自體月經(jīng)血來源的干細(xì)胞在宮腔粘連中的臨床應(yīng)用

馬海蘭，陸蘭英，王巍，劉夢婷，何梅，李美玲

1.桂平市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣西桂平 537200；2.武漢漢密頓生物科技股份有限公司，湖北武漢 430000

宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）是子宮內(nèi)膜基底層損傷后功能層再生修復(fù)障礙、纖維瘢痕組織形成導(dǎo)致宮腔部分或完全封閉。主要癥狀為月經(jīng)量少，甚至閉經(jīng)、不孕等[1]。目前臨床治療IUA以手術(shù)為主，輔以子宮內(nèi)膜再生修復(fù)和增加子宮內(nèi)膜血流等綜合管理。對中重度粘連患者來說，術(shù)后粘連復(fù)發(fā)、內(nèi)膜再生障礙等仍不能有效避免，宮腔粘連術(shù)后總體復(fù)發(fā)率為3.1%～23.5%，其中重度粘連高達62.5%[2]。本課題旨在探究2018年4月—2021年4月于桂平市人民醫(yī)院就診的因?qū)m腔粘連導(dǎo)致不孕的50例患者，經(jīng)自體月經(jīng)血來源的干細(xì)胞移植后的臨床應(yīng)用效果?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有參與者在充分了解細(xì)節(jié)、失敗可能性和程序風(fēng)險后簽署知情同意書。選取于本院就診的50例不孕患者為研究對象。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡22～40歲；②接受“試管嬰兒”助孕治療、移植2次以上失??；③2次宮腔鏡證實為宮腔中、重度粘連[按照歐洲婦科內(nèi)鏡協(xié)會IUA分類標(biāo) 準(zhǔn)（european society of gynecological endoscopy，ESGE）]；④傳統(tǒng)治療手段后內(nèi)膜厚度＜6 mm（B超檢查評估）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并泌尿生殖系急性炎癥患者；②合并活動性生殖器結(jié)核患者。

1.3 IUA分類標(biāo)準(zhǔn)

Ⅰ度：宮腔內(nèi)多處有纖細(xì)膜樣粘連帶，兩側(cè)宮角及輸卵管開口正常；Ⅱ度：子宮前后壁間有致密的纖維束粘連，兩側(cè)宮角及輸卵管開口可見；Ⅲ度：纖維索狀粘連致部分宮腔及一側(cè)宮角閉鎖；Ⅳ度：纖維索狀粘連致部分宮腔及兩側(cè)宮角閉鎖；Ⅴa度：粘連帶瘢痕化致宮腔極度變形及狹窄；Ⅴb：粘連帶瘢痕化致宮腔完全消失。其中，Ⅰ～Ⅱ度為輕度粘連，Ⅲ度為中度粘連，Ⅳ～Ⅴ度為重度粘連[3]。

1.4 方法

1.4.1 常規(guī)治療 宮腔鏡術(shù)后予常規(guī)雌孕激素序貫療法，于月經(jīng)第5日開始服用戊酸雌二醇片（國藥準(zhǔn)字號J20130009，1 mg/片），2次/d，2片/次，連服22 d，于最后10 d加用地屈孕酮片（注冊證號H20130110，10 mg/片）治療，2次/d，10 mg/次。重復(fù)3個周期。

1.4.2 自體月經(jīng)血來源的干細(xì)胞治療 在常規(guī)治療后采用自體月經(jīng)血來源的干細(xì)胞進行宮腔內(nèi)局部移植治療。具體方法如下。

（1）月經(jīng)血收集?；颊哂谠陆?jīng)前檢查陰道、宮頸分泌物，無細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體感染；月經(jīng)期第2天碘伏消毒外陰、陰道，用肝素鈉潤洗月經(jīng)杯，并置于陰道內(nèi)穹隆扣住子宮頸，收集12 h內(nèi)月經(jīng)血3～10 mL，將經(jīng)血與磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（含antibiotic-antimycotic）等體積稀釋后，送至武漢漢密頓生物科技股份有限公司分離培養(yǎng)內(nèi)膜干細(xì)胞并冷凍保存，擇期送回本院胚胎培養(yǎng)室繼續(xù)冷凍保存。

（2）經(jīng)血來源的干細(xì)胞(menstrual blood-derived stem cells，MenSCs)的收集與分離。將稀釋后的血液沿著盛有1/2體積的Ficoll（GE Healthcare）分離液的離心管上管壁緩慢加入，室溫900×g，離心30 min。無菌巴氏吸管緩慢吸取中間層細(xì)胞，置于約2倍體積的PBS溶液中，室溫300×g，離心10 min。棄上清，PBS再次清洗2次，留取細(xì)胞沉淀。

（3）MenSCs的培養(yǎng)與擴增。①原代培養(yǎng)：細(xì)胞隨后放于含antibiotic-antimycotic的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24 h后PBS溶液洗滌除去未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞記做P0代。

②傳代培養(yǎng)與凍存建庫：每隔3～5 d更換培養(yǎng)基，細(xì)胞融合度達到80%～90%時消化傳代。棄培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞一遍，加入0.25%的胰酶，37℃孵育3 min，待細(xì)胞變圓，輕輕拍打瓶身使MenSCs全部脫落，加入全培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞，1 000 r/min，離心5 min，收集沉淀用新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞至所需細(xì)胞濃度，移至新的培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)。重復(fù)上述操作，將細(xì)胞培養(yǎng)傳代至P4代，收集后建立工作細(xì)胞庫，凍存待用。

（4）MenSCs的檢測與鑒定。①微生物檢測：細(xì)胞上清液進行細(xì)菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素檢測。一旦檢測到有微生物污染，細(xì)胞應(yīng)立即丟棄。

②MenSCs的表面標(biāo)志物鑒定：取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，將細(xì)胞消化分散成單個細(xì)胞，并平均分成7份置于流式管，每份1×106個細(xì)胞，按要求分別加入以下流式抗體：CD73、CD90、CD105、CD44、CD34、CD45、CD19、HLA-DR，室溫避光孵育30 min，按要求上樣及使用流式細(xì)胞儀。

③MenSCs誘導(dǎo)分化：取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，將細(xì)胞消化分散成單個細(xì)胞懸液，按1×106/孔，均勻鋪在6孔板。細(xì)胞貼壁后更換成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每3～4天更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)2～3周后分別進行油紅O(Oil Red O)、茜素紅(Alizarin Red)、阿利新藍(lán)(Alcian blue)染色鑒定MenSCs的分化潛能。見圖1。

圖1 MenSCs特征。A是P0及P4的圖像（scale bar=50 μm）；B是流式細(xì)胞測定MenSCs的陽性表面標(biāo)志物CD73,CD105和CD90，以及陰性表面標(biāo)志物CD34,CD45和HLA-D1；C分別是油紅O(左)、茜素紅(右)染色鑒定的成脂、成骨誘導(dǎo)分化的MenSCs。MenSCs為月經(jīng)血干細(xì)胞

（5）MenSCs解凍。月經(jīng)期第2天，通知患者準(zhǔn)備移植干細(xì)胞。核對患者信息后，將已凍存的干細(xì)胞在37℃水浴中復(fù)蘇2 min，吸到8 mL生理鹽水中，120 g，離心5 min；用3 mL生理鹽水重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整濃度至（3～4）×106/mL，用3支1 mL注射器分別吸取1 mL備用。

（6）MenSCs移植?；颊呷〗厥唬夥Ｒ?guī)消毒外陰及陰道，無菌紗布擦干陰道、宮頸及陰道穹隆部，移植前輕微地搔刮子宮腔清除子宮腔內(nèi)殘留的內(nèi)膜層凝血塊。在腹部B超引導(dǎo)下，經(jīng)宮頸管插入胚胎移植管達子宮內(nèi)膜基底層下0.5 cm，取出管芯，接5 mL裝生理鹽水注射器，加壓推注有阻力，再接裝有1 mL干細(xì)胞懸液的注射器，緩慢注射細(xì)胞懸液0.5 mL，緩慢撤回移植管，同時繼續(xù)注射剩余的0.5 mL細(xì)胞懸液直到尖端退出子宮內(nèi)膜外。選取另外兩個位點，重復(fù)移植操作2次。術(shù)后患者屈膝平躺2 h，術(shù)中靜脈輸注250 mL生理鹽水+間苯三酚(40 mg/支，國藥準(zhǔn)字H20046766)40 mg抑制子宮收縮。

（7）激素療法。采用激素替代療法刺激子宮內(nèi)膜生長，患者于干細(xì)胞移植日開始口服芬嗎通（紅片為雌二醇片2 mg/片；黃片為雌二醇地屈孕酮片，每片含雌二醇2 mg和地屈孕酮10 mg）。先服芬嗎通紅片，1片/次，3次/d，連服14 d后給予芬嗎通黃片口服，1片/次，3次/d，服14 d停藥。待撤退性出血第3天，重復(fù)第2周期激素療法。于服用芬嗎通紅片后第12天行B超檢查子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)，若子宮內(nèi)膜厚度＜7 mm則予芬嗎通黃片口服，1片/次，3次/d，服14 d停藥，于撤退性出血后再重復(fù)第3個周期激素療法。如子宮內(nèi)膜厚度仍＜7 mm，則考慮進行第二輪MenSCs移植治療。在第2周期激素療法過程中，若子宮內(nèi)膜厚度＞7 mm，且內(nèi)膜形態(tài)為A型或B型說明達到預(yù)期效果，繼續(xù)口服芬嗎通紅片,1片/次，3次/d，連續(xù)3 d，抽血查性激素雌二醇＞200 pg/mL，孕酮＜1.0 ng/mL，即予黃體酮肌內(nèi)注射，60 mg/d（20 mg/支，國藥準(zhǔn)字H33020828），持續(xù)注射4 d，予移植D3胚胎或注射6 d，予移植D5、D6囊胚。

1.4.3 胚胎移植 移植后繼續(xù)予口服芬嗎通紅片2 mg，3次/d，雪諾同90 mg塞陰道作為黃體支持，移植后10～14 d回院驗孕。

1.5 觀察指標(biāo)

①月經(jīng)情況[4]：患者在干細(xì)胞治療前后，于經(jīng)期自行通過月經(jīng)杯收集經(jīng)血，記錄1～2個月的月經(jīng)持續(xù)時間及經(jīng)量。②子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)：采用ALOKA超聲診斷儀F31檢查子宮內(nèi)膜形態(tài)，探頭頻率約是4～9 MHz。子宮內(nèi)膜厚度測量范圍為：距子宮底1 cm處一側(cè)的子宮內(nèi)膜回聲起始處至另一側(cè)子宮內(nèi)膜回聲起始處。子宮內(nèi)膜形態(tài)分型標(biāo)準(zhǔn)[5]：強回聲區(qū)在外層與中央?yún)^(qū)域出現(xiàn)，低回聲區(qū)或暗區(qū)在外層與宮腔中線之間，呈現(xiàn)“三線征”為A型；均一的中等強回聲，宮腔強回聲中線斷續(xù)不清，屬于B型；無宮腔中線回聲，且出現(xiàn)均質(zhì)強回聲區(qū)屬于C型。達到A和B型，則認(rèn)為治療效果良好，可以進行凍融胚胎移植治療。③妊娠結(jié)局：于胚胎移植后第10～14天抽血查人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG），HCG＞25 U/L則診斷為生化妊娠。于胚胎移植后28 d行陰道B超檢查，查見宮腔內(nèi)孕囊及原始心管搏動，則診斷為臨床妊娠，即為妊娠成功。

1.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以(xˉ±s)表示，組間差異比較采用t檢驗；計數(shù)資料以[n(%)]表示，組間差異比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者治療前后經(jīng)期、經(jīng)量、內(nèi)膜厚度比較

治療后，患者經(jīng)期、經(jīng)量及內(nèi)膜厚度明顯高于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 患者治療前后經(jīng)期、經(jīng)量、內(nèi)膜厚度比較(±s)

表1 患者治療前后經(jīng)期、經(jīng)量、內(nèi)膜厚度比較(±s)

項目經(jīng)量（mL）內(nèi)膜厚度（mm）經(jīng)期（d）治療前11.76±6.93 4.86±0.74 3.22±1.83治療后32.28±13.84 7.45±0.87 4.34±1.28 t值14.49 31.27 7.89 P值＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 患者治療前后子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)比較

患者治療后子宮內(nèi)膜形態(tài)較治療前明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 患者治療前后子宮內(nèi)膜形態(tài)比較

2.3 患者治療后妊娠結(jié)局

治療后，有27例仍未妊娠，23例臨床妊娠（妊娠率46%），其中3例雙胎妊娠，余為單胎妊娠。

3 討論

IUA由Asherman首次對該疾病進行命名并作詳細(xì)描述，因此也稱Ashmen's綜合征[6]。IUA是繼發(fā)性不孕患者常見的病因，占不孕癥發(fā)病原因的8%[7]。有學(xué)者提出，IUA的發(fā)生與子宮內(nèi)膜干細(xì)胞減少、缺失、功能缺陷有關(guān)[8]。

強大的再生修復(fù)能力是子宮內(nèi)膜的主要特點。子宮內(nèi)膜基底層受損是子宮內(nèi)膜再生修復(fù)障礙主要原因。相關(guān)研究表明，子宮內(nèi)膜再生修復(fù)的來源主要是子宮內(nèi)膜干細(xì)胞存在于子宮內(nèi)膜基底層[9]。2004年，Chan等[10]首次利用細(xì)胞克隆技術(shù)從子宮內(nèi)膜組織單細(xì)胞懸液中培養(yǎng)出上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞克隆，證實子宮內(nèi)膜中存在干細(xì)胞。胡嘉[11]研究關(guān)于從健康生育年齡女性的月經(jīng)血分離得到內(nèi)膜干細(xì)胞，并證明該細(xì)胞具有超強的增殖能力，認(rèn)為此細(xì)胞在內(nèi)膜的再生中有重要作用。當(dāng)嚴(yán)重的內(nèi)膜損傷如子宮內(nèi)膜電切術(shù)、產(chǎn)后刮宮創(chuàng)傷、子宮內(nèi)膜炎等均可以導(dǎo)致子宮內(nèi)膜干細(xì)胞數(shù)量減少或功能受損，內(nèi)膜無法完全再生并瘢痕化，最終導(dǎo)致IUA。

干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，不同來源的干細(xì)胞如骨髓干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞和月經(jīng)血來源干細(xì)胞等都有用于治療IUA的研究報道。Santamaria等[12]研究自體移植CD133陽性的骨髓來源干細(xì)胞在治療難治性IUA和子宮內(nèi)膜萎縮中的療效，16位患者中，15個恢復(fù)了月經(jīng)，其中2名分娩足月兒。Cao等[13]將加載人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的可降解膠原支架移植到IUA復(fù)發(fā)者的宮腔，患者子宮內(nèi)膜平均厚度增加，妊娠率約為40%（10/26）。前期，臨床治療IUA的應(yīng)用中以骨髓來源的干細(xì)胞為主，但骨髓干細(xì)胞的收集具有侵入性，細(xì)胞的增殖能力隨年齡增長而下降，患者接受性差等缺陷限制其在臨床中的應(yīng)用。

MenSCs和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，有相似的表型和特性，如呈長梭形旋渦狀生長，細(xì)胞表面分子和三胚層分化能力。MenSCs表達間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子CD105、CD73、CD90、CD29，不表達造血干細(xì)胞表面分子CD34、CD45和CD133。然而，有研究報道MenSCs表達其他來源間充質(zhì)干細(xì)胞不表達的多能胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)記分子，如SSEA-4、Nanog、Oct-4[14]。研究證實，MenSCs經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，可以向脂肪、成骨、內(nèi)皮、心肌、神經(jīng)、呼吸上皮、肝臟等細(xì)胞分化[15]。MenSCs還具有免疫調(diào)節(jié)作用。在潰瘍性腸炎小鼠中，MenSCs減少炎癥細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞的浸潤，降低炎癥因子IL-2和TNF-α的含量而升高IL-4及IL-10的含量[16]。有學(xué)者在電損傷致小鼠IUA模型中靜脈注射人來源的MenSCs，MenSCs能夠顯著增加內(nèi)膜厚度，促進血管生成，懷孕率和胚胎數(shù) 量 顯 著 升高[17]。Tan等[18]利 用CD44、CD73、CD90和CD105陽性的月經(jīng)血干細(xì)胞治療7名重度宮腔粘連的患者，所有患者子宮內(nèi)膜均增厚，1名自然懷孕，2名經(jīng)胚胎移植后成功懷孕。

本研究結(jié)果顯示，50例患者，宮腔移植CD73、CD105和CD90陽性的MenSCs后，經(jīng)期、經(jīng)量均較治療前有不同程度的增加；子宮內(nèi)膜厚度較治療前增厚[（4.86±0.75）mm vs（7.45±0.87）mm）]；子宮內(nèi)膜形態(tài)較治療前明顯好轉(zhuǎn)（P＜0.001）。相關(guān)學(xué)者利用含有CD73、CD90和CD105陽性的月經(jīng)血干細(xì)胞治療重度宮腔粘連患者，所有患者子宮內(nèi)膜均增厚的研究結(jié)果一致[19]。本研究50例患者中有23例臨床妊娠（妊娠率46%），其中3例雙胎妊娠，余為單胎妊娠。本研究的局限性在于妊娠結(jié)局不理想，可能與移植后子宮內(nèi)膜中植入的MenSCs數(shù)量較少有關(guān)。移植后的干細(xì)胞聚集在受損的子宮內(nèi)膜區(qū)域，自我復(fù)制并分化成為新的細(xì)胞亞群，增加子宮內(nèi)膜腺體的數(shù)量，減少纖維化形成。研究表明，MenSCs在體內(nèi)移植部位并沒有大量的植入或分化，而是通過旁分泌機制增強組織修復(fù)或限制組織破壞[20]?；诖嗽诤罄m(xù)的研究中，可以嘗試聯(lián)合使用細(xì)胞因子，如粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF），通過細(xì)胞因子的促進血管生產(chǎn)、抗細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等作用，增加子宮內(nèi)膜厚度，改善子宮內(nèi)膜容受性。黃偉媚等[20]通過盆底功能障礙治療儀結(jié)合G-CSF宮腔灌注治療60例患者，改善患者子宮內(nèi)膜容受性，增加內(nèi)膜厚度，同時還需區(qū)分非整倍體胚胎引起的妊娠丟失。

IUA的發(fā)生是多因素相互作用的結(jié)果，治療與預(yù)防該病的復(fù)發(fā)仍然是當(dāng)前面臨的一個巨大的醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)，而基于干細(xì)胞治療的再生醫(yī)學(xué)為其創(chuàng)造條件，特別是MenSCs，來源廣泛，其可從女性月經(jīng)血中直接獲取，易于收集、高增殖能力、多向分化潛能、低免疫原性，且不涉及倫理道德問題等優(yōu)點，還可分泌多種抗炎細(xì)胞因子，具有更多的應(yīng)用前景。但是目前干細(xì)胞治療IUA的研究還處在初級階段，研究數(shù)據(jù)有限，對干細(xì)胞治療的安全性及如何提高干細(xì)胞治療技術(shù)中移植細(xì)胞的歸巢率及存活率尚不能明確，需要大樣本的臨床數(shù)據(jù)進一步驗證。相信隨著研究的進一步深入，基于間充質(zhì)干細(xì)胞的子宮內(nèi)膜修復(fù)和治療將會更準(zhǔn)確、有效。

綜上所述，經(jīng)血干細(xì)胞治療IUA的安全性，并且可以促進內(nèi)膜再生，增加IUA不孕患者的懷孕概率。