脊髓橫斷后艾灸足三里對胃黏膜損傷大鼠Nrf2/HO-1信號通路的影響

陳 英，曾 強，徐 鵬，王 川，劉桐言

(1.長沙醫(yī)學院，湖南 長沙 410205; 2.長沙醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，湖南 長沙 410205)

應激性胃黏膜損傷(Stress gastric mucosal damage,SGMD)是指機體在應激狀態(tài)下出現(xiàn)的以胃黏膜組織炎癥、糜爛和淺表性潰瘍等為特征的急性病理性反應[1]。其發(fā)病率較高，患病人數(shù)約占總人口的10%～20%，目前臨床以西藥對癥治療及手術治療為主，但存在不良反應明顯、藥物依賴性和手術風險較大等問題[2]。而艾灸作為一種無副作用的傳統(tǒng)綠色療法在 SGMD的治療中受到廣泛關注，大量實踐及臨床研究證實，艾灸能夠促進損傷胃黏膜的愈合和修復，對胃痙攣、急慢性胃炎、消化道潰瘍等病癥均具有較好的療效，然而其作用機制尚未能明確。機體氧化應激反應引起的活性氧(ROS)增多在SGMD的發(fā)生中起到重要作用，核因子E2相關因子2(Nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)可通過調節(jié)血紅素加氧酶-1(Heine oxygenase-1,HO-1)等抗氧化基因的轉錄，從而調節(jié)氧化還原狀態(tài)，進一步預防胃黏膜氧化損傷[3]。有研究表明[4-5]，艾灸足三里等足陽明經(jīng)穴可通過抗氧化作用發(fā)揮對應激性胃潰瘍的治療功效。另有研究證實[6]，脊髓是信號傳入胃腸的傳遞和整合中樞，也是艾灸發(fā)揮防治SGMD作用的重要調節(jié)途徑?；诖耍狙芯吭谇袛啻笫蠹顾璧那疤釛l件下，觀察艾灸足三里穴對SGMD大鼠胃黏膜Nrf2/HO-1通路相關分子的影響，探討其胃黏膜保護作用與脊髓的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠共50只，體質量180～220 g，雌雄各半，購自湖南省實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(湘)2016-0001。分籠飼養(yǎng)于相對溫度18～25 ℃，相對濕度45%～55%的SPF級實驗動物房中。

1.2 實驗藥物及試劑

溫灸純艾條(φ4 mm)購自南陽漢醫(yī)責任有限公司;奧美拉唑腸溶片(規(guī)格為20 mg/片)購自阿斯利康制藥有限公司(批號：201119);青霉素購自華北制藥股份有限公司(批號：201020);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(批號：2041S06);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛( MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和一氧化氮(NO)大鼠ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司(批號分別為：20210125、20201223、20210205、20201117);抗一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、核轉錄因子E2相關因子2(Nrf2)和血紅素加氧酶-1(HO-1)抗體購自CST公司(批號分別為：205433、205521、205616、205427);總RNA提取試劑盒購自TaKaRa公司(批號：223519)。

1.3 分組與造模

實驗大鼠按體質量隨機分為5組：空白組、模型組、藥物組、艾灸組及手術+艾灸組，各組數(shù)量均為10只，雌雄分籠后適應性飼養(yǎng)1周。1周后，手術+艾灸組大鼠給予脊髓橫斷術：大鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，取仰臥位固定于手術臺，按大鼠肋骨定位椎體序列，隨后由沿背部正中線切開T8～12段，暴露T9～11椎體棘突和椎板，剪除T10段椎板并暴露T10水平處脊髓，輕輕挑起脊髓，切開硬膜，將三角刀片垂直插入脊髓后正中溝并橫向切開，去掉脊髓周圍約2 mm以上組織，大鼠即刻出現(xiàn)下肢抽搐、劇烈擺尾或尿失禁現(xiàn)象，以大鼠T10以下肢體癱瘓、感覺和肌張力消失、出現(xiàn)尿潴留為手術成功。術后剖面用紗布止血后縫合切口，給予青霉素鈉(16萬U/d)連續(xù)肌肉注射3 d，并人工輔助排空膀胱2次/d，直到大鼠恢復自身排尿反射，期間其余組大鼠正常飼養(yǎng)。手術完成后，除空白組外，其余組大鼠采用無水乙醇+阿司匹林灌胃法制備SGMD模型：大鼠禁食24 h，造模第1天先給予無水乙醇(6 mL/kg)灌胃處理，1 h后再給予阿司匹林生理鹽水混懸液(200 mg/kg)灌胃，此后3 d繼續(xù)給予阿司匹林生理鹽水混懸液灌胃，每日1次，3 d灌胃結束后禁食 24 h，給予治療。

1.4 干預方法

艾灸組、手術+艾灸組參照《實驗針灸學》定位，取大鼠雙側“足三里”穴(膝關節(jié)后外側，腓骨小頭下5 mm處)進行溫和灸治療：大鼠捆綁于鼠板后定位取穴，穴位局部剪毛處理，將艾條固定于小型艾灸支架后點燃，距離雙側足三里穴約0.5 cm處同時施灸，每日兩次(早8：00、下午14：00各1次)，每次30 min，連續(xù)治療8 d。藥物組給予奧美拉唑腸溶片溶液0.2 mg/kg灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃8 d?？瞻捉M和模型組僅捆綁，不予治療。

1.5 觀察指標

1.5.1 胃黏膜損傷指數(shù)(UI)檢測 大鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，腹主動脈取血將賁門和幽門行結扎處理，向胃內注射10 mL預冷生理鹽水沖洗后將全胃取出，再置于生理鹽水溶液中20 min。沿胃大彎剪開，沖洗胃中內容物后鋪平，按Guth標準[7]對黏膜損傷指數(shù)(UI)進行評估：糜爛損傷呈斑點狀計1分；損傷<1 mm記2分；損傷 1～2 mm 計3分；損傷>2 mm，≤4 mm時計4分；損傷>4 mm計5分；當損傷寬度>1 mm時，按2倍計分。UI=胃黏膜各處糜爛分值相加的總和。

1.5.2 胃黏膜組織病理學觀察 UI檢測結束后，取大鼠部分胃組織投入10%多聚甲醛溶液，固定48 h后梯度酒精依次浸泡脫水，隨后置于二甲苯中透明，經(jīng)石蠟液包埋后作5 μM厚切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、蘇木素染色、鹽酸酒精分化、伊紅染色、梯度酒精脫水和二甲苯透明后，用中性樹脂進行封片，光學顯微鏡下觀察胃黏膜組織形態(tài)并拍照。

1.5.3 血清中SOD、MDA、NO及GSH-Px水平測定 大鼠腹主動脈取血，將采集血液于3 000 r/min轉速下離心15 min，收集上清，棄去沉淀，分裝凍存于-20 ℃冰箱。參照ELISA試劑盒步驟測定血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平：血清放置于常溫下平衡1 h，3 000 r/min離心15 min，樣品孔每孔加入血清10 μL，抗體100 μL，樣品稀釋劑40 μL及辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗100 μL，置于37 ℃溫箱中孵育1 h，洗板后加入顯色液100 μL，37 ℃溫箱避光反應15 min，加入終止液50 μL，酶標儀450 nm波長檢測各孔吸光度，繪制標準曲線，計算各樣本SOD、MDA、NO及GSH-Px的水平。

1.5.4 胃黏膜組織iNOS、COX-2、Nrf2及HO-1蛋白表達檢測 取各組大鼠胃黏膜組織100～200 mg，RAPI裂解液裂解，冰上勻漿，4 ℃ 離心機12 000 r/min離心20 min提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE濃縮膠電泳轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后，TBST洗膜3次，加入一抗，4 ℃孵育一夜，TBST室溫洗膜3次，加入二抗稀釋液于室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次。加入ECL工作液孵育后使用凝膠成像分析系統(tǒng)曝光，Image J軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。

1.5.5 胃黏膜組織iNOS、COX-2、Nrf2及HO-1 mRNA表達檢測 取各組大鼠部分胃黏膜組織，將組織充分研磨后采用Trizol裂解液提取總RNA，按紫外分光光度法檢測黏膜組織總RNA濃度，將樣品RNA逆轉錄合成 cDNA，再按PCR試劑盒步驟進行擴增反應。反應條件為95 ℃ 預變性 3 min，95 ℃變性10 s， 60 ℃退火30 s，擴增 40個循環(huán)。結果以β-actin為內參，2-△△Ct法計算各組iNOS、COX-2、Nrf2及HO-1的相對mRNA表達量。具體引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 大鼠胃黏膜損傷指數(shù)(UI)比較

模型組與空白組比較，大鼠UI指數(shù)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；艾灸組大鼠胃黏膜UI指數(shù)較模型組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；手術+艾灸組UI明顯高于艾灸組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表2。

表2 各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)比較

2.2 大鼠胃黏膜組織形態(tài)學改變

HE染色可見，空白組大鼠胃黏膜細胞排列規(guī)整，胞質和胞核清晰，未見炎細胞浸潤。模型組大鼠黏膜下層水腫，胃腺細胞排列無序，可見大量細胞壞死，胞內充血水腫，胞質和胞核不清，毛細血管擴張，細胞間隙可見炎性細胞浸潤。艾灸組與藥物組經(jīng)治療后，大鼠胃黏膜組織損傷較模型組明顯改善，細胞排列較整齊，胞內充血水腫減輕，少量炎細胞浸潤。手術+艾灸組大鼠仍可見黏膜下層水腫及炎性細胞浸潤。結果見圖1。

2.3 大鼠血清中SOD、MDA、NO及GSH-Px水平比較

與空白組比較，模型組大鼠血清中SOD、GSH-Px水平明顯降低，MDA、NO的水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。經(jīng)治療后，艾灸組顯著上調了大鼠血清中SOD、GSH-Px水平，下調了MDA、NO的水平，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。手術+艾灸組SOD、MDA、NO及GSH-Px水平較模型組有一定程度的改善，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與艾灸組比較，手術+艾灸組SOD、GSH-Px的水平明顯較低，MDA、NO水平明顯較高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。結果見表3。

表3 各組大鼠血清中SOD、MDA、NO及GSH-Px的表達

2.4 大鼠胃黏膜組織中iNOS、COX-2、Nrf2及HO-1蛋白表達比較

模型組大鼠胃黏膜組織中iNOS、COX-2的蛋白表達較空白組明顯增多，Nrf2、HO-1的表達明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。艾灸組顯著下調了模型大鼠iNOS、COX-2蛋白表達水平的升高，上調了Nrf2和HO-1的蛋白表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。手術+艾灸組iNOS、COX-2、Nrf2及HO-1的蛋白表達水平與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與艾灸組比較，iNOS、COX-2的表達明顯增多，Nrf2、HO-1的表達顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。結果見圖2、表4。

表4 各組大鼠胃黏膜組織iNOS、COX-2、Nrf2及HO-1的蛋白表達

2.5 大鼠胃黏膜組織iNOS、COX-2、Nrf2及HO-1 mRNA表達比較

與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中iNOS、COX-2 mRNA表達明顯增高，Nrf2、HO-1 mRNA表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。艾灸組iNOS、COX-2 mRNA表達較模型組明顯減少，Nrf2、HO-1的表達水平明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。手術+艾灸組iNOS、COX-2、Nrf2、HO-1 mRNA表達較模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，iNOS、COX-2 mRNA表達較艾灸組明顯增多，Nrf2、HO-1的表達較艾灸組顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。結果見表5，各基因擴增曲線、溶解曲線見圖3。

表5 各組大鼠胃黏膜組織iNOS、COX-2、Nrf2及HO-1 mRNA表達

3 討論

應激性胃黏膜損傷(Stress gastric mucosal damage,SGMD)以糜爛、水腫及潰瘍等胃黏膜炎癥表現(xiàn)為主要特征，而炎癥反應能夠誘發(fā)氧化應激，使機體抗氧化能力降低，生成過多的活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)，進而導致氧化通路的激活，不斷加重胃黏膜損傷[8]。艾灸以溫熱刺激體表穴位，可通過激發(fā)經(jīng)絡之氣的活動來調節(jié)機體生理功能，刺激機體產(chǎn)生內源性保護物質，并發(fā)揮抗炎、抗氧化等一系列作用，作為一種無痛、無副作用的綠色療法，在SGMD的防治方面具有獨特優(yōu)勢[9]。

足陽明胃經(jīng)屬胃絡脾，為治療胃腑多種疾患的重要紐帶。足三里為足陽明經(jīng)五腧穴中的合穴，亦為胃腑下合穴，具有生發(fā)胃氣、益氣補虛和通絡除痹之功。胃屬土，本經(jīng)亦屬土，故足三里為土經(jīng)土穴，最能安土，為治療胃經(jīng)諸病首選穴，臨床用于胃痛、胃炎和胃腸潰瘍等病癥均具有確切療效[10-11]。劉密等[12]通過研究證實，艾灸足三里穴可降低應激性胃潰瘍大鼠胃組織丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量，同時使超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性升高，表明艾灸足三里可通過抗氧化作用促進損傷胃黏膜的愈合。

脊髓是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一部分，能夠作為大腦與周圍神經(jīng)間的通路，將來自四肢和軀干的體感信息從周圍神經(jīng)傳達到腦[13]。研究表明[6]，脊髓在艾灸對胃黏膜的保護效應中起到信息傳導的作用，在切斷實驗動物的脊髓后，發(fā)現(xiàn)艾灸對胃黏膜損傷的治療作用有所降低，提示脊髓參與了艾灸對胃黏膜損傷的修復，而關于艾灸是如何通過脊髓達到保護效應的具體機制還需深入研究。

本實驗采用無水乙醇結合阿司匹林灌胃建立大鼠SGMD模型，觀察艾灸足三里穴對SGMD大鼠胃黏膜損傷的保護作用，同時設立手術+艾灸組，給予脊髓橫斷術以觀察脊髓對艾灸保護效應的影響。結果顯示，相較于治療前，艾灸足三里對SGMD大鼠胃黏膜損傷具有顯著的改善作用，比較各組UI值可見，艾灸治療明顯降低了大鼠UI值的升高，而脊髓橫斷術影響了其治療效果，UI值升高，與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義。觀察各組病理結果可見，艾灸組治療有效減輕了大鼠胃黏膜組織損傷，而手術+艾灸組對胃黏膜病變的改善并不明顯，表明脊髓是艾灸足三里穴發(fā)揮對SGMD治療作用信號轉導通路中的一個重要部位。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是機體氧自由基的天然清除劑，具有極強的抗氧化能力；丙二醛(Malondialdehyde,MDA)是體內脂質過氧化反應的產(chǎn)物，SOD活性和MDA含量的多少能夠反應機體氧化損傷程度[14-15]。谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)能夠清除有毒的過氧化物，維持細胞內氧化還原狀態(tài)[16]。一氧化氮(Nitric oxide,NO)是一種具有雙重作用的炎癥介質，少量的NO對細胞具有保護作用，可加速損傷愈合，而高濃度的 NO可上調炎癥反應導致組織及細胞損傷[17]。通過ELISA實驗觀察艾灸足三里對SOD、GSH-Px活性及MDA、NO含量的影響，結果發(fā)現(xiàn)，艾灸可增強大鼠血清中SOD和GSH-Px的活性，同時降低升高的MDA和NO水平，增強抗氧化能力，從而減輕炎癥反應，恢復胃黏膜氧化損傷，而脊髓橫斷抑制了艾灸的抗氧化效果，各指標血清水平與模型組比較未見明顯差異。

核因子E2相關因子2(Nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)是在氧化應激反應及炎癥環(huán)境下發(fā)揮抗氧化功能的關鍵轉錄因子，氧化應激時，Nrf2被釋放并進入細胞核，參與調控血紅素加氧酶-1(Heine oxygenase-1,HO-1)等下游抗氧化基因的轉錄，從而達到降低機體氧化應激水平、保護細胞和組織的作用[18-19]。在SGMD發(fā)生時，Nrf2/HO-1信號通路的激活能夠調節(jié)胃黏膜細胞的氧化還原狀態(tài)，清除多余ROS，抵抗胃黏膜氧化損傷[20-21]。本研究中模型組大鼠胃黏膜組織中Nrf2和HO-1的蛋白及mRNA表達量較空白組均顯著減少，經(jīng)艾灸足三里治療后，Nrf2和HO-1的表達水平明顯上調，提示艾灸治療能夠促進Nrf2核易位，誘導HO-1的表達，而手術+艾灸組胃黏膜組織中Nrf2和HO-1的表達要明顯低于艾灸組。另一方面，艾灸治療可顯著抑制炎性蛋白酶一氧化氮合酶(induced nitrogen monoxide synthase,iNOS)和環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase,COX-2)在蛋白和mRNA水平的表達，而手術+艾灸組胃黏膜組織iNOS和COX的表達較艾灸組明顯升高。表明脊髓橫斷影響了艾灸足三里穴對Nrf2/HO-1通路的調控作用，減弱了艾灸的抗炎和氧化應激抑制作用。

綜上所述，本實驗結果表明艾灸足三里穴可通過激活Nrf2/HO-1信號通路、降低氧化應激水平來減輕SGMD大鼠胃黏膜炎癥反應；而對大鼠脊髓的橫斷明顯影響了其抗炎、抗氧化作用，提示脊髓是艾灸足三里穴發(fā)揮胃黏膜損傷修復作用的重要途徑，艾灸治療所誘導的Nrf2/HO-1通路的表達受到脊髓的調控。