利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制高效抗除草劑水稻

尹麗穎 張元野 李榮田,* 何明良 王芳權(quán) 許揚(yáng) 劉欣欣 潘婷婷 田曉杰 卜慶云 李秀峰,*

利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制高效抗除草劑水稻

尹麗穎1張元野1李榮田1,*何明良2王芳權(quán)3許揚(yáng)3劉欣欣4潘婷婷5田曉杰2卜慶云2李秀峰2,*

（1黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150080；2中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150081；3江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，南京 210014；4東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040；5黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，大慶 163319；*通信聯(lián)系人，email: lirongtian07@aliyun.com; email: lixiufeng@iga.ac.cn）

【目的】培育抗除草劑品種在水稻育種中具有重要意義。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，以黑龍江優(yōu)質(zhì)粳稻品種為材料，編輯乙酰乳酸合酶基因，創(chuàng)制具有抗除草劑特性的水稻材料?！痉椒ā坷肅RISPR/Cas9技術(shù)，以乙酰乳酸合酶為靶基因，構(gòu)建單堿基突變載體pH-nCas9-PBE-，以松粳22、龍粳46和綏粳18為轉(zhuǎn)化材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株，通過對轉(zhuǎn)基因植株的突變位點進(jìn)行測序結(jié)合除草劑噴施試驗，鑒定基因型及表型。【結(jié)果】經(jīng)分子水平檢測驗證，獲得S627N突變植株10株，S627N且1884G-A但第628位氨基酸未改變突變植株1株，S627N/G628E突變植株1株。相較于野生型，以上三類突變植株均具有較強(qiáng)抗除草劑特性。【結(jié)論】利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得具有抗除草劑特性，能夠穩(wěn)定遺傳，不含轉(zhuǎn)基因標(biāo)記的純合株系，可為抗除草劑水稻育種提供基礎(chǔ)材料。

水稻；乙酰乳酸合酶；抗除草劑；咪唑乙煙酸；CRISPR/Cas9；基因編輯

當(dāng)前世界人口急劇增長，糧食不足成為制約人均生活水平的主要難題[1]。水稻作為主要糧食作物之一，稻田雜草泛濫是增產(chǎn)的重要限制因素，選育和創(chuàng)制抗除草劑品種具有很大的發(fā)展空間[2]。草害是影響水稻產(chǎn)量的重要因素之一，雜草與作物競爭水、陽光、土壤等生存資源的同時，抑制植株生長、結(jié)實，降低稻谷品質(zhì)、產(chǎn)量，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[3]。隨著城鎮(zhèn)化速度的加快，傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)面臨極大挑戰(zhàn)，人工除草、機(jī)械除草、物理除草等因耗時費(fèi)力逐漸被化學(xué)除草取代，化學(xué)除草現(xiàn)已成為控制草害的主要手段[4]?；瘜W(xué)除草能夠有效減少作物產(chǎn)量損失、降低人力成本，然而化學(xué)除草劑在殺傷雜草的同時，也會對作物產(chǎn)生不良影響，造成水稻減量降低、稻米品質(zhì)變差[5]，因而培育抗除草劑水稻品種尤為重要。

世界上第一種商品化轉(zhuǎn)基因水稻為抗除草劑水稻[6]。隨著技術(shù)發(fā)展，傳統(tǒng)育種技術(shù)已不能滿足現(xiàn)代需求。作為新一代的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9技術(shù)可進(jìn)行定向基因編輯改造[7]，在作物育種改良中應(yīng)用廣泛。在水稻育種研究中，該技術(shù)因簡單高效而被大量使用，已有研究利用該項技術(shù)改良水稻熟期[8]、香味[9]、直鏈淀粉含量[10]及粒型[11]等多個性狀。

不同的化學(xué)除草劑具有不同的殺草譜，化學(xué)除草劑與相應(yīng)的抗除草劑水稻品種聯(lián)用控制草害效果較好[12]。目前抗除草劑類型有咪唑啉酮類、磺酰脲類、環(huán)己烯酮類、有機(jī)磷類、均三氮苯類和激素類等6大類[13]。咪唑啉酮類除草劑在實際生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，包括咪唑煙酯、咪唑乙煙酸、咪唑喹啉酸、甲氧咪草煙、甲基咪草煙和咪草酸[14]。這是一類廣譜除草劑，通過與靶標(biāo)酶乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，）結(jié)合[15]，抑制其活性，破壞植物體內(nèi)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的合成[16]，最終導(dǎo)致植物死亡，進(jìn)而達(dá)到除草的目的?？挂种苿┧酒贩N具有較大的研究價值，國外學(xué)者首先獲得了抗抑制劑水稻品種[17]。美國科學(xué)家通過抗性篩選選育出CL141 和 CL121兩個品種，已在2001獲得批準(zhǔn)大量種植[18]，至2011年，抗抑制劑類水稻（抗咪草煙）已占美國水稻種植總數(shù)的50%[19]。研究顯示，至少有20個氨基酸突變位點導(dǎo)致植物對抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性[15]，在黃華占、華航31、金粳818、鎮(zhèn)稻18等水稻品種中，通過EMS誘變或自然變異均成功獲得了抗抑制劑類突變植株[21-24]。

隨著農(nóng)業(yè)供給側(cè)改革的推進(jìn)，黑龍江地區(qū)作物生產(chǎn)模式逐步向輕簡栽培發(fā)展，直播稻成為一種重要的發(fā)展方向，田間草害是直播稻發(fā)展的重要限制因子，除草劑成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中常用防治雜草的手段之一[25]。為進(jìn)一步豐富黑龍江抗除草劑水稻種質(zhì)，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，以黑龍江優(yōu)質(zhì)粳稻品種松粳22、龍粳46和綏粳18為研究材料，對基因進(jìn)行單堿基編輯，以期基因第627位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)樘於０罚瑥亩顾静牧暇哂谐輨┛剐?，為深入開展水稻抗除草劑育種奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以粳稻松粳22、龍粳46和綏粳18為試驗材料，獲得基因編輯植株，并在哈爾濱（北緯45°）種植，行株距為以25 cm×25 cm，自然長日照條件下生長。

試驗所用載體pZHW-OsU3和pH-nCas9-PBE為中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組開發(fā)并擁有自主知識產(chǎn)權(quán)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊杰研究員惠贈。

1.2 CRISPR/Cas9靶點接頭設(shè)計及載體構(gòu)建

通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得（LOC_Os02g30630）的基因序列，利用CRISPR-GE在線網(wǎng)站（http://skl.scau.edu.cn/），在第1外顯子（圖1）設(shè)計1對靶點接頭引物CAS9-ALS-LP/RP（表1），利用軟件“CRISPR Primer Designer”比對水稻全基因組序列，檢測靶點的特異性，排除潛在脫靶序列。

參照Li等[26]的方法進(jìn)行載體構(gòu)建，將連接好的載體通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10中，菌液PCR檢測后，選取陽性菌落搖菌后提取質(zhì)粒。利用測序公共引物M13-F對載體質(zhì)粒進(jìn)行PCR，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，通過熱激法將檢測無誤的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。

表1 本研究中所用的引物

1.3 T0代陽性植株的獲得

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將CRISPR/Cas9表達(dá)載體pH-nCas9-PBE-轉(zhuǎn)入松粳22、龍粳46和綏粳18的愈傷組織中，經(jīng)過潮霉素篩選抗性愈傷組織，分化獲得T0代植株。將T0代植株種植于室外盆栽盒中，對每株T0代植株提取葉片的全基因組DNA，通過引物HPT-F/R(表1)進(jìn)行PCR檢測，產(chǎn)物大小為900 bp的植株即陽性轉(zhuǎn)基因植株。同時，利用測序引物ALS-F/R(表1)進(jìn)行PCR，將產(chǎn)物送吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序，將陽性轉(zhuǎn)基因植株種植于盆栽盒中，收獲種子用于下一代種植。

黑色序列為靶點序列，下劃線序列為PAM序列。

Fig. 1. Gene structure and target site of

1.4 T1代純合突變植株的篩選

在T0代收獲的種子中，挑選粒型飽滿的種子，室溫浸種1 d，37℃下催芽1 d，種植于室外盆栽盒中，在苗期提取T1代植株基因組DNA，利用潮霉素引物HPT-F/R鑒定，選擇不含有潮霉素標(biāo)記的植株繼續(xù)加代。同時利用測序引物ALS- F/R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物送吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序，挑選編輯成功且編輯位點純合的植物進(jìn)行種植。

1.5 T2代植株性狀分析

依據(jù)測序結(jié)果，選擇T2代植株與野生型植株種植于室外盆栽場45 cm×85 cm盆栽盒中，于4葉期時，按照0.1 mL/m2噴施10%咪唑乙煙酸（山東先達(dá)農(nóng)化股份有限公司，先達(dá)豆說好10%咪唑乙煙酸水劑）。3 d后觀察植株生長情況，對比T2代植株與野生型植株的抗藥性，15 d后統(tǒng)計成活率。

同時，將T2代植株與野生型植株分為三組種植于盆栽盒中，噴施農(nóng)業(yè)中常用其他種類除草劑作耐藥性研究，包括甲嘧磺?。ńK瑞邦農(nóng)藥廠有限公司，瑞邦綠無影75%甲嘧磺隆可濕性粉劑）、氯吡嘧磺?。ńK省農(nóng)用激素工程技術(shù)研究中心有限公司，巨禾75%氯吡嘧磺隆水分散粒劑）和雙草醚（安徽藍(lán)田農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，藍(lán)田農(nóng)美保10%雙草醚懸浮劑），待植株生長至4葉期，選用適當(dāng)濃度噴施除草劑，3 d后觀察植株生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 T0代轉(zhuǎn)基因陽性苗檢測

水稻基因編碼區(qū)序列全長為1935 bp，編碼644個氨基酸[27]。根據(jù)以往研究，在1880 bp處堿基G突變?yōu)锳后，第627位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)榱颂於０?，能夠使植株獲得抗咪唑啉酮類抗性[28]，據(jù)此設(shè)計CRISPR/Cas9引物，并構(gòu)建載體pH-nCas9-PBE-，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法侵染松粳22、龍粳46和綏粳18的愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株T0代，對獲得的21株轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行潮霉素鑒定及測序。其中19株為陽性植株，2株為陰性植株，陽性率為90.5%（圖2）。對T0代植株進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)（圖3），靶點附近出現(xiàn)較多套峰，編輯材料多為雜合，可在下一代植株進(jìn)一步測序篩選。因環(huán)境因素導(dǎo)致部分T0代植株結(jié)實率低，最終收獲12株T0代植株的種子。

M―DM2000 DNA 標(biāo)記; 1―陰性對照; 2―陽性對照; 3～23―T0代植株。

M, DM2000 DNA Marker; 1, Negative control; 2, Positive control; 3?23, T0generation plants.

圖2 T0代植株轉(zhuǎn)基因檢測

Fig. 2. Transgenic detection of T0generation plants.

圖3 T0代轉(zhuǎn)基因植株測序結(jié)果

Fig. 3. Sequencing results of T0generation transgenic plants.

2.2 T1代植株突變類型檢測

將T0代收獲的種子繼續(xù)種植，根據(jù)PCR檢測結(jié)果篩選出剔除潮霉素基因的植株種植到室外盆栽場，鑒定結(jié)果如圖4所示。

12水稻株系中，有10個株系（SJ22-1、SJ22-2、SJ22-3、SJ22-4、LJ46-1、LJ46-2、LJ46-4、SJ18-1、SJ18-2、SJ18-3）在1880 bp處堿基G突變?yōu)锳，即627位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)榱颂於０罚⊿627N）。SJ18-4在1880 bp處堿基G突變?yōu)锳的情況下第1884 bp處堿基G突變?yōu)锳，但氨基酸沒有發(fā)生改變（S627N且1884G-A）。另外，LJ46-3除第1880 bp處堿基G突變?yōu)锳外，在第1883―1884 bp處還存在堿基GG變?yōu)锳A的突變，導(dǎo)致第628位甘氨酸變?yōu)楣劝彼幔⊿627N/G628E）（圖5）。

2.3 T2代植株抗性分析

將T2代編輯植株與野生型松粳22、龍粳46和綏粳18種植在與盆栽場相同的環(huán)境中，生長40 d后，噴施10%的化學(xué)除草劑咪唑乙煙酸，3 d后觀察其生長情況。在噴施除草劑3 d后，野生型松粳22、龍粳46和綏粳18的各個株系均出現(xiàn)明顯的葉片干枯、黃化、生長停滯等現(xiàn)象（圖6），且在噴施咪唑乙煙酸后15 d內(nèi)逐漸死亡（表2），而12種突變體在噴施除草劑15 d后仍能夠正常生長，葉片無干枯、黃化現(xiàn)象，具有很強(qiáng)的抗除草劑能力，且田間無雜草生長，證明基因編輯抗除草劑植株與相應(yīng)化學(xué)除草劑聯(lián)用能夠充分解決草害問題。

圖4 T1代轉(zhuǎn)基因植株測序結(jié)果

Fig. 4. Sequencing results of T1generation transgenic plants.

為進(jìn)一步研究編輯材料對除草劑的抗性，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用頻率較高的除草劑中，選擇三種除草劑（甲嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、雙草醚）進(jìn)行廣譜抗性研究。經(jīng)梯度濃度噴施測試后，根據(jù)表型選擇合適濃度進(jìn)行噴施，其結(jié)果如圖7。在氯吡嘧磺隆處理組中，噴藥3 d后，各編輯材料葉片微微變黃，但在后續(xù)觀察中發(fā)現(xiàn)，編輯材料生長良好，而野生型植株葉片發(fā)黃，干枯皺縮，逐漸死亡；在甲嘧磺隆處理組中，噴藥3 d后，植株生長情況與氯吡嘧磺隆組類似，在綏粳18背景的材料中，野生型葉片迅速發(fā)黃干枯，而編輯材料正常生長，葉片微微發(fā)黃；在雙草醚處理組中，噴藥2 d后，全部植株葉片發(fā)黃，3 d后，植株均出現(xiàn)較大程度的干枯皺縮，但相對于野生型，編輯材料生長能力較強(qiáng)。雖在不同除草劑處理情況下，各背景下的編輯材料表現(xiàn)出不同的抗性，但相較于野生型，表現(xiàn)出一定的抗性，證明本研究選用的三種材料，在對基因進(jìn)行編輯過后，對其他類除草劑的抗性有所增強(qiáng)。

圖5 T1代轉(zhuǎn)基因植株氨基酸突變類型

Fig. 5. Amino acid mutation of the target gene of T1generation transgenic plants.

圖6 T2代除草劑抗性鑒定（標(biāo)尺=10 cm）

Fig. 6. Herbicide resistance identification of T2generation (Bar=10 cm).

圖7 T2代農(nóng)用除草劑抗性鑒定（標(biāo)尺=10 cm）

Fig. 7. Resistance identification of T2generation to herbicides for agricultural use (Bar=10 cm).

3 討論

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，以黑龍江優(yōu)質(zhì)粳稻品種松粳22、龍粳46和綏粳18為研究材料，對基因進(jìn)行定點突變，獲得具有良好除草劑抗性的水稻材料。相較于傳統(tǒng)育種技術(shù)，在育種速度及精度上有很大的提高，而且相較于誘變育種以及自然變異等需大量精力篩選材料的方法，CRISPR/Cas9技術(shù)存在極大的高效優(yōu)勢。

表2 噴施除草劑咪唑乙煙酸后T2代植株存活率調(diào)查

CK―正常生長40 d的成苗數(shù)量; 3 d―噴施咪唑乙煙酸3 d后黃化苗數(shù)量; 15 d―噴施咪唑乙煙酸15 d后的成苗數(shù)量; 存活率―噴施咪唑乙煙酸存活率。

CK, Number of seedlings after 40 days of growth under normal conditions; 3 d, Number of etiolated seedlings 3 days after imidazole ethylnicotinic acid spraying; 15 d, Number of living seedlings 15 days after imidazole ethylnicotinic acid spraying; Survival rate, Survival rate of seedlings after imidazole ethylnicotinic acid spraying.

根據(jù)突變位點和類型的不同，植物基因突變后，可以分別獲得抗咪唑啉酮類、磺酸脲類和嘧啶硫代苯甲酸酯類等除草劑的能力，但單一位點突變后，往往只具有對一種類型除草劑的抗性[29]。在目前的水稻生產(chǎn)中，單一突變基因作物還未暴露出更大的缺陷，依然能夠應(yīng)付一定劑量此類型除草劑，但是雜草存在產(chǎn)生除草劑抗性的可能，因而抗除草劑作物育種不能停滯。

在本研究中，除10個成功突變預(yù)期位點的株系外，還獲得了兩種不同類型的轉(zhuǎn)基因株系（SJ18-4、LJ46-3），SJ18-4的第1884 bp處堿基G突變?yōu)锳，但氨基酸沒有發(fā)生改變。而LJ46-3第1883－1884 bp處堿基同樣發(fā)生了突變，堿基GG變?yōu)锳A，導(dǎo)致第628位甘氨酸變?yōu)楣劝彼?。在以往的研究中，有報道G628W的突變類型[30]，突變后具有抗咪唑啉酮類抗性。類似地，G628E突變后同樣具有抗咪唑啉酮類除草劑的能力，且627、628雙位點突變后，除草劑抗性能夠提升約30%[31]，具有S627N/G628E突變的LJ46-3株系，是否能夠獲得除抗咪唑啉酮類以外除草劑的抗性或更強(qiáng)的咪唑啉酮類抗性目前尚不清楚，根據(jù)測序結(jié)果僅LJ46-3為雜合植株，可在后續(xù)加代中獲得純合植株后繼續(xù)進(jìn)行研究。在對其他三種除草劑的抗性研究中發(fā)現(xiàn)，在基因突變后，噴施超額劑量的除草劑后，LJ46-3植株能夠一定程度正常生長，證明對其他除草劑抗性也部分增強(qiáng)。本研究中獲得的雙位點突變材料LJ46-3，具有較強(qiáng)的除草劑抗性，有望進(jìn)一步培育為優(yōu)質(zhì)抗除草劑材料?？钩輨┢贩N仍是育種者的目標(biāo)，本研究可為抗除草劑的研究提供一定的數(shù)據(jù)參考。

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Improvement of Herbicide Resistance in Rice by Using CRISPR/Cas9 System

YIN Liying1, ZHANG Yuanye1, LI Rongtian1,*, HE Mingliang2, WANG Fangquan3, XU Yang3, LIU Xinxin4, PAN Tingting5, TIAN Xiaojie2, BU Qingyun2, LI Xiufeng2,*

(1College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, China;2Northeast Institute of Geography and Agroecology, Key Laboratory of Soybean Molecular Design Breeding, Chinese Academy of Sciences, Harbin 150081, China;3Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;4College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China;5College of Agriculture, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China;*Corresponding author, email: lirongtian07@aliyun.com; lixiufeng@iga.ac.cn)

【Objective】It is of great significance to create herbicide-resistant rice varieties. The acetyllactic acid synthase () gene was edited to create rice varieties with excellent herbicide resistance using non-herbicide-resistantrice varieties with good quality as materials. 【Methods】Using CRISPR/Cas9 technology, the single-base mutant vector pH-NCas9-PBA-was constructed with acyllactic acid synthase () as the target gene. Songjing 22, Longjing 46 and Suijing 18 were used as transformation materials to obtain transgenic plants through-mediated genetic transformation. Genotypes and phenotypes were identified by sequencing the mutation sites of transgenic plants and herbicide spraying test. 【Results】 TenS627Nmutants, oneS627Nand1884G-A(the 628thamino acid unchanged mutant), and oneS627N/G628Emutant were obtained by molecular level detection. Compared with the wild type, the three types of mutants had stronger herbicide resistance.【Conclusion】Using CRISPR/Cas9 gene editing technology, we obtained homozygous mutant lines which are genetically stable and herbicide-resistant, providing basic materials for herbicide-resistant rice breeding.

rice;; herbicide resistance; imazethapyr; CRISPR/Cas9; gene editing

10.16819/j.1001-7216.2022.211004

2021-10-13;

2021-12-07。

黑龍江省杰出青年基金資助項目(JQ2020C003)。