斷裂。上述結果表明，在水產養(yǎng)殖中，尤其是汞排放量較高的區(qū)域，需要特別關注汞脅迫對脊尾白蝦的生長和食用安全性的不利影響。