硬骨魚類Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路研究進(jìn)展

周俊豪，劉念，楊映

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231）

早在1985 年就提出了氧化應(yīng)激，即氧化還原生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的一個(gè)概念[1]，它指機(jī)體遭受外界刺激時(shí)，細(xì)胞中呈現(xiàn)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。在此過程中生物機(jī)體內(nèi)的活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）是最為重要的指標(biāo)之一。生物體內(nèi)ROS 產(chǎn)生的量過高，自身抗氧化清除能力不足時(shí)，機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平就會(huì)明顯升高[2]，損傷氨基酸、線粒體、蛋白質(zhì)、核酸和染色體，誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡[3，4]，使得氧化－抗氧化系統(tǒng)失衡，使機(jī)體氧化損傷[5]。

諸多外界環(huán)境因素都可能對(duì)硬骨魚類造成氧化應(yīng)激并影響健康。例如，短期饑餓可導(dǎo)致翹嘴鱖Siniperca chuatsi 腸道氧化應(yīng)激及細(xì)胞自噬[6]；長時(shí)間的運(yùn)輸會(huì)破壞斑馬魚Brachydanio rerio var 抗氧化平衡[7]；高密度養(yǎng)殖會(huì)導(dǎo)致團(tuán)頭魴Megalobrama amblycephala 腸道氧化應(yīng)激損傷，影響其正常生長[8]。水環(huán)境中重金屬含量過多會(huì)引起大黃魚Larimichthys crocea 氧化應(yīng)激和免疫反應(yīng)[9]、水體鎘的暴露可導(dǎo)致黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco 組織損傷、氧化應(yīng)激[10]；一些過度用藥的畜禽代謝物排到水環(huán)境中也可能誘發(fā)成年斑馬魚的嚴(yán)重氧化應(yīng)激和組織損傷[11]；飼料產(chǎn)品中常見的霉菌毒素可引起草魚Ctenopharyngodon idella 的氧化損傷、細(xì)胞凋亡[12]；飼料中澤瀉烯酮也可導(dǎo)致草魚幼魚氧化損傷、細(xì)胞凋亡[13]。

Keap1-Nrf2/ARE 是近年來研究發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵抗氧化應(yīng)激通路，具有多個(gè)激活途徑來維持細(xì)胞的氧化還原平衡及代謝，可調(diào)節(jié)生物體1%～10%的基因[14]。該通路可通過調(diào)控機(jī)體的下游靶蛋白（Ⅱ相代謝酶、抗氧化蛋白/酶、蛋白酶體、抗炎因子及Ⅲ相代謝酶等），誘導(dǎo)谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（Gultathione S transferases，GST）、血紅素加氧酶-1（Heme oxygenase 1，HO-1）、NADPH 醌氧化還原酶-1（NQO1）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等保護(hù)性基因的表達(dá)，減輕機(jī)體氧化應(yīng)激損傷。研究表明：魚體內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄因子NF_E2 相因關(guān)子2（NF-E2-related factor 2,Nrf2），且高度保守，在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在正常生理狀態(tài)下，Keap1 和Nrf2 結(jié)合而發(fā)生泛素化和蛋白酶體降解，使細(xì)胞核內(nèi)Nrf2 的含量維持在相對(duì)較低水平。在氧化應(yīng)激條件下，Keap1 對(duì)Nrf2 的作用機(jī)制主要有兩種，一個(gè)是Keap1 中半胱氨酸殘基的修飾，另一個(gè)是Keap1 和Nrf2 之間蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的中斷。泛素化和降解能力減弱，細(xì)核中Nrf2 積聚，Nrf2 與抗氧化反應(yīng)元件ARE 結(jié)合后啟動(dòng)下游一系列保護(hù)性基因的表達(dá)，使機(jī)體從氧化應(yīng)激狀態(tài)恢復(fù)到正常的生理狀態(tài)。Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路對(duì)硬骨魚類的健康生長非常重要。

1 Keap1、Nrf2 和ARE 的分子基礎(chǔ)

1.1 Keap1 的分子結(jié)構(gòu)

Itoh 等[15]最早研究發(fā)現(xiàn)，Keap1 存在于從低等無脊椎動(dòng)物到靈長類動(dòng)物等多種物種中。Keap1 相對(duì)分子質(zhì)量為6 900，是一個(gè)與胞漿肌動(dòng)蛋白結(jié)合的編碼624 個(gè)氨基酸的多肽，其包含5 個(gè)結(jié)構(gòu)域[16]：N 端結(jié)構(gòu)域（NTR）、干預(yù)區(qū)（IVR）、BTB 區(qū)、雙甘氨酸重復(fù)區(qū)（DGR）和C 端結(jié)構(gòu)域（CTR）[17,18]。IVR 區(qū)富含半胱氨酸殘基，是Keap1 與氧化劑、親電子性物質(zhì)等發(fā)生反應(yīng)的區(qū)域[19]，因此IVR 區(qū)在一定程度上決定著Nrf2 的穩(wěn)定[17]。Keap1 二聚體化與BTB 區(qū)有關(guān)。該域內(nèi)某些Ser 位點(diǎn)的突變可影響Keap1 二聚化，干擾Keap1 與Nrf2 的結(jié)合[20]。該區(qū)的核心位點(diǎn)是Ser-104，其發(fā)生突變將影響Keap1 的二聚化[14]；DGR 區(qū)含有6 個(gè)雙甘氨酸重復(fù)序列是Keap1與Nrf2 的結(jié)合區(qū)。

與哺乳動(dòng)物不同的是，在魚類中發(fā)現(xiàn)了兩種Keap1：Keap1a 和Keap1b。斑馬魚Keap1a 和Keap1b分別在288、273 位點(diǎn)有一個(gè)功能性半胱氨酸殘基[21,22]。魚類兩種類型的Keap1（Keap1a 與Keap1b）在Keap1-Nrf2/ARE 通路中都顯示了它們的功能[23]。這兩者結(jié)構(gòu)與功能的差異有待進(jìn)一步研究。Nguyen等[24]分別敲除了斑馬魚Keap1a 和Keap1b 這兩種基因，并用H2O2處理使兩組斑馬魚氧化損傷，然后再使用蘿卜硫素處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素僅能提高敲除Keap1a 斑馬魚組的存活率，Keap1b 比Keap1a 更能感知蘿卜硫素。目前可以確定的是：兩種Keap1 都可與Nrf2 結(jié)合并抑制Nrf2 的活性[25]，然而應(yīng)答能力卻有所區(qū)別[26]。膽堿能顯著降低肌肉中Keap1a 和Keap1b 兩者的mRNA 水平，提高Nrf2 水平[27]，膳食丁酸鈉能提高腸道中Nrf2 的mRNA 水平時(shí)，只能降低腸道中Keap1b（而非Keap1a）的mRNA 水平[28]；黃曲霉素則是通過上調(diào)Keap1a（而不是Keap1b）來抑制Nrf2 信號(hào)，降低Nrf2 信號(hào)的水平和相關(guān)抗氧化酶的活性[29]。

1.2 Nrf2 的分子結(jié)構(gòu)

Nrf2 是一種含亮氨酸拉鏈（Basic leucine zipper，b Zip）結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，相對(duì)分子質(zhì)量為66 000，屬CNC（Cap-n-collar，CNC）調(diào)節(jié)蛋白家族。人類的Nrf2 基因有7 個(gè)功能結(jié)構(gòu)域[30]，而在魚類目前已報(bào)道的Nrf2 基因功能結(jié)構(gòu)域是前6 個(gè)，依次命名為Neh1 到Neh6[15,31]。Neh1 結(jié)構(gòu)域包含1 個(gè)堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，與sMaf 蛋白（small MAF proteins）發(fā)生相互作用[32,33]，促進(jìn)DNA 與其形成異二聚體后識(shí)別并結(jié)合ARE，啟動(dòng)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。Neh1 結(jié)構(gòu)域還參與調(diào)控Nrf2 的核轉(zhuǎn)位和降解[34]；Neh2 域是與Keap1 的Kelch 區(qū)相結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，其在調(diào)節(jié)Nrf2活性中非常關(guān)鍵[15]；Neh3 域既具活化轉(zhuǎn)錄的功能，也能夠影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[35]；Neh4 與Neh5 是兩個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域，都具有大量的酸性氨基酸殘基。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域都能與轉(zhuǎn)錄激活因子CBP（CREB-binding protein）結(jié)合，促進(jìn)下游靶基因轉(zhuǎn)錄[36,37]；Neh6 域具有大量絲氨酸殘基，可在氧化應(yīng)激時(shí)促進(jìn)Nrf2 的降解，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究[38]。

1.3 ARE 基因序列

ARE 是一個(gè)特異的DNA－啟動(dòng)子結(jié)合區(qū)域。不同ARE 的堿基序列不同[39]，但越來越多的研究表明，具有典型功能活性ARE 的長度為16 個(gè)核苷酸序列，其中5 個(gè)核苷酸是可變的，因此基因組中ARE 具有多樣性。

ARE 是重要的抗氧化反應(yīng)元件。在正常狀態(tài)時(shí)，ARE 的轉(zhuǎn)錄抑制因子Bach1（CNC 類似物）與小分子蛋白Maf 結(jié)合形成二聚體，防止Nrf2 與ARE結(jié)合；機(jī)體受到氧化應(yīng)激后，Nrf2 解離進(jìn)入胞核，與Maf 或Jun 蛋白、Fos 蛋白形成異二聚體，然后再與ARE 特異性結(jié)合，激活相應(yīng)靶基因[40,41]。

2 Keap1-Nrf2/ARE 通路的激活機(jī)制

目前關(guān)于Nrf2 激活機(jī)制的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展（圖1）。Keap1 是一種直接與Nrf2 結(jié)合并負(fù)向調(diào)節(jié)Nrf2 轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)[15]。Nrf2 活化后可與ARE 結(jié)合激活多種抗氧化基因，但Nrf2 的持續(xù)激活也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞組織氧化應(yīng)激損傷[42]。Keap1 是泛素連接酶的銜接蛋白，Keap1 依靠E3 泛素連接酶促使Nrf2 以Keap1 依賴的方式泛素化，被蛋白酶體系統(tǒng)降解[43,44]，這使得Nrf2 蛋白水平在非應(yīng)激條件下較低。Nrf2 激活化合物，攻擊高活性半胱氨酸殘基來抑制Keap1 的功能，并穩(wěn)定Keap1-Nrf2 結(jié)合。因此在非應(yīng)激條件下Nrf2 以Keap1-Nrf2 復(fù)合體的形式存在[45]。

Nrf2 的活化主要是Keap1 介導(dǎo)的泛素化對(duì)其降解作用減弱。Keap1 的Cys273 和Cys288 殘基會(huì)抑制Nrf2 核積聚，但用親電試劑可將半胱氨酸殘基突變?yōu)楸彼?，可使依賴于Keap1 的泛素化降低。位于BTB 區(qū)的Cys151 被氧化或共價(jià)修飾時(shí)，可使Keap1 對(duì)Nrf2 的抑制和泛素化減少[46]。除了Keap1依賴的降解，磷酸也可調(diào)節(jié)Nrf2 蛋白化。Nrf2 作為胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（Protein kinase RNAlike ER kinase，PERK）的底物，可被其直接磷酸化觸發(fā)Nrf2-Keap1復(fù)合物的解離；磷脂酰肌醇3 激酶（Phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PIK3）可通過重排絲狀肌動(dòng)蛋白的方式來改變Nrf2 的結(jié)構(gòu)進(jìn)而激活Nrf2；蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinases，MAPKs）和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（Extracellular signal regulated kinase，ERK）可以直接磷酸化Neh2 的Ser-40 來激活Nrf2[47]（圖1）。

3 Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路在魚類中的抗氧化功能

3.1 抗氧化作用

魚類的生長與飼料營養(yǎng)成分的比例息息相關(guān)。如膽堿缺乏可引起肝臟和腸道的氧化損傷[48,49]，導(dǎo)致多種疾病。Pei 等[50]給建鯉Cyprinus curpiovar Jian幼魚飼喂不同含量膽堿的飼料65 d，然后測(cè)定肝胰腺和腸組織的抗氧化酶活性及相關(guān)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)膳食膽堿缺乏下調(diào)了肝胰腺中錳超氧化物歧化酶（MnSOD）、血漿谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）以及Keap1b、GST 的mRNA 水平和腸道Nrf2 蛋白水平，同時(shí)上調(diào)了肝胰腺中GPx、Keap1a 和PKC 的mRNA 水平，證明膽堿缺乏引起的氧化損傷與肝細(xì)胞和小腸中抗氧化酶的Nrf2-Keap1 信號(hào)分子的轉(zhuǎn)錄變化有關(guān)。色氨酸是魚類必需的氨基酸，對(duì)魚類的生長具有重要意義[51]。Ke 等[52]用不同含量的色氨酸飼料飼養(yǎng)團(tuán)頭魴，以了解色氨酸對(duì)機(jī)體抗氧化能力和免疫應(yīng)答的影響使。結(jié)果表明，一定色氨酸含量的飼料可升高團(tuán)頭魴體內(nèi)SOD、過氧化氫酶（CAT）、總抗氧化能力（T-AOC）和GSH 的活性，顯著改善了團(tuán)頭魴機(jī)體內(nèi)Nrf2 水平，顯著降低Keap1的mRNA 水平；Liang 等[53]則評(píng)估了精氨酸對(duì)團(tuán)頭魴幼魚腸道抗氧化狀態(tài)和免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)精氨酸可有效提高GPX、銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD）活性，T-AOC 活性和GSH 活性，顯著提高總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性和CAT 活性。精氨酸提高了團(tuán)頭魴幼魚Nrf2 的mRNA 水平，降低了Keap1 的mRNA 水平；Zhen 等[54]研究了在池塘滾道養(yǎng)殖系統(tǒng)（IPR）中放養(yǎng)密度對(duì)團(tuán)頭魴引起的氧化應(yīng)激，評(píng)估了高密度脅迫對(duì)團(tuán)頭魴生長性能、抗氧化參數(shù)和Nrf2 的影響，發(fā)現(xiàn)高密度誘導(dǎo)了抗氧化防御涉及修飾Nrf2-Keap1 信號(hào)分子的酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

上述研究表明：無論是膳食營養(yǎng)或環(huán)境因素導(dǎo)致的硬骨魚類抗氧化活性的增強(qiáng)或抑制，其途徑都是通過調(diào)控Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路。因此，可認(rèn)為以Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路介導(dǎo)II 相解毒酶和抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄是細(xì)胞抗氧化機(jī)制中的關(guān)鍵通路。

3.2 抗炎癥反應(yīng)

HO-1 可抑制NF-κB（Nuclear Factor Kappa B）依賴的TNF-α 的生成，這種抗炎作用可能與Nrf2抑制NF-κB 活性有關(guān)。Jia 等[55]用H2O2作為活性氧誘導(dǎo)羅非魚Oreochroms mossambcus 氧化應(yīng)激造成肝損傷，評(píng)估潛在的分子機(jī)制。結(jié)果表明，72 h 內(nèi)高水平的H2O2顯著提高了GPT、GOT 和AKP 活性和丙二醛（MDA）含量，顯著降低了SOD、GSH、CAT、GST 和T-AOC 活性。抑制了Nrf2/keap1 途徑、HO-1、NQO1 和GST 等下游基因，通過上調(diào)NF-κB、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等mRNA 的表達(dá)而引起免疫毒性，激活炎癥反應(yīng)。這說明Nrf2/Keap1 和NF-κB信號(hào)通路在魚類氧化應(yīng)激性肝損傷中起重要作用；Jia 等[56]還研究了抗氧化藥物白藜蘆醇對(duì)羅非魚氧化應(yīng)激性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。結(jié)果表明，白藜蘆醇的調(diào)控機(jī)制主要是通過增強(qiáng)HO-1 等的mRNA 水平，激活了Nrf2 信號(hào)通路，抑制NF-κB 信號(hào)通路，降低IL-1β、TNF-α 等水平，從而降低H2O2所致肝損傷的炎癥反應(yīng)；Zhang 等[57]探討了左旋肉堿在拉氏Rhynchocypris lagowskii Dybowski 體內(nèi)外的作用，測(cè)定了Keap1、Nrf2、Maf 和HO-1 的mRNA 水平發(fā)現(xiàn)，左旋肉堿可以調(diào)控Nrf2/Keap1 通路的活化，抑制拉氏體內(nèi)的NF-κB 信號(hào)通路來治療由膳食氧化魚油引起的拉氏炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果說明：氧化應(yīng)激與炎癥有關(guān)，炎癥過程可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激也可通過激活多種途徑刺激炎癥反應(yīng)，其機(jī)制都與Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路密切相關(guān)，今后可以此為方向做進(jìn)一步的研究。

4 硬骨魚類Keap1-Nrf2/ARE 通路激活劑

Keap1-Nrf2/ARE 相關(guān)通路的激活劑可以有效地抑制由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的一系列疾病。目前已開發(fā)出許多Nrf2 激活劑；一些天然及合成的小分子已被認(rèn)定為ARE 系統(tǒng)的誘導(dǎo)劑，如上文提到過的膽堿、蘿卜硫素等。Li 等[58]對(duì)二萜類化合物進(jìn)行了quinone reductase（QR）分析，新發(fā)現(xiàn)了16 種二萜類化合物是Nrf2 介導(dǎo)防御反應(yīng)的潛在激活劑，其中異海松烷類二萜類化合物（Spopelopsiin A，SA）被認(rèn)為是最有效的二萜類Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路激活劑，效價(jià)約是蘿卜硫素的5 倍。

除了一些化合物類激活劑外，中藥低污染、低副作用等優(yōu)點(diǎn)，植物中藥有效成分對(duì)氧化應(yīng)激作用的研究也越來越多。例如姜黃素是從植物姜黃中提取的黃色色素[59]。目前已證實(shí)，它可以通過修飾Keap1 上的半胱氨酸巰基，激活Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路[60]。已有研究表明：姜黃素可有效抑制有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱（CPF）對(duì)鯉Cyprinus carpio 造成的氧化應(yīng)激[61]；中藥腺毛菊苣（Cichorium glandulosum Boiss.et Huet）具有抗氧化活性和保護(hù)肝臟的作用[62,63]。JMa 等[64]則研究了腺毛菊苣提取物菊苣酸（Cichoric acid CRA）是否可以通過抗氧化調(diào)節(jié)對(duì)斑馬魚幼魚提供保護(hù)作用。其結(jié)果表明，CRA 激活了Keap1-Nfr2 和HO-1 通路，提高了斑馬魚體內(nèi)SOD和GSH-Px 的活性；Yu 等[65]研究了一種胡蘆巴種子提取物（Fenugreek seed extracts FSE）對(duì)團(tuán)頭魴幼魚的影響。結(jié)果表明，一定膳食比例的FSE 顯著上調(diào)了Nrf2 的mRNA 水平，下調(diào)了Keap1 的mRNA 水平，促進(jìn)幼齡團(tuán)頭魴的Nrf2 抗氧化能力和免疫應(yīng)答；大黃素來源于許多廣泛使用的中藥材[66]。Son等[67]研究證明，大黃素增強(qiáng)了血清免疫和抗氧化酶活性，通過Nrf2-Keap1 信號(hào)增強(qiáng)了團(tuán)頭魴的抗氧化能力，大黃素可作為一種有效的免疫刺激劑，用于保護(hù)生物體由氧化脂質(zhì)引起的氧化應(yīng)激。植物提取物不僅低污染、低副作用，有些甚至成本很低，非常適用于一些硬骨魚類的大規(guī)模養(yǎng)殖，今后可以此為方向進(jìn)行Keap1-Nrf2/ ARE 信號(hào)通路激活劑的研究。

5 結(jié)語

Keap1-Nrf2/ARE 通路在抗氧化應(yīng)激損傷中扮演著重要角色，但是有關(guān)魚類Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路的報(bào)道并不多見。有關(guān)魚類Keap1-Nrf2/ARE通路與其他信號(hào)通路之間交互作用、魚類和陸生動(dòng)物Keap1-Nrf2 之間差異的研究更是少見。與陸生動(dòng)物不同，硬骨魚類的Keap1 分為Keap1a 和Keap1b兩種，但具體的功能與作用機(jī)制還尚未定論，今后可以此為切入點(diǎn)進(jìn)行更深一步的相關(guān)研究。目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已發(fā)現(xiàn)越來越多具有抗氧化活性的天然植物提取物可調(diào)控Keap1-Nrf2/ARE 通路以預(yù)防或有效解決硬骨魚類的氧化應(yīng)激問題，這為解決水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中出現(xiàn)的氧化應(yīng)激和炎癥問題提供了新的思路。