超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測豬膽粉中黃曲霉毒素的2種前處理方法比較研究

廖予菲,王 萍，張瑞瑞，程茜菲

(陜西國際商貿(mào)學院 ,陜西 咸陽 712046)

黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFs)是一類結構類似的真菌(黃曲霉Aspergillus flavus和寄生曲霉A.parasiticus等)代謝產(chǎn)物，目前發(fā)現(xiàn)的20余種黃曲霉毒素中毒性較強主要有B1、B2、G1、G2等[1]。黃曲霉毒素具有致癌、致畸、致突變作用，可導致動物全身性損害，其中黃曲霉毒素B1被聯(lián)合國確定為Ⅰ類致癌物[2]。傳統(tǒng)中藥材儲存運輸中極易發(fā)生霉變，滋生黃曲霉毒素，其中以種子果實類為最?，F(xiàn)行的2020版《中國藥典》規(guī)定24種中藥材應檢測黃曲霉毒素，相對2015版《中國藥典》增加了土鱉蟲、延胡素等5個品種。本文研究對象豬膽粉是中醫(yī)藥傳統(tǒng)藥物，來源于豬膽汁的干燥品，雖未納入中國藥典規(guī)定應檢測的藥材品種，但其生產(chǎn)加工過程較易產(chǎn)生黃曲霉毒素，同樣值得關注。

現(xiàn)行中國藥典規(guī)定的黃曲霉毒素檢測方法包括HPLC-FLD(高效液相色譜-熒光檢測法)、UPLC-MS/MS、ELISA(酶聯(lián)免疫法)。因黃曲霉毒素為痕量檢測，中藥往往基質(zhì)復雜，易出現(xiàn)假陽性結果[3]。較其他兩種方法，UPLC-MS/MS法靈敏高、專屬性強，能有效排除強干擾基質(zhì)影響，適用于中藥黃曲霉毒素的檢測[4]。

藥典中與色譜法配套的樣品前處理方法為免疫親和柱法，該方法利用高度專一性的抗體與黃曲霉毒素產(chǎn)生特異性結合，從而達到有效分離干擾物質(zhì)的作用，凈化效果較好，但該法操作步驟多，成本較高，較難實現(xiàn)快速高效檢測中藥中黃曲霉毒素。QuEChERS法是一種快速高效的樣品前處理方法，近年來，在以農(nóng)藥殘留量檢測為代表的中藥外源性污染物檢測領域該方法得到了廣泛應用，中國藥典2020版中將該方法作為禁用農(nóng)藥殘留測定的前處理方法之一，也有部分學者將其應用于中藥黃曲霉毒素檢測中[5]。

筆者對比了免疫親和柱法及QuEChERS法兩種樣品前處理方法，以期為快速高效測定中藥中的黃曲霉毒素提供思路。此外，準確快速檢驗國藥，對于“三農(nóng)”中家畜豬的養(yǎng)殖，充分利用家畜副產(chǎn)品具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

Acquity UPLC H-Class XEVO TQD超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters科技有限公司)；TE124S型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)； PriboFast固相萃取裝置(普瑞邦科技有限公司)； HC-3018R型高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)。

1.2 實驗材料

黃曲霉毒素混合對照品溶液(Bepure，批號D0017654)，其中黃曲霉毒素G2濃度為0.3 μg/mL；黃曲霉毒素G1濃度為1.0 μg/mL；黃曲霉毒素B2濃度為0.3 μg/mL；黃曲霉毒素B1濃度為1.0 μg/mL。

免疫親合柱(美國Romer Labs)；QuEChERS dSPE 樣品萃取凈化管(島津制作所),甲醇、乙腈(美國Fiher公司，色譜純)、乙酸銨(德國Merck公司，色譜純)，氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司，優(yōu)級純)。豬膽粉(批號：Y1-190102，Y1-191013，福建省仙游縣南豐生化有限公司)，由陜西國際商貿(mào)學院王萍副教授鑒定為豬科動物豬Sus scrofa domestica Brisson.膽汁的干燥品，其中經(jīng)前期檢測Y1-190102未檢出黃曲霉素污染，可作為陰性空白，Y1-191013檢出黃曲霉毒素B2。

2 實驗過程

2.1 質(zhì)譜條件

離子源模式(ESI源)：正電離模式；掃描方式為多反應離子監(jiān)測(MRM)；離子源溫度：150 ℃；毛細管電壓：0.5 KV；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流速：900 L/Hr；錐孔氣流速：30 L/Hr。質(zhì)譜采集參數(shù)信息見表1。

表1 質(zhì)譜采集參數(shù)信息

2.2 色譜條件

色譜柱：waters ACQUITY UPLC C18(2.1×100 mm，1.7 μm)；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣體積：2 μL。以10 mmol/L乙酸銨溶液為流動相A , 以甲醇為流動相B，按表2中的規(guī)定進行梯度洗脫。

表2 液相色譜梯度條件

2.3 對照品溶液配制

精密吸取1 mL黃曲霉毒素混合對照品溶液，加70%甲醇定容于10 mL量瓶，制備成黃曲霉毒素G2濃度為29.55 ng/mL、黃曲霉毒素G1濃度為99.50 ng/mL、黃曲霉毒素B2濃度為29.70 ng/mL、黃曲霉毒素B1濃度為99.80 ng/mL的混合對照品儲備溶液。

移取上述混合對照品儲備溶液適量，加70%甲醇稀釋得黃曲霉毒素G2濃度分別為0.06、0.15、0.30、0.59、1.48、2.36、2.96 ng/mL，黃曲霉毒素G1濃度分別為0.20、0.50、1.00、1.99、4.98、7.96、9.95 ng/mL，黃曲霉毒素B2濃度分別為0.06、0.15、0.30、0.59、1.49、2.38、2.97 ng/mL，黃曲霉毒素B1濃度分別為0.20、0.50、1.00、2.00、4.99、7.98、9.98 ng/mL的1-7號標準系列工作溶液。

2.4 樣品前處理

2.4.1 免疫親和柱法 取供試品粉末約2 g，精密稱定，置于均質(zhì)瓶中，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速攪拌2 min(攪拌速度大于11 000 r/min)，離心5 min(離心速度4 000 r/min)，精密量取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，離心10 min(離心速度4 000 r/min)，精密量取上清液20 mL，通過免疫親合柱，流速每分鐘3 mL，用淋洗緩沖液10 mL洗脫，再用水10 mL洗脫，棄去洗脫液，使空氣進入柱子，將水擠出柱子，再用適量甲醇洗脫收集洗脫液，置2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.2 QuEChERS法 取供試品粉末2 g，精密稱定，置50 mL離心管中，加入乙腈20 mL，渦旋1 min，超聲10 min，離心5 min(離心速率10 000 r/min)，取上清液，倒入QuEChERS dSPE 凈化管，充分渦旋振蕩2 min，離心5 min(離心速率5 000 r/min)，取上清液1 mL用50 ℃氮氣吹干，快速加入甲醇1 mL，過微孔濾膜(0.22 μm)，取濾液，即得。

2.5 測定法

按“2.2”項下色譜條件，分別精密吸取“2.3”項下對照品溶液和“2.4”項下兩種前處理方法所制供試品溶液注入液相色譜儀，測得色譜圖見圖1、圖2。

圖1 黃曲霉毒素混合對照品總離子流

圖2 豬膽粉供試品總離子流

2.6 線性關系

精密吸取“2.3項”下標準系列工作溶液各濃度2μL分別注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，每個濃度重復測定2次，以峰面積為縱坐標，進樣濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結果如表3所示。

表3 標準曲線回歸方程

結果表明黃曲霉毒素G2在0.06～2.96 ng/mL、黃曲霉毒素G1在0.20～9.95 ng/mL、黃曲霉毒素B2在0.06～2.97 ng/mL、黃曲霉毒素B1在0.20～9.98 ng/mL濃度范圍內(nèi)相關系數(shù)r>0.999，濃度與峰面積呈良好線性關系，可用于標準曲線法定量。

2.7 重復性對比研究

取批號為Y1-191013的供試品分別按照“2.4” 項下兩種前處理方法各制備6份樣品，每份重復測定2次，按標準曲線法計算出樣品中黃曲霉毒素B2含量，結果顯示免疫親和柱法RSD為3.9%、QuEChERS法RSD值為2.7%。

2.8 回收率對比研究

2.8.1 免疫親和柱法 取批號為Y1-191013的供試品粉末，精密稱定9份，分別按表4加入高、中、低濃度的 “2.3”項下混合對照品儲備溶液各三份，按“2.4.1”項下的方法制備，每份重復測定2次。

表4 免疫親和柱法加標回收率結果

2.8.2 QuEChERS法 取批號為Y1-191013的供試品粉末，精密稱定9份，分別按表5加入高、中、低濃度的 “2.3”項下混合對照品儲備溶液各三份，按“2.4.2”項下的方法制備，每份重 復測定2次。

表5 QuEChERSF法加標回收率結果

2.9 檢測限對比研究

取批號為Y1-190102的供試品粉末，通過比較低濃度分析物樣品與空白樣品測量的信號，依據(jù)信噪比為3∶>1對應的最低濃度為檢出限的規(guī)定，倍比稀釋相應濃度的對照品溶液加入供試品，分別按照“2.4”項下兩種前處理方法各制備3份樣品，分析可知，免疫親和柱法檢測限為黃曲霉毒素G2∶0.0 294 μg/kg，黃曲霉毒素G1∶>0.0 988 μg/kg，黃曲霉毒素B2∶>0.0 212 μg/kg，黃曲霉毒素B1∶0.0 888 μg/kg；QuEChERS法檢測限為黃曲霉毒素G2∶>0.0 344 μg/kg，黃曲霉毒素G1∶>0.1 256 μg/kg，黃曲霉毒素B2∶>0.0 279 μg/kg，黃曲霉毒素B1∶0.1 162 μg/kg。

3 結果與討論

3.1 前處理方法對比研究結果

兩種前處理方法所制樣品中雜質(zhì)對四種黃曲霉毒素峰均無干擾，能專屬的測定黃曲霉毒素，相對而言，免疫親和柱法處理效果更佳，雜質(zhì)較少，這與該方法能特異性結合黃曲霉毒素有關。

回收率對比實驗結果采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。計量資料采用均數(shù)±標準差表示。數(shù)據(jù)均采用獨立樣本t檢驗，P≤0.05認為有顯著性差異。分析結果見表6。

表6 兩種前處理方法回收率結果比較

兩種方法對黃曲霉毒素G族回收率結果無顯著性差異，對黃曲霉毒素B族則QuEChERS法回收率更高，該方法操作簡單，步驟少，能相應減少樣品處理過程中分析對象的損失。重復性、檢測限對比實驗結果，免疫親和柱法則略優(yōu)于QuEChERS法。整體來看，兩種方法均能專屬、快速、靈敏、準確的實現(xiàn)樣品處理分析，均可作為豬膽粉黃曲霉毒素測定的前處理方法，但綜合經(jīng)濟成分和時間成本分析，QuEChERS成本低、操作方便、回收率高、污染小，更符合“綠色化學”的理念[6]。

3.2 提取方法考察

好的提取方法能夠充分提出待測組分，有利于后續(xù)的分離純化，對于黃曲霉毒素這種痕量污染物提取方法的優(yōu)劣直接影響分析結果。實驗分別對高速均質(zhì)法和超聲提取法進行了考察，發(fā)現(xiàn)對免疫親和柱處理的樣品，超聲提取法效果不如高速均質(zhì)法，而QuEChERS法兩者差異不大，因此在免疫親和柱處理前選擇了高速均質(zhì)法，QuEChERS法則出于方便考慮選擇渦旋后超聲處理樣品。

3.3 中藥豬膽粉黃曲霉毒素污染情況

實驗對不同廠家生產(chǎn)的15批次豬膽粉藥材進行了黃曲霉毒素的測定，結果顯示6批次有黃曲霉毒素檢出，雖均未超過中國藥典對黃曲霉毒素設定的限量：黃曲霉毒素B1不得超過5 μg/kg，黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2和黃曲霉毒素B1的總量不得超過10 μg/kg[7]。作為動物來源藥材，豬膽粉雖未作為《中國藥典》2020年版中規(guī)定測定黃曲霉毒素的品種，其生產(chǎn)加工過程中易產(chǎn)生黃曲霉毒污染，藥品的安全值得我們關注。

4 結論

實驗以中藥豬膽粉作為研究對象，采用UPLC-MS/MS作為測定方法，分別通過免疫親和柱法及QuEChERS法進行樣品前處理，通過考察方法的穩(wěn)定性、重復性、回收率、檢測限，對兩種前處理方法進行評價，結果表明兩種前處理方法各有優(yōu)劣，但整體而言，從操作簡便，節(jié)約成本的角度來講，QuEChERS法更優(yōu)。該方法可考慮進一步推廣到其他藥材及中成藥黃曲霉毒素檢測中，但中藥往往基質(zhì)復雜，基質(zhì)對痕量物質(zhì)檢測結果影響較大，QuEChERS法在黃曲霉毒素測定中是否具有普適性，仍需實驗驗證。