水產(chǎn)動(dòng)物小分子熱休克蛋白家族研究進(jìn)展

李婷婷，孫繼紅，韓森榮，劉麗，鄒雯靜，宋堅(jiān)，常亞青，湛垚垚

（大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023）

熱休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs），又稱熱應(yīng)激蛋白，是一類廣泛存在于原核和真核生物體內(nèi)具有高度保守性的生物大分子[1]。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量，可將熱休克蛋白分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60 和小分子熱休克蛋白（Small heat shock proteins，sHSPs5 個(gè)主要家族[2]。sHSPs 是指相對(duì)分子質(zhì)量介于12～30 kDa 的熱休克蛋白[3]。根據(jù)其結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)部位，又進(jìn)一步分為Ⅰ類和Ⅱ類兩個(gè)主要亞家族。Ⅰ類亞家族成員無(wú)組織特異性表達(dá)，能參與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiqutin-proteasome system,UPS）介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過(guò)程，包括HSPB1、HSPB5、HSPB6 和HSPB8；Ⅱ類亞家族成員具有組織表達(dá)特異性，在哺乳動(dòng)物的肌源性組織、睪丸組織和眼晶狀體等部位特異性表達(dá)，包括HSPB2、HSPB3、HSPB4、HSPB7、HSPB9 和HSPB10[4,5]。除了典型Ⅰ類和Ⅱ類兩類亞家族成員外，在后來(lái)的研究中又先后鑒定出了HSPB11、HSPB12 和HSPB15，3個(gè)非典型成員（表1）。

表1 常見(jiàn)小分子熱休克蛋白家族成員統(tǒng)計(jì)Tab.1 Summary of members in common small heat shock proteins sub-family

截至2021 年4 月，美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的sHSPs 家族基因序列信息多達(dá)10 858 條，其中所占比例較高的物種為哺乳動(dòng)物（992 條；占比9.14%）和水產(chǎn)動(dòng)物（814 條；占比7.50%）。但是，相較于哺乳動(dòng)物，水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 家族成員的研究相對(duì)滯后，主要集中在魚(yú)類、腔腸動(dòng)物及軟體動(dòng)物。研究表明，sHSPs 不僅在水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，還可能參與介導(dǎo)水產(chǎn)動(dòng)物的免疫防御反應(yīng)。為進(jìn)一步了解水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及生物學(xué)功能，本文綜述了近年來(lái)水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 家族成員的序列特征、進(jìn)化特點(diǎn)及生物學(xué)功能進(jìn)行，旨在豐富水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 家族基因的研究數(shù)據(jù)，為深入了解水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 家族基因成員的生物學(xué)信息提供參考。

1 sHSPs 家族成員的特征

1.1 sHSPs 家族成員的分子結(jié)構(gòu)特征

sHSPs 家族成員都具有可變的N 端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD），靈活的C端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）和高度保守的α-晶狀體結(jié)構(gòu)域（alpha-crystalline domain，ACD）[17-19]。其中，NTD 由24～247 個(gè)氨基酸殘基組成，富含芳香族氨基酸殘基；NTD 的主要作用是影響sHSPs 低聚物的結(jié)構(gòu)和發(fā)揮分子伴侶（Molecular chaperone）功能[18]。CTD 的氨基酸殘基個(gè)數(shù)大都小于20 個(gè)，高度保守的IXI/V 結(jié)構(gòu)將CTD 分為“尾巴”和“延伸”結(jié)構(gòu)。CTD 的主要功能是增加sHSPs 四級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和復(fù)合物的溶解性。ACD 是由90～100 個(gè)氨基酸殘基組成的β-三明治夾心結(jié)構(gòu)，由7 或8 個(gè)反向平行的β-折疊片層構(gòu)成，哺乳動(dòng)物的sHSPs 缺乏β6 鏈，ATD 的主要功能是形成sHSPs 二聚體[19]（圖1）。

1.2 sHSPs 家族成員的表達(dá)特征

sHSPs 為最常見(jiàn)的分子伴侶，在發(fā)揮作用時(shí)會(huì)形成大型動(dòng)態(tài)低聚物。該低聚物呈空心球狀，在沒(méi)有與目標(biāo)蛋白結(jié)合前以非活性的形式存在[1]。當(dāng)機(jī)體受到外源刺激或脅迫（如高溫、低氧或磁場(chǎng)干擾等）而出現(xiàn)蛋白質(zhì)折疊紊亂時(shí)，機(jī)體內(nèi)的sHSPs 從非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，以不依賴ATP 的形式與錯(cuò)誤折疊的蛋白（目標(biāo)蛋白）相結(jié)合，將其隔離在低聚復(fù)合物中，并通過(guò)依賴ATP 的大分子熱休克蛋白促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白的重新折疊，保證應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[20]；當(dāng)外源刺激或脅迫消失后，隨著錯(cuò)誤折疊蛋白的減少，sHSPs 又逐漸恢復(fù)到非活性狀態(tài)[9,15,16]。除了非活性狀態(tài)到激活狀態(tài)的轉(zhuǎn)變之外，sHSPs 相對(duì)表達(dá)量的顯著增加也是機(jī)體內(nèi)sHSPs 家族成員響應(yīng)外源刺激或脅迫的策略之一[6,21,22]。Pedro 等[21]對(duì)搖蚊幼蟲(chóng)Chironomus riparius進(jìn)行了熱休克（35℃）和異源物（鎘，Cd）處理。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，熱休克組和異源物處理組中搖蚊幼蟲(chóng)的hsp27 基因的相對(duì)表達(dá)量都顯著增加；還有研究證實(shí)，鼠海馬體神經(jīng)元細(xì)胞的hspb1、hspb5、hspb6、hspb8 和hspb11 基因在亞砷酸、氧化和應(yīng)激條件下的相對(duì)表達(dá)量都顯著增加[6]。

2 水產(chǎn)動(dòng)物中sHSPs 的研究進(jìn)展

2.1 水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 家族的主要種類及系統(tǒng)進(jìn)化分析

目前，水產(chǎn)動(dòng)物的sHSPs 家族成員主要集中在Ⅰ類亞家族（占比52.17%），而歸屬于Ⅱ類亞家族（占比33.33%）和其他亞家族（占比14.50%）的成員較少（表2）。將18 種水產(chǎn)動(dòng)物中歸屬于Ⅰ類亞家族的sHSPs 的核苷酸序列與5 種哺乳動(dòng)物和1 種兩棲動(dòng)物中相應(yīng)的sHSPs 的核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)（圖2），水產(chǎn)動(dòng)物的HSPB1（除斑點(diǎn)叉尾Ictalurus punctatus 和克氏原螯蝦Procambarus clarkii 外）聚為一支，最終與哺乳動(dòng)物和兩棲動(dòng)物聚為一大支，表明HSPB1 在物種進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守。哺乳動(dòng)物和兩棲動(dòng)物的HSPB8 亞型聚為較近的一支，最終與水產(chǎn)動(dòng)物中的魚(yú)類聚為一大支；水產(chǎn)動(dòng)物中棘皮類的HSPB8 亞型和細(xì)粒棘球蚴Echinococcus granulosus 單獨(dú)聚為一支，提示水產(chǎn)動(dòng)物的HSPB8 亞型種內(nèi)的差異性較大，且存在明顯的種間分化現(xiàn)象。哺乳動(dòng)物和兩棲動(dòng)物的Ⅰ類亞家族中的HSPB6 亞型聚為較近的一支，但是，水產(chǎn)動(dòng)物中的魚(yú)類和棘皮類的HSPB6 亞型則分別聚為一支。值得注意的是，哺乳動(dòng)物和兩棲動(dòng)物的HSPB6 亞型最終沒(méi)有與水產(chǎn)動(dòng)物的HSPB6 亞型聚為一大支，而是與所有動(dòng)物的HSPB5 亞型聚為一大支。這一結(jié)果在一定程度上證實(shí)了水產(chǎn)動(dòng)物的HSPB6 亞型種內(nèi)差異性較大，種間分化明顯，與哺乳動(dòng)物和兩棲動(dòng)物的HSPB6 亞型親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與哺乳動(dòng)物和兩棲動(dòng)物的HSPB5 亞型親緣關(guān)系較為密切。

表2 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中27 種水產(chǎn)動(dòng)物小分子熱休克蛋白家族成員核苷酸序列統(tǒng)計(jì)（截至2021 年3 月）Tab.2 Statistics of the nucleotide sequences of the members of the small-molecule heat shock protein family in 27 species aquatic animals in the NCBI database（up to March 2021）

將8 種水產(chǎn)動(dòng)物歸屬于Ⅱ類亞家族的sHSPs的核苷酸序列與3 種哺乳動(dòng)物和1 種兩棲動(dòng)物中歸屬于Ⅱ類亞家族的sHSPs 核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)（圖3），所有分析物種（除斑點(diǎn)叉尾外）中的HSPB2 和HSPB3 亞型聚為一大支，HSPB9和HSPB10 亞型聚為一大支，表明HSPB2 和HSPB3亞型，HSPB9 和HSP10 亞型的核苷酸序列較相近，親緣關(guān)系較密切。所有動(dòng)物的HSPB7 亞型聚為較近的一大支。此結(jié)果表明，水產(chǎn)動(dòng)物、哺乳動(dòng)物和兩棲動(dòng)物的HSPB7 亞型在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守。

2.2 水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 家族的生物學(xué)功能

2.2.1 分子伴侶功能

分子伴侶是能夠識(shí)別并結(jié)合錯(cuò)誤折疊或裝配，而本身不參與最終產(chǎn)物形成的一類蛋白[1]。αA-晶狀體蛋白（αA-crystallin）是最早被發(fā)現(xiàn)具有分子伴侶功能的sHSPs[22]，隨后也證實(shí)，許多其他的sHSPs具有分子伴侶活性[15,16]。如在對(duì)小鼠αB-晶狀體蛋白（αB-crystallin）進(jìn)行敲除后發(fā)現(xiàn)，鄰近的hspb2基因也受到破壞，αB-晶狀體蛋白和hspb2 基因功能的喪失導(dǎo)致小鼠骨骼肌的退化[23,24]。

Magda 等[15]利用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）、蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot，WB）等技術(shù)研究了受精120 h 后斑馬魚(yú)Danio rerio胚胎中的hspb8 基因。結(jié)果分析表明，HSPB8 可以作為Bag3 分子伴侶，參與形成自噬（autophagy）誘導(dǎo)復(fù)合物。Emily 等[16]使用類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技術(shù)使斑馬魚(yú)hspb7 等位基因發(fā)生突變，hspb7 基因的突變導(dǎo)致細(xì)絲蛋白（Filamin-C，F(xiàn)LNC）的功能下降，導(dǎo)致斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞修復(fù)損傷的能力下降，隨后的免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）和WB 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)HSPB7 是FLNC 的分子伴侶。

2.2.2 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化

隨著對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)某些水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞中的sHSPs 不僅具有分子伴侶功能，還參與維持機(jī)體的正常形態(tài)特征以及調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化[15,16]。

Magda 等[15]發(fā)現(xiàn)，給受精48 h 后的斑馬魚(yú)胚胎注射嗎啉寡核苷酸后能干擾阻斷HSPB8 的翻譯，減少HSPB8 蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎身體彎曲、心包水腫和生長(zhǎng)速度減慢等形態(tài)變化，證明hspb8具有維持斑馬魚(yú)胚胎形態(tài)與生長(zhǎng)的重要作用。Emily等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，敲除了hspb7 基因的斑馬魚(yú)心臟形態(tài)畸形。

2.2.3 調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞調(diào)亡（Apoptosis）又叫程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境發(fā)生改變、受到死亡信號(hào)的觸發(fā)或在基因調(diào)控下引起的細(xì)胞死亡的過(guò)程[25,26]。sHSPs 作為細(xì)胞凋亡的調(diào)控因子可以通過(guò)多種方式調(diào)控細(xì)胞凋亡[10,25-27]。

斑節(jié)對(duì)蝦Penaeus monodon 在感染對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）2 h 后，其肌肉組織中hsp21 基因的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，隨后脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（Tdt-mediated dutp nick-end labeling，TUNEL）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對(duì)蝦肌肉細(xì)胞內(nèi)DNA 片段化的細(xì)胞數(shù)量增加，其肌肉細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的癥狀，分析表明，對(duì)蝦白斑綜合癥病毒可能通過(guò)抑制斑節(jié)對(duì)蝦肌肉組織內(nèi)hsp21 基因的相對(duì)表達(dá)量而誘導(dǎo)斑節(jié)對(duì)蝦肌肉細(xì)胞的凋亡[27]。

石少婷等[10]發(fā)現(xiàn)，在櫛孔扇貝中的“p38MAPKHSP27”通路中，扇貝多肽（Polypeptide from Chlamys farreri，PCF）可通過(guò)抑制p38MAPK 的活性，降低hsp27 磷酸化水平，抑制中波紫外線誘導(dǎo)的人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT 細(xì)胞凋亡。

2.2.4 免疫調(diào)節(jié)功能

sHSP 是水產(chǎn)動(dòng)物先天性免疫（Innate immunity）的重要調(diào)節(jié)因子以及宿主和病原菌相互作用的關(guān)鍵參與者。研究證明，sHSPs 可調(diào)控水產(chǎn)動(dòng)物響應(yīng)病原菌的生理生化過(guò)程[28,29]。

Lei 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌（Vibrio harvey）感染后，太平洋牡蠣Crassostrea gigas hsp20 基因在其血細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量顯著上升。Li 等[28]通過(guò)qPCR 技術(shù)鑒定了鰻鱺弧菌Vibrio anguillarum 對(duì)菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum 中的兩種sHSPs亞型——Vpshsp-21 和Vpshsp-2 基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，VpsHSP-1 基因在6 h 和96 h 時(shí)的相對(duì)表達(dá)量顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；VpsHSP-2 基因的相對(duì)表達(dá)量在48～72 h 內(nèi)急劇增加。兩個(gè)基因的不同表達(dá)趨勢(shì)表明，Vpshsp-21 和Vpshsp-2 基因參與菲律賓蛤仔對(duì)感染鰻鱺弧菌的響應(yīng)過(guò)程[30-35]。

3 展望

綜上所述，水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 家族成員可在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞凋亡及免疫應(yīng)答等多種細(xì)胞生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，還可作為環(huán)境污染監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)記物（表3）。因此，進(jìn)一步深入研究水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 家族成員在水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育和免疫應(yīng)答等方面的功能和作用，不僅進(jìn)一步加深了對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 家族成員及生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)和理解，還可為水產(chǎn)動(dòng)物資源保護(hù)、養(yǎng)殖增產(chǎn)以及病害防控等提供一定的分子生物學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

表3 6 種水生生物中小分子熱休克蛋白對(duì)應(yīng)激源響應(yīng)表達(dá)規(guī)律的總結(jié)Tab.3 Summary of expression patterns of small heat shock proteins in 6 species aquatic organisms in response to stressors

目前水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 家族成員的序列和結(jié)構(gòu)信息仍來(lái)源于少數(shù)物種，且sHSPs 家族成員生物功能鑒定及解析的研究相對(duì)匱乏，今后應(yīng)重點(diǎn)開(kāi)展以下3 方面工作：首先，進(jìn)步擴(kuò)大水產(chǎn)動(dòng)物的種類，豐富和充實(shí)水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 家族成員的序列信息和結(jié)構(gòu)信息，理清水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 家族成員之間的系統(tǒng)進(jìn)化地位及相互聯(lián)系；其次，充分利用現(xiàn)代生物技術(shù)（如高通量測(cè)序、多組學(xué)聯(lián)動(dòng)分析等）和生物信息數(shù)據(jù)分析技術(shù)，深入開(kāi)展不同種類水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 家族成員的生物功能研究，進(jìn)一步理清不同水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 家族成員表達(dá)模式與規(guī)律的共性特征以及種屬特異性特征及其在不同生理或病理?xiàng)l件下的響應(yīng)規(guī)律，全面掌握水產(chǎn)動(dòng)物sHSPs 家族成員的生物功能；最后，在理論研究的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)評(píng)估水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中sHSPs 家族成員作為種質(zhì)選育標(biāo)記和養(yǎng)殖水環(huán)境檢測(cè)標(biāo)記物的開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值，探索水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物sHSPs 家族成員作為種質(zhì)選育標(biāo)記和養(yǎng)殖水環(huán)境檢測(cè)標(biāo)記物的有效應(yīng)用方式和方法。