含草甘膦抗性標(biāo)記的水稻核不育繁殖系載體構(gòu)建與驗證

李焱瑤?鄧力華?李昕晏?李華?秦冠男?翁綠水?于江輝?李錦江?肖國櫻, 3,*

含草甘膦抗性標(biāo)記的水稻核不育繁殖系載體構(gòu)建與驗證

李焱瑤1, 2鄧力華1李昕晏1李華1秦冠男1翁綠水1于江輝1李錦江1肖國櫻1, 3,*

(1中國科學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所/亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，長沙 410125；2中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3中國科學(xué)院 種子創(chuàng)新研究院, 北京 100101;*通信聯(lián)系人, email: xiaoguoying@isa.ac.cn）

【目的】使用草甘膦抗性基因替代潮霉素抗性基因，構(gòu)建核不育繁殖系的轉(zhuǎn)化載體，賦予繁殖系對除草劑草甘膦的抗性，規(guī)避現(xiàn)行政策對轉(zhuǎn)基因作物中使用抗生素標(biāo)記基因的限制?！痉椒ā坷猛粗亟M的方法，構(gòu)建含草甘膦抗性基因Epsps、花粉致死基因、核不育恢復(fù)基因和紅色熒光基因的水稻核不育基因繁殖系載體pC3300-Epsps-AA-Eat-Red；采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻?！窘Y(jié)果】通過轉(zhuǎn)化秈稻品系9K19-5獲得普通核不育繁殖系Eat9K的轉(zhuǎn)化植株318個。表型鑒定表明，單拷貝轉(zhuǎn)化體Eat9K-3的花粉有可育和不育2種類型，種子有具有和不具有熒光信號2種類型，具有熒光信號的種子在發(fā)芽期能耐受濃度至少為1 g/L的草甘膦。建立的四引物檢測法能夠區(qū)分野生型基因和核不育基因?！窘Y(jié)論】證明載體pC3300-Epsps-AA-Eat-Red有效，創(chuàng)制了具有除草劑抗性的普通核不育繁殖系新種質(zhì)，建立了區(qū)分野生型基因和核不育基因的四引物檢測法。

草甘膦抗性；花粉致死；育性恢復(fù)；普通核不育繁殖系

“民以食為天”，糧食安全是關(guān)系到14億人口大國的頭等大事。我國糧食需求量大，受到資源和技術(shù)制約，糧食產(chǎn)量進(jìn)一步增長的難度不斷加大。受新冠肺炎疫情影響，全球糧食供應(yīng)鏈出現(xiàn)波動。因此，自主保障口糧絕對安全的意義十分重大。

水稻是我國最重要的糧食作物之一。2021年我國水稻播種面積為2992.12萬hm2，占全國糧食播種面積的25.44%，稻谷產(chǎn)量為21 284.3萬t，占全國糧食產(chǎn)量的31.17%[1]。我國不僅耕地面積有限，而且工業(yè)化、城鎮(zhèn)化還需繼續(xù)占用更多耕地。因此，提升水稻單產(chǎn)是保障口糧安全的重要措施。

秈型三系雜交稻的創(chuàng)制和應(yīng)用，打破了自花授粉作物不具有雜種優(yōu)勢的理論禁錮，大幅提高了產(chǎn)量，被譽為“第二次綠色革命”。1999年我國雜交水稻推廣面積約1479萬hm2，占水稻播種面積的50%～55%，雜交水稻單產(chǎn)比常規(guī)水稻提高20%～30%[2]。但是，三系法雜交稻仍存在局限性，其不育性由細(xì)胞核基因與細(xì)胞質(zhì)基因共同控制，遺傳背景單一，且不育涉及核質(zhì)基因互作，機制相對復(fù)雜，選育不育系的效率低[3, 4]。受恢保關(guān)系限制，三系雜交水稻恢復(fù)系選育難度大，配組出綜合性狀優(yōu)良的雜交組合幾率小，且制種程序繁雜。

兩系法雜交稻與三系法雜交稻相比，主要優(yōu)勢有：1）不育性僅由核基因控制，不受細(xì)胞質(zhì)基因影響，沒有細(xì)胞質(zhì)負(fù)效應(yīng)，不育系選育相對容易、遺傳多樣性高；2）不育系繁殖與常規(guī)稻繁殖基本相同，不需要異交制種過程，繁殖程序簡單；3）沒有恢保關(guān)系限制，同亞種的幾乎全部品種均能恢復(fù)兩系的核不育性，恢復(fù)系選育程序相對簡單、遺傳多樣性高，選配出高產(chǎn)兩系雜交稻組合的幾率大。1996年兩系雜交水稻推廣面積占雜交水稻種植面積的0.92%，到2016年已經(jīng)占雜交水稻推廣面積的50%左右[5, 6]。20年間兩系雜交稻面積擴大了50倍左右，并且推廣面積呈進(jìn)一步擴大的趨勢。數(shù)據(jù)顯示，2016年至2020年審定的兩系雜交水稻品種超過了前20年審定的兩系雜交水稻品種數(shù)量，多達(dá)1000個[5]。截至2021年，農(nóng)業(yè)部冠名的超級稻品種135個，其中兩系雜交稻42個，占31.1% (https://www.ricedata.cn/variety/superice.htm)。

但是，兩系法雜交水稻也存在明顯不足。由于水稻光溫敏核不育系的育性受溫度的影響，而自然界氣溫的變化具有不確定性，因此應(yīng)用光溫敏核不育系的兩系法雜交稻制種存在一定風(fēng)險[7]。普通隱性核不育敗育徹底、穩(wěn)定，不受溫度和光照等環(huán)境因素影響，且其不育性大多由一對隱性核基因控制，絕大部分的常規(guī)水稻都具有使其育性恢復(fù)的野生型基因[3]。過去，由于普通隱性核不育沒有保持系，不育性的保持要依靠不育基因純合株與不育基因雜合株雜交，再從后代中分離出50%的不育株而實現(xiàn)。但是，其中50%不育株和50%可育株的判定要等到開花時才能完成，獲得的不育株不具備商業(yè)化生產(chǎn)雜交種子的價值。1993年，比利時Plant Genetic System公司發(fā)明了種子生產(chǎn)技術(shù)(Seed production technology，SPT)[8]，即在普通隱性核雄性不育系中導(dǎo)入連鎖表達(dá)的育性恢復(fù)基因、花粉致死基因和熒光蛋白基因，使50%的可育種子（繁殖系）具有熒光而50%的不育種子（不育系）沒有熒光，從而通過熒光分選解決了普通隱性核雄性不育系種子的高效繁殖問題。第三代雜交水稻借鑒SPT技術(shù)，實現(xiàn)了水稻普通隱性核不育系的高效繁殖，避免了兩系法雜交稻中不育性不穩(wěn)定的問題[9]，具有廣闊的應(yīng)用前景。如應(yīng)用SPT技術(shù)培育的第三代雜交水稻三優(yōu)2號單季畝產(chǎn)達(dá)1085.99 kg[10]。

當(dāng)前研究報道的水稻普通核不育系繁殖系的表達(dá)載體大多數(shù)是以潮霉素為篩選標(biāo)記的雙邊界載體[11]，潮霉素篩選標(biāo)記與三個連鎖表達(dá)的目的基因在不同的T-DNA區(qū)域。這種雙T-DNA邊界載體存在兩方面不足：一是需要獲得潮霉素篩選標(biāo)記與三個連鎖表達(dá)的目的基因共轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株；二是共轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株需要經(jīng)過后代分離、篩選才能獲得不具有潮霉素篩選標(biāo)記的普通核不育繁殖系。如果表達(dá)載體中潮霉素篩選標(biāo)記與三個連鎖表達(dá)的目的基因在同一個T-DNA區(qū)域，不分離，在現(xiàn)行農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全性評價政策下含有抗生素基因的轉(zhuǎn)化體是不能通過安全性評價的。針對這些問題，我們用抗草甘膦基因Epsps代替潮霉素抗性基因，在同一個T-DNA區(qū)中構(gòu)建含抗草甘膦基因Epsps花粉致死基因育性恢復(fù)基因與紅色熒光蛋白基因的連鎖表達(dá)載體，既規(guī)避了使用潮霉素抗性基因的政策限制，又避免了共轉(zhuǎn)化時目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化效率不高的缺點，同時還可以利用繁殖系的草甘膦抗性方便在后續(xù)不育系種子生產(chǎn)中除草和除雜。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

遺傳轉(zhuǎn)化受體為本課題組培育的高培養(yǎng)力秈型水稻品系9K19-5 (L. subsp)[12]。核不育基因供體為含核不育基因的第三代雜交稻，由湖南雜交水稻研究中心李新奇課題組提供。回交改造用輪回親本為本課題組自選保持系科20B（湘鑒稻20220014）。

1.2 菌株與質(zhì)粒

農(nóng)桿菌EHA105 ()購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌DH5α ()購自湖南擎科生物技術(shù)有限公司。質(zhì)粒pC3300-UbiEpsps-35sCry1Ca由本課題組構(gòu)建并保存[13]；質(zhì)粒pC1300-Eat1由湖南雜交水稻研究中心李新奇課題組提供。

1.3 試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶和長鏈高保真酶（PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase）購自TaKaRa公司；In-fusion試劑（NEBuilder? HiFi DNA Assembly Master Mix）購自NEB公司；DNA凝膠回收試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；2×M5 Master Mix購自北京聚合美生物科技有限公司；Southern專用DNA分子量標(biāo)記購自北京天恩澤基因科技有限公司；地高辛檢測試劑盒購自瑞士羅氏制藥有限公司。

凝膠成像系統(tǒng)的型號為美國伯樂ChemiDoc XRS；正置熒光顯微鏡的型號為日本奧林巴斯BX51；植物活體成像系統(tǒng)的型號為美國Picarro,VILBER FUSION FX7.EDGE SPECTRA；熒光觀察儀型號為美國LUYOR公司的LUYOR- 3415RG雙波長熒光蛋白觀測燈。

1.4 載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

利用Ⅰ和Ⅰ雙酶切質(zhì)粒pC3300- UbiEpsps-35sCry1Ca后電泳分離得到線性化載體的大片段，利用高保真酶擴增質(zhì)粒pC1300-Eat1中的花粉致死基因表達(dá)框，采用同源重組方法[14]構(gòu)建載體pC3300-Epsps-AA。Ⅰ單酶切載體pC3300-Epsps-AA，利用高保真酶擴增質(zhì)粒pC1300-Eat1中的育性恢復(fù)基因和紅色熒光蛋白基因的表達(dá)框，利用同源重組方法構(gòu)建植物表達(dá)載體pC3300-Epsps-AA-Eat-Red。水稻遺傳轉(zhuǎn)化參考王作平的方法[15]。

1.5 PCR鑒定與Southern檢測

采用CTAB法提取水稻基因組DNA。用引物對Epsps-F/Epsps-R、ZmAA1-F/ZmAA1-R、LtpEat1-F/LtpEat1-R、DsRed2-F/DsRed2-R (表1)分別檢測Epsps、、和基因。PCR擴增體系總體積10 μL，包括2×M5 Master Mix 5.0 μL、10 μmol L上下游引物各0.3 μL、DNA模板1.0 μL，補充ddH2O至10 μL。PCR擴增程序為94℃下預(yù)變性4 min，94℃下變性30 s，58℃下退火30 s，72℃下延伸（按1 kb /min設(shè)定時長），34個循環(huán)；最后72℃下延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。

使用引物對Epsps-F/Epsps-R和質(zhì)粒pC3300- Epsps-AA-Eat-Red模板，采用PCR法制備地高辛標(biāo)記的Epsps基因Southern雜交探針。基因組DNA經(jīng)Ⅰ酶切。Southern雜交中電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交和檢測等具體步驟參考鄧力華的方法[13]。

表1 本研究用到的引物序列

1.6 花粉育性觀察

取T2轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)化體Eat9K-3與對照9K19-5主穗穎花的花藥置于載玻片上，加1～2滴1% I2-KI溶液染色后夾碎，用正置熒光顯微鏡觀察。

1.7 種子熒光觀察

收獲成熟的轉(zhuǎn)化體Eat9K-3種子，干燥之后用活體成像儀觀察穗，用手持式LUYOR-3415RG雙熒光蛋白觀察燈分選水稻種子。

1.8 除草劑抗性鑒定

T2代單拷貝轉(zhuǎn)化體Eat9K-3與對照9K19-5分別置于0.34 g/L與0 g/L草甘膦的生根培養(yǎng)基中發(fā)芽；3 d后將Eat9K-3萌芽的種子轉(zhuǎn)入1.0 g/L草甘膦生根培養(yǎng)基上，將對照9K19-5萌芽的種子分別轉(zhuǎn)入1.0 g/L與0 g/L草甘膦生根培養(yǎng)基上；一周后觀察生長狀態(tài)，用活體成像儀拍照。

1.9 回交轉(zhuǎn)育

設(shè)計引物對Eat1af/Eat1br與Eat1bf/Eat1ar（表1），用于區(qū)分與基因。以Eat9K作為母本，含不育基因的第三代雜交稻作為父本進(jìn)行雜交，聚合、Epsps、、和基因；然后用科20B作為輪回父本與它雜交，之后連續(xù)回交2～3代后自交。雜交或回交后代噴施除草劑草甘膦和分子標(biāo)記篩選同時含、Epsps、、和基因的單株。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體構(gòu)建

構(gòu)建完成的表達(dá)載體pC3300-Epsps-AA- Eat-Red約22 kb，其T-DNA區(qū)域約16 kb，T-DNA區(qū)域結(jié)構(gòu)如圖1-A所示。Ⅰ酶切將載體切成兩條帶，大小分別為15 368 bp和6 791 bp（圖1-B）。載體pC3300-UbiEpsps-35sCry1Ca只能檢測到Epsps基因，載體pC1300-Eat1只能檢測到和基因，而載體pC3300-Epsps- AA-Eat-Red能檢測到Epsps、、和這4個目的基因（圖1-C）。Ⅰ酶切和PCR檢測均證實載體構(gòu)建成功。

A?載體pC3300-Epsps-AA-Eat-Red的T-DNA區(qū)域。Epsps#―草甘膦抗性基因；TNOS―來源于胭脂堿合成酶基因的終止子；PG47―來源于玉米多聚半乳糖醛酸酶基因的花粉特異性啟動子；ZmAA1―玉米的α-淀粉酶基因，賦予花粉致死性的花粉致死基因；Tin2-1―來源于In2-1基因的終止子；PEat1―Eat1基因的啟動子，Eat1在絨氈層表達(dá)，具有育性恢復(fù)作用；TEat1―Eat1基因的終止子；Ltp2―來源于大麥糊粉層的特異性啟動子；DsRed2―來源于珊瑚的DsRed2基因，編碼紅色熒光蛋白；CaMV 35S polyA―花椰菜花葉病毒多聚腺苷酸化信號。B?質(zhì)粒pC3300-Epsps-AA-Eat-Red酶切結(jié)果。M?DL 15000 DNA分子量標(biāo)記；泳道1?完整質(zhì)粒；泳道2?質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切。C?PCR檢測載體中Epsps#、ZmAA1、Eat1和DsRed2基因。M?DL2000 DNA分子量標(biāo)記；泳道1?檢測pC3300-UbiEpsps-35sCry1Ca；泳道2?檢測pC1300-Eat1；泳道3?檢測pC3300-Epsps-AA-Eat-Red。

Fig. 1. T-DNA region of vector pC3300-Epsps-AA-Eat-Red and molecular identification.

2.2 轉(zhuǎn)基因再生植株獲得與分子鑒定

選干燥、疏松、淡黃色的愈傷組織用包含質(zhì)粒pC3300-Epsps-AA-Eat-Red的農(nóng)桿菌侵染，經(jīng)愈傷組織篩選、分化，獲得的再生植株命名為Eat9K。PCR擴增再生植株Eat9K基因組DNA，檢測到與Epsps、、和基因?qū)?yīng)的、大小分別為561 bp、1054 bp、562 bp和616 bp的目標(biāo)條帶（圖2）。T1代共檢測384叢再生植株，其中，陽性植株318株，陰性植株66株，部分檢測結(jié)果如圖2所示。結(jié)合T2代Southern雜交結(jié)果篩選出單拷貝轉(zhuǎn)化體進(jìn)行表型鑒定，部分T2代Eat9K轉(zhuǎn)化體Ⅰ酶切的Southern檢測結(jié)果如圖3所示。

A―Epsps#基因檢測；B―ZmAA1基因檢測；C―Eat1基因檢測；D―DsRed2基因檢測。M―DL2000 DNA分子量標(biāo)記；P―質(zhì)粒pC3300-Epsps-AA-Eat-Red；CK―對照9K19-5；1～20―不同的Eat9K再生植株。

Fig. 2. PCR detection of regenerated Eat9K plant.

M―地高辛標(biāo)記的DNA分子量標(biāo)記；P―質(zhì)粒pC3300-Epsps-AA- Eat-Red；CK―非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?、6、12、15、17、23、24、28、35分別為Eat9K的不同轉(zhuǎn)化株。

Fig. 3. Southern blotting ofEpspsgene in T2generation of Eat9K.

2.3 表型鑒定

2.3.1 花粉育性觀察

Eat9K轉(zhuǎn)基因植株中含花粉致死基因。該基因在花粉發(fā)育后期表達(dá)，使含有該基因的花粉失活。選擇T2代中初步檢測為單拷貝的轉(zhuǎn)化體Eat9K-3進(jìn)行花粉育性檢測，可以觀察到可育花粉和不育花粉，說明在花粉中表達(dá)（圖4-A右邊），其結(jié)實率為74.75%。而對照9K19-5為常規(guī)可育品種，花粉幾乎全部為可育花粉粒（圖4-A左邊）。

A?花粉育性觀察; B?種子熒光觀察; C?除草劑耐受性觀察。

Fig. 4. Phenotype identification of Eat9K-3.

2.3.2 種子熒光觀察

Eat9K轉(zhuǎn)基因植株中含紅色熒光蛋白基因。該基因在水稻種子糊粉層中表達(dá)，種子具有紅色熒光。檢測Eat9K-3和對照9K19-5的種子，轉(zhuǎn)化體Eat9K-3的種子具有紅色熒光，而對照9K19-5的種子沒有紅色熒光（圖4-B）。說明基因在Eat9K-3種子中已經(jīng)表達(dá)。對Eat9K-3的紅色熒光和沒有熒光種子數(shù)量進(jìn)行卡方檢驗，結(jié)果表明紅色熒光種子和無熒光種子的比例符合1∶1（χ2<χ20.05,1，表2）。

2.3.3 除草劑耐受實驗

Eat9K轉(zhuǎn)基因植株中含抗草甘膦基因Epsps。該基因是遺傳轉(zhuǎn)化過程中的篩選標(biāo)記，同時也是抗除草劑的目的基因，使成功轉(zhuǎn)入該基因的植株具有草甘膦抗性。除草劑耐受試驗表明，具有紅色熒光信號的Eat9K-3種子在含1 g/L草甘膦的培養(yǎng)基上正常生長，表現(xiàn)出草甘膦抗性，而9K19-5的種子在含1 g/L草甘膦的培養(yǎng)基上死亡（圖4-C）。

表2 Eat9K-3的有熒光種子與無熒光種子卡平方檢驗

2.4 回交轉(zhuǎn)育

為了獲得更多轉(zhuǎn)基因植株和更好的轉(zhuǎn)化事件，轉(zhuǎn)化受體使用了高培養(yǎng)力的正?？捎i稻品系9K19-5。因此，轉(zhuǎn)基因品系Eat9K-3的基因型為/,/－－－－，含有組成型表達(dá)的抗除草劑基因Epsps（簡寫為）、花粉特異表達(dá)的花粉致死基因（簡寫為）、絨氈層特異表達(dá)的野生型育性恢復(fù)基因（簡寫為）和胚乳特異表達(dá)的紅色熒光蛋白基因（簡寫為），沒有普通核不育基因。

測序結(jié)果顯示，與9K19-5中的野生型基因相比，普通核不育基因有2個bp的堿基缺失（圖5-A中紅色標(biāo)記堿基）。根據(jù)二者序列差異，設(shè)計了4條引物來區(qū)分和的基因，引物設(shè)計見圖5-A。PCR檢測時，野生型基因能夠擴增出2條帶，大小分別為450 bp和222 bp，突變基因也能擴增出2條帶，大小分別為450 bp和269 bp，雜合基因型能夠擴增出3條帶，大小分別為450 bp、269 bp和222 bp (圖5-B)。

將轉(zhuǎn)基因品系Eat9K（因含花粉致死基因?qū)е缕浠ǚ鄄挥荒茏髂副荆┳鳛槟副九c含有基因的第三代雜交稻植株雜交，通過噴施草甘膦和種子熒光篩選挑選出具有轉(zhuǎn)基因元件的后代，通過分子標(biāo)記追蹤基因，從含轉(zhuǎn)基因元件的植株中篩選出含基因的雜合型單株（圖5-B，基因型為/,/－－－－）。之后，以科20B為輪回親本回交2～3次，在回交代中繼續(xù)用除草劑處理和分子標(biāo)記方法跟蹤和篩選目標(biāo)基因，然后自交就可以獲得遺傳背景穩(wěn)定的普通核不育繁殖系Eat20E（基因型為,－－－－）。

3 討論

第三代雜交稻繁殖系的表達(dá)載體一般是以潮霉素為篩選標(biāo)記的雙邊界載體[11]，潮霉素篩選標(biāo)記與3個連鎖表達(dá)的目的基因在不同的T-DNA區(qū)域。這種雙T-DNA邊界載體存在兩方面不足。一方面，經(jīng)過潮霉素篩選獲得的再生植株不一定都含有3個連鎖表達(dá)的目的基因，需要二者共轉(zhuǎn)化。假定潮霉素抗性基因轉(zhuǎn)化效率為60%，3個連鎖表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)化效率為20%，那么共轉(zhuǎn)化的效率理論上只有12%，獲得的潮霉素抗性植株中大部分不含有所需要的3個連鎖表達(dá)的目的基因，共轉(zhuǎn)化效率低。另一方面，共轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株需要經(jīng)過至少1個世代的分離，才能從中篩選到不含有潮霉素篩選標(biāo)記，含有3個連鎖表達(dá)的目的基因的單株，花費的時間較長。本研究中用草甘膦抗性基因Epsps替換潮霉素抗性基因，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pC3300-Epsps-AA-Eat-Red，獲得的轉(zhuǎn)化體Eat9K不需要經(jīng)過后代分離就可以進(jìn)行下一步雜交改造，提高了育種效率。

A?Eat1和eat1基因測序結(jié)果與四引物設(shè)計。B?PCR檢測Eat1和eat1基因。M?DL2000 DNA分子量標(biāo)記；WT?受體品種9K19-5；eat1?eat1基因純合的不育株；H?eat1基因雜合的第三代雜交稻單株；1～3?Eat9K-223雜交轉(zhuǎn)育后的不同單株；4～10?Eat9K-242雜交轉(zhuǎn)育后的不同單株；11?Eat9K-62雜交轉(zhuǎn)育后的不同單株；12～17?Eat9K-150雜交轉(zhuǎn)育后的不同單株；18～20?Eat9K-152雜交轉(zhuǎn)育后的不同單株。

Fig. 5. Marker-assisted selection ofgene.

直播栽培是實現(xiàn)水稻生產(chǎn)過程高效的主要技術(shù)之一，而草害是造成直播稻的重要減產(chǎn)因素[16]。草甘膦是一種殺草高效、環(huán)境友好的除草劑，毒性低，容易被土壤中的微生物降解，對后茬作物的副作用小[17]。水稻普通核不育繁殖系具有草甘膦抗性，除了有利于普通核不育繁殖系的除草和方便直播外，還可以用苗期噴施除草劑的方法去除繁殖系中其他不抗除草劑品種的機械混雜，以及殺死生長在繁殖系大田中的前茬落粒谷，特別是殺死有些地區(qū)存在的、人工難以去除的雜草稻，提高不育系和繁殖系的純度，保障轉(zhuǎn)基因繁殖系的生態(tài)安全[18]。間接提高了第三代雜交稻種子的純度，有利于第三代雜交稻的推廣應(yīng)用。

水稻的生態(tài)適應(yīng)性較弱，長江中下游稻區(qū)的高產(chǎn)品種在華南、華北很難達(dá)到當(dāng)?shù)仄贩N的平均產(chǎn)量。為了適應(yīng)不同稻區(qū)生態(tài)環(huán)境，需要培育遺傳背景多樣化的普通核不育繁殖系。把傳統(tǒng)的雜交育種技術(shù)和分子育種技術(shù)相結(jié)合，能夠提高普通核不育繁殖系的選育效率。本研究培育的單拷貝轉(zhuǎn)基因株系Eat9K-3（基因型為/，/－－－－）具有花粉致死系統(tǒng)，產(chǎn)生的可育花粉都不具有轉(zhuǎn)基因元件。因此，在雜交和回交選育時，普通核不育繁殖系只能作為母本，性狀優(yōu)良的常規(guī)可育品種只能作父本（輪回親本）。在選育的過程中，每一代都需要選擇基因型為/e/－－－－的植株進(jìn)行雜交、回交或自交。轉(zhuǎn)基因元件可以通過相互緊密連鎖的除草劑抗性基因，使用苗期噴施除草劑草甘膦的方法篩選獲得，而與轉(zhuǎn)基因元件自由分離的基因需要采用分子標(biāo)記技術(shù)選擇。如采用傳統(tǒng)的表型選擇技術(shù)篩選基因，隱性基因的表型需要自交一代后才能表現(xiàn)；雜交或回交與自交交替進(jìn)行，降低了普通核不育繁殖系的選育速度和效率。本研究根據(jù)和基因的序列差別，建立四引物分子標(biāo)記輔助選擇法，一次PCR就能區(qū)分野生型（/）、雜合型（/）和突變型（/），簡單、高效，將在普通核不育繁殖系的選育中發(fā)揮重要作用。圖6以科20B為例，詳細(xì)圖示了利用本研究獲得的普通核不育繁殖系Eat9K回交選育優(yōu)良普通核不育繁殖系和不育系的育種程序。

圖6 回交選育普通核不育繁殖系和不育系的育種程序

Fig. 6. Backcross breeding of common genic male sterile line and its multiplication line.

目前報道的第三代雜交水稻使用的普通核不育系最初是通過EMS誘變、輻射誘變或CRISPR/ Cas9基因編輯等方法獲得的[9, 11, 19]。由于普通核不育植株不能自交繁殖種子，要么利用不育系的幼穗進(jìn)行組織培養(yǎng)來繁殖不育植株，要么通過雜交-自交后分離出不育株來保持不育基因資源。Qi等[20]采用兩個獨立載體共轉(zhuǎn)化玉米自交系的方法，一次性獲得了普通核不育基因和普通核不育的恢復(fù)、篩選元件，提高了構(gòu)建SPT系統(tǒng)的速度。其中一個為CRISPR/Cas9敲除載體，它負(fù)責(zé)敲除玉米育性基因為不育基因，另一個載體含有抗草銨膦基因、基因的CDS序列、花粉致死基因和紅色熒光蛋白基因的表達(dá)框。兩個載體共轉(zhuǎn)化常規(guī)可育玉米品種，后代經(jīng)過一次分離可以直接獲得普通核不育系的繁殖系。水稻中也可以利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建載體來敲除某個育性基因，同時構(gòu)建含該育性恢復(fù)基因的CDS序列、花粉致死基因、紅色熒光蛋白篩選標(biāo)記基因、抗除草劑基因的連鎖表達(dá)載體。理論上，兩套載體共轉(zhuǎn)化可以在任何遺傳背景下得到性狀優(yōu)良，具有除草劑抗性的普通核不育繁殖系。這種“一步法”構(gòu)建普通核不育繁殖系的方法與雜交轉(zhuǎn)育一樣，能夠提高普通核不育繁殖系的遺傳多樣性，豐富其種質(zhì)資源。不同的是，它能避免雜交轉(zhuǎn)育所帶來的連鎖累贅。當(dāng)然，在現(xiàn)行農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價制度下，每一個轉(zhuǎn)化事件都要經(jīng)過安全評價才能應(yīng)用于生產(chǎn)，而用已經(jīng)獲得安全證書的轉(zhuǎn)化事件進(jìn)行雜交回交轉(zhuǎn)育時，衍生系可以繼承其安全評價結(jié)果，不需要再重復(fù)漫長的安全評價過程。從這個角度看，雜交回交轉(zhuǎn)育速度更快。預(yù)計今后的轉(zhuǎn)基因育種、SPT系統(tǒng)建立主要會采用雜交回交育種模式。

關(guān)于第三代雜交稻不育系和繁殖系的標(biāo)識符號問題，袁隆平先生在2019年11月3日的第三代雜交稻測產(chǎn)會上指出，不育系沿用核不育基因的后綴S，繁殖系加后綴E，取Genetic engineering中工程的意思。保持系是指能與不育系雜交產(chǎn)生100%不育株的品系。SPT技術(shù)中生產(chǎn)不育系的轉(zhuǎn)基因親本一般不具備100%保持不育性的能力，因此稱為普通核不育系的保持系不恰當(dāng)。當(dāng)前，第三代雜交稻還沒有品種通過審定，標(biāo)識也比較混亂，在此披露袁隆平先生的看法對于規(guī)范行業(yè)標(biāo)識具有積極意義，也是對他老人家的最好紀(jì)念。

本研究驗證了載體pC3300-Epsps-AA-Eat-Red的有效性，創(chuàng)制出了具有草甘膦抗性的水稻普通核不育繁殖系新種質(zhì)Eat9K，建立了區(qū)分和基因的四引物分子標(biāo)記檢測法，為今后利用普通核不育基因進(jìn)行第三代雜交稻育種提供了新的種質(zhì)資源和可靠的分子標(biāo)記輔助選擇方法。

[1] 國家統(tǒng)計局. 國家統(tǒng)計局農(nóng)村司副司長王明華解讀糧食生產(chǎn)情況[EB/OL]. (2021-12-06)[2022-02-03] http:// www.stats.gov.cn/tjsj/sjjd/202112/t20211206_1825059.html. (in Chinese)

National Bureau of Statistics of China. Wang Minghua, deputy director-general of the Department of National Bureau of Statistics of the People's Republic of China and rural affairs, explains the situation of food production. (2021-12-06)[2022-02-03] http://www.stats.gov.cn/tjsj/ sjjd/202112/t20211206_1825059.html. (in Chinese)

[2] 袁隆平, 唐傳道. 雜交水稻選育的回顧、現(xiàn)狀與展望[J].中國稻米, 1999 (4): 3-6.

Yuan L P, Tang C D. Review, present situation and Prospect of hybrid rice breeding[J]., 1999 (4): 3-6. (in Chinese with English abstract)

[3] 雷永群, 宋書鋒, 李新奇. 水稻雜種優(yōu)勢利用技術(shù)的發(fā)展[J]. 雜交水稻, 2017, 32(3): 1-9.

Lei Y Q, Song S F, Li X Q. Development of Technologies for Heterosis Utilization in rice[J]., 2017, 32(3): 1-9. (in Chinese with English abstract)

[4] 陳樂天, 劉耀光. 水稻野敗型細(xì)胞質(zhì)雄性不育的發(fā)現(xiàn)利用與分子機理[J]. 科學(xué)通報, 2016, 61(35): 3804-3812.

Chen L T, Liu Y G. Discovery, utilization and molecular mechanisms of CMS-WA in rice[J]., 2016, 61: 3804-3812. (in Chinese with English abstract)

[5] 鄭興飛, 董華林, 郭英, 殷得所, 王紅波, 胡建林, 查中萍, 曹鵬, 徐得澤. 兩系法雜交水稻的育種成就與展望[J]. 作物研究, 2021, 35(5): 509-513.

Zheng X F, Dong H L, Guo Y, Yin D S, Wang H B, Hu J L, Zha Z P, Cao P, Xu D Z. Achievements and prospects of two-line system hybrid rice breeding[J]., 2021, 35(5): 509-513. (in Chinese with English abstract)

[6] 牟同敏. 中國兩系法雜交水稻研究進(jìn)展和展望[J]. 科學(xué)通報, 2016, 61(35): 3761-3769.

Mou T M. The research progress and prospects of two-line hybrid rice in China[J]., 2016, 61: 3761-3769. (in Chinese with English abstract)

[7] 肖國櫻, 鄧曉湘, 唐俐, 唐傳道. 水稻光溫敏核不育系育性波動的解決途徑和方法[J]. 雜交水稻, 2000(4): 6-11.

Xiao G Y, Deng X X, Tang L, Tang C D. Solutions to fertility fluctuation of photo thermo sensitive genic male sterile lines in rice[J]., 2000(4): 6-11.

[8] Liao C C, Yan W, Chen Z F, Xie G, Deng X W, Tang X Y. Innovation and development of the third-generation hybrid rice technology[J]., 2021, 9(3): 693-701.

[9] Song S F, Wang T K, Li Y X, Hu J, Kan R F, Qiu M D, Deng Y D, Liu P X, Zhang L C, Dong H, Li C X, Yu D, Li X Q, Yuan D Y, Yuan L P, Li L. A novel strategy for creating a new system of third-generation hybrid rice technology using a cytoplasmic sterility gene and a genic male-sterile gene[J]., 2021, 19(2): 251-260.

[10] 新華社. 第三代雜交水稻單季畝產(chǎn)創(chuàng)新紀(jì)錄[EB/OL]. (2021-09-30)[2022-01-01]. http://www.agri.cn/province/ fujian/nyyw/ 202109/ t2021 0930_7763887.htm.

Xinhua News Agency. Record of the third generation hybrid rice yield in single season [EB/OL]. (2021-09-30) [2022-01-01]. http://www.agri.cn/province/fujian/nyyw/ 202109/ t20210930_7763887.htm. (in Chinese)

[11] 余東. 第三代雜交水稻普通核不育系種子繁殖體系構(gòu)建及應(yīng)用[D]. 長沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2020.

Yu D. Construction and application of seeds propagation system for spontaneous genic male sterile line in the third generation hybrid rice[D]. Changsha: Hunan Agricultural University, 2020. (in Chinese with English abstract)

[12] 曾崇華, 陳芬, 孟秋成, 于江輝, 肖友倫, 李錦江, 肖國櫻. 水稻HD9802S/Kasalath后代中高組織培養(yǎng)力家系的篩選[J]. 雜交水稻, 2016, 31(1): 51-56.

Zeng C H, Chen F, Meng Q C, Yu J H, Xiao Y L, Li J J, Xiao G Y. Selection of families with high tissue culture ability in filial generation of HD9802S/Kasalath in rice[J]. 2016, 31(1): 51-56. (in Chinese with English abstract)

[13] 鄧力華.、和基因的優(yōu)化以及在水稻中的表達(dá)研究[D]. 合肥: 中國科學(xué)院大學(xué), 2013.

Deng L H. Optimizing and expressing of,andgenes in rice[D]. Hefei: University of Chinese Academy of Sciences, 2013. (in Chinese with English abstract)

[14] Gibson D G, Young L, Chuang R Y, Venter J. C, Hutchison C A. Smith H O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases[J]., 2009, 6(5): 343-345.

[15] 王作平. 植酸酶-乳鐵蛋白肽融合基因在水稻中的功能驗證[D]. 合肥: 中國科學(xué)院大學(xué), 2016.

Wang Z P. Functional verification of a novel phytase- lactoferricin fusion gene in rice[D]. Hefei: University of Chinese Academy of Sciences, 2016. (in Chinese with English abstract)

[16] 肖國櫻, 肖友倫, 李錦江, 鄧力華, 翁綠水, 孟秋成, 于江輝. 高效是當(dāng)前水稻育種的主導(dǎo)目標(biāo)[J]. 中國水稻科學(xué), 2019, 33(4): 287-292.

Xiao G Y, Xiao Y L, Li J J, Deng L H, Weng L S, Meng Q C, Yu J H. High efficiency is a dominant target for current rice breeding[J]., 2019, 33(4): 287-292. (in Chinese with English abstract)

[17] 朱江月, 石云鷺.“綠色”除草劑—草甘膦[J]. 大豆科技, 2019(5): 40-43.

Zhu J Y, Shi Y L. Green herbicide: Glyphosate[J]., 2019(5): 40-43. (in Chinese)

[18] 肖國櫻, 陳芬, 孟秋成, 周浩, 李錦江, 于江輝, 鄧力華, 翁綠水. 我國轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻的生態(tài)風(fēng)險與控制[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2015, 23(1): 1-11.

Xiao G Y, Chen F, Meng Q C, Zhou H, Li J J, Yu J H, Deng L H, Weng L S. Ecological risk and management of herbicide-resistant transgenic rice() in China[J]., 2015, 23(1): 1-11. (in Chinese with English abstract)

[19] Chang Z, Chen Z, Wang N, Xie G, Lu J, Yan W, Zhou J, Tang X, Deng X W. Construction of a male sterility system for hybrid rice breeding and seed production using a nuclear male sterility gene[J]., 2016, 113(49): 14145-14150.

[20] Qi X T, Zhang C S, Zhu J J, Liu C L, Huang C L, Li X H, Xie C X. Genome editing enables next-generation hybrid seed production technology[J]., 2020, 13(9): 1262-1269.

Construction and Verification of Vector Containing Glyphosate Resistance Selection Marker for Multiplication of Common Genic Male Sterile Lines in Rice

LI Yanyao1, 2, DENG Lihua1, LI Xinyan1, LI Hua1, QIN Guannan1, WENG Lüshui1, YU Jianghui1, LI Jinjiang1, XIAO Guoying1, 3,*

(1Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;2University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;3Innovation Academy for Seed Design, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China；*Corresponding author, email: xiaoguoying@isa.ac.cn)

【Objective】 The hygromycin resistance gene is often used as a selection marker in expression vectors for multiplication of common genic male sterile (CGMS) lines in rice. The glyphosate resistance gene replaces the hygromycin resistance gene as it not only gives the multiplication line glyphosate resistance, but also bypasses the current policy restrictions on the use of antibiotic marker genes in genetically modified crops. 【Methods】An expression vector pC3300-Epsps-AA-Eat-Red was constructed by using homologous recombination method in order to multiply the rice CGMS line withmutation gene, which harbors the glyphosate resistance geneEpsps, pollen lethal gene, CGMS restorer geneand red fluorescent gene.-mediated transformation method was adopted. 【Results】 Transformation ofrice line 9K19-5 produced 318 regenerated plants of the CGMSmultiplication line Eat9K that could restore the sterility ofand resist glyphosate. The phenotype identification of single copy transformant Eat9K-3 showed that: there were two kinds of pollens in anthers, one was fertile and the other was sterile; the seeds included two types, one was with fluorescence and the other was without fluorescence; the seedlings from fluorescent seeds tolerated at least 1 g/L glyphosate. In addition, this study established a four-primer detection method to distinguish the wild-type genefrom the genic male sterile gene. 【Conclusion】 This study not only verified the effectiveness of the expression vector, but also created the new germplasm of CGMS multiplication line with herbicide resistance, as well as established a four-primer detection method to distinguish the wild-type genefrom genic male sterile gene.

glyphosate resistance; pollen lethality; sterility recovery; common genic male sterile multiplication line

10.16819/j.1001-7216.2022.211226

2021-12-26；

2022-02-25。

湖南省科技創(chuàng)新計劃種業(yè)創(chuàng)新項目（2021NK1012）。