柴苓舒肝丸藥物代謝動(dòng)力學(xué)及毒理學(xué)的研究

張培會(huì)，湯 曉，朱玉蘋(píng)，杜希揚(yáng)

（臨沂市中醫(yī)醫(yī)院，山東 臨沂 276002）

柴苓舒肝丸（備案號(hào)：魯藥制備字Z20210069000）為我院名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，其由茯苓、柴胡、黨參、黃芪、薏苡仁、郁金、赤芍等19味中藥材制備而成的水丸，用于治療肝郁脾虛、濕毒內(nèi)蘊(yùn)之證。藥物代謝動(dòng)力學(xué)是貫穿藥物發(fā)現(xiàn)、研究、開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用全過(guò)程的重要學(xué)科[1]，研究藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的過(guò)程及其動(dòng)態(tài)變化，并用動(dòng)力學(xué)原理闡明動(dòng)態(tài)變化規(guī)律[2]。毒理學(xué)是一門(mén)研究外源因素（化學(xué)、物理、生物因素）對(duì)生物系統(tǒng)的有害作用的應(yīng)用學(xué)科，其中肝、脾、心、腦等臟器的絕對(duì)重量及臟器系數(shù)作為了解臟器生長(zhǎng)發(fā)育以及病理?yè)p傷情況的指標(biāo)被列為安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)的觀察指標(biāo)[3]。本研究在對(duì)柴苓舒肝丸嚴(yán)格質(zhì)控的基礎(chǔ)上[4]，充分借助于CUMS大鼠模型，對(duì)其藥動(dòng)學(xué)特征和臟器毒性進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)Wistar大鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g。

1.2 儀器

Acquity UPLC（ 美 國(guó)Waters公 司）；TSQ Endura MS（美國(guó)Thermo Fisher公司）；XS205電子天平（METTLER TOLEDO公司）；3K15型高速冷凍離心機(jī)（Sigma 公司）；Z326K型高速冷凍離心機(jī)（Hermle 公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DW-86W100醫(yī)用低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司）。

1.3 動(dòng)物分組和干預(yù)方法

所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組及中藥組，各組15只。對(duì)照組正常飼養(yǎng)，其余各組采用慢性溫和應(yīng)激（CUMS）法制備大鼠抑郁模型，在此基礎(chǔ)上，陽(yáng)性藥組及中藥組分別采用氟西汀和柴苓舒肝丸懸濁液（無(wú)菌蒸餾水配置）灌胃，給藥量為人體8倍量，持續(xù)灌胃6個(gè)月。

CUMS方法：使用7種不可預(yù)知的溫和性刺激（包括夾尾3 min、震蕩30 min、束縛2 h、夜間光照12 h、斷食24 h、斷水24 h 和潮濕墊料24 h）持續(xù)刺激21 d，平均每種刺激使用3次，每日的刺激不應(yīng)在同一時(shí)間段進(jìn)行，避免大鼠產(chǎn)生耐受性，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意保持室內(nèi)整潔、安靜，溫度、濕度適宜，盡量減少空氣流動(dòng)，實(shí)驗(yàn)人員操作力度適當(dāng)，避免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

給藥方法：灌胃，氟西汀和柴苓舒肝丸均以無(wú)菌蒸餾水溶解，制備混懸液，給藥劑量為人體8倍量。每天早上8：00灌胃，每日1次，連續(xù)6個(gè)月。

1.4 藥物代謝動(dòng)力學(xué)

1.4.1 試驗(yàn)過(guò)程 給各組健康SPF級(jí)Wistar大鼠每天早上8：00灌胃，每日1次，連續(xù)6個(gè)月。第1天給藥前和給藥后 0.083 h、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h鎖骨下頸靜脈采集血液，獲得單次給藥的血藥濃度數(shù)據(jù)；第4、5、6天給藥前和給藥后0.5 h采集血液，觀察穩(wěn)態(tài)谷、峰濃度；第7天給藥前和給藥后 0.083 h、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h采集血液，獲得多次給藥的血藥濃度數(shù)據(jù)。采集的血液4 000 rpm離心10 min，分離血漿后，用UPLC-MS/MS法測(cè)定血漿中柴胡皂苷D和黃芪甲苷的含量。

1.4.2 血漿樣品檢測(cè)前的預(yù)處理方法 50 μL含藥血漿樣品，加入5 μL內(nèi)標(biāo)工作液，100 μL甲醇沉淀液，渦旋，9 100 g離心10 min，取上清液100 μL，加入100 μL 80%甲醇水混勻，渦旋，9 100 g離心10 min后，取 120 μL 上清液進(jìn)樣 5 μL。

1.5 毒理檢測(cè)

灌胃時(shí)間6個(gè)月，灌胃結(jié)束時(shí)處死剩余大鼠，解剖主要組織器官（心、肝、脾、肺、腎），精密稱(chēng)量、計(jì)算臟器指數(shù)，同時(shí)HE 染色觀察各組織器官病理改變情況。

2 結(jié)果

2.1 藥物代謝動(dòng)力學(xué)結(jié)果分析

2.1.1 個(gè)體動(dòng)物的平均血藥濃度—時(shí)間數(shù)據(jù) 大鼠單次給藥前的血藥濃度均低于定量下限。灌胃給藥后，柴胡皂苷D和黃芪甲苷的血藥濃度在0.5 h最高。隨著時(shí)間增加，血藥濃度逐漸降低，24 h時(shí)均低于定量下限（見(jiàn)表1）。

表1 大鼠單次灌胃柴苓舒肝丸后的平均血藥濃度—時(shí)間數(shù)據(jù) ng·mL-1

多次給藥期間的谷濃度和第7天給藥前的血藥濃度均低于定量下限，多次給藥期間的峰濃度與單次給藥一致；多次給藥后，血藥濃度趨勢(shì)沒(méi)有明顯的變化（見(jiàn)表2）。

表2 大鼠多次灌胃柴苓舒肝丸水溶后的平均血藥濃度—時(shí)間數(shù)據(jù) ng·mL-1

2.1.2 平均血藥濃度—時(shí)間曲線(xiàn) 大鼠單次灌胃給藥后，柴胡皂苷D和黃芪甲苷的血藥濃度均在0.5 h達(dá)峰，說(shuō)明吸收快，隨后逐漸下降（見(jiàn)圖1）；由半對(duì)數(shù)曲線(xiàn)圖可見(jiàn)，柴胡皂苷D的消除速率比黃芪甲苷快（見(jiàn)圖2）。

圖1 大鼠單次灌胃柴芩舒肝丸后柴胡皂苷D和黃芪甲苷的平均血藥濃度—時(shí)間曲線(xiàn)

圖2 大鼠單次灌胃柴芩舒肝丸后柴胡皂苷D和黃芪甲苷的半對(duì)數(shù)平均血藥濃度—時(shí)間曲線(xiàn)

大鼠多次灌胃給藥后，柴胡皂苷D和黃芪甲苷在第4、5、6天的峰濃度與第1天和第7天接近，無(wú)明顯變化。柴胡皂苷D和黃芪甲苷在第1天和第7天給藥后的消除過(guò)程是一致的，柴胡皂苷D的消除速率比黃芪甲苷快（見(jiàn)圖3、圖4）。

圖3 大鼠多次灌胃柴芩舒肝丸后柴胡皂苷D和黃芪甲苷的平均血藥濃度-時(shí)間曲

圖4 大鼠多次灌胃柴芩舒肝丸后柴胡皂苷D和黃芪甲苷的半對(duì)數(shù)平均血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)

2.1.3 藥代參數(shù)計(jì)算

2.1.3.1 個(gè)體動(dòng)物的平均藥代參數(shù) 大鼠單次和多次灌胃柴芩舒肝丸后，血漿中柴胡皂苷D的平均AUC（0-t）分別為 22.0 μg·L-1·h-1、22.9 μg·L-1·h-1，平均 Cmax分別為 15.9 μg·L-1、16.1 μg·L-1，t1/2分別為2.07 h、2.27 h，表觀分布容積Vd分別為124 L·kg-1、130 L·kg-1；血漿中黃芪甲苷的平均AUC（0-t）分別為49.3 μg·L-1·h-1、48.3 μg·L-1·h-1，平均 Cmax分別為13.5 μg·L-1、14.2 μg·L-1，t1/2分別為 4.04 h、3.61 h，表觀分布容積 Vd分別為 103 μg·L-1、94 L·kg-1（見(jiàn)表3、表4）。這些數(shù)據(jù)表明大鼠單次和多次灌胃柴芩舒肝丸后，柴胡皂苷D具有消除快、分布廣的特點(diǎn)，黃芪甲苷消除較慢、分布廣。

表3 大鼠單次灌胃柴苓舒肝丸后柴胡皂苷D和黃芪甲苷的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表4 大鼠多次灌胃柴苓舒肝丸后柴胡皂苷D和黃芪甲苷的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.1.3.2 多次給藥后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化 大鼠多次灌胃柴苓舒肝丸后，柴胡皂苷D的AUC（0-t）和Cmax分別為單次注射的1.04、1.07倍，無(wú)明顯變化，說(shuō)明連續(xù)給藥7 d大鼠血液中沒(méi)有柴胡皂苷D蓄積。除此之外，t1/2、CL、Vd和MRT（0-t）分別為單次給藥的1.10、0.95、1.05和1.51倍，差異均在2倍以?xún)?nèi)。這些數(shù)據(jù)表明，多次灌胃柴苓舒肝丸，大鼠體內(nèi)沒(méi)有柴胡皂苷D蓄積，與單次給藥相比，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)沒(méi)有發(fā)生顯著改變（見(jiàn)表5）。

表5 大鼠單次和多次灌胃柴苓舒肝丸后柴胡皂苷D的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

大鼠多次灌胃柴苓舒肝丸后，黃芪甲苷的AUC（0-t）和Cmax分別為單次注射的0.98、1.05倍，無(wú)明顯變化，說(shuō)明連續(xù)給藥7 d大鼠血液中沒(méi)有黃芪甲苷蓄積。除此之外，t1/2、CL、Vd和 MRT（0-t）分別為單次給藥的0.89、1.04、0.91和0.95倍，差異均在2倍以?xún)?nèi)。這些數(shù)據(jù)表明，多次灌胃柴苓舒肝丸，大鼠體內(nèi)沒(méi)有黃芪甲苷蓄積，與單次給藥相比，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)沒(méi)有發(fā)生顯著改變（見(jiàn)表6）。

表6 大鼠單次和多次灌胃柴苓舒肝丸后黃芪甲苷的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

2.2 毒理檢測(cè)結(jié)果分析

2.2.1 臟器濕重結(jié)果 灌胃6個(gè)月后各組大鼠解剖取臟器稱(chēng)重。與對(duì)照組相比，模型組平均臟器濕重?zé)o顯著改變（P＞0.05）；同時(shí)各給藥組臟器濕重與模型組相比也無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（見(jiàn)表7）。

表7 柴苓舒肝丸灌胃給藥對(duì)大鼠臟器濕重的影響

2.2.2 臟體系數(shù)結(jié)果 灌胃6個(gè)月后各組大鼠解剖取臟器稱(chēng)重，并計(jì)算臟體系數(shù)。與對(duì)照組相比，模型組平均臟體系數(shù)無(wú)顯著改變（P＞0.05）；各給藥組臟體系數(shù)與模型組相比也無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（見(jiàn)表8）。

表8 柴苓舒肝丸灌胃給藥對(duì)大鼠臟體系數(shù)的影響

2.2.3 HE染色結(jié)果 灌胃6個(gè)月后各組大鼠解剖取臟器進(jìn)行HE染色觀察臟器病理改變。與對(duì)照組相比，模型組臟器形態(tài)無(wú)顯著改變（P＞0.05）；各給藥組臟器形態(tài)與模型組相比也無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（見(jiàn)圖5）。綜上所述，可知柴苓舒肝丸具有低的臟器毒性。

圖5 各組大鼠臟器病理圖

3 討論

中藥藥物代謝動(dòng)力學(xué)是一門(mén)新興學(xué)科，開(kāi)展中藥藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究對(duì)闡明和揭示中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，設(shè)計(jì)及優(yōu)選中藥給藥方案，促進(jìn)中藥新藥研發(fā)、劑型改進(jìn)及質(zhì)量控制，均具有重要意義。柴苓舒肝丸屬于水丸，克服了煎煮湯劑流程不可控、攜帶與服用不方便、口感差等缺點(diǎn)，但目前多數(shù)中藥制劑的質(zhì)量控制研究止步于成品本身的性狀、特征及微生物檢測(cè)等，而在體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及毒理學(xué)分析方面相對(duì)薄弱。因此，本研究在此基礎(chǔ)上，考察了其藥動(dòng)學(xué)特征和臟器毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以其主要成分柴胡皂苷D和黃芪甲苷為代表，柴苓舒肝丸具有吸收快、分布廣的優(yōu)點(diǎn)，且在體內(nèi)沒(méi)有蓄積；通過(guò)臟器濕重、臟體系數(shù)和病理圖結(jié)果可知，柴苓舒肝丸具有低臟器毒性的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)探討柴苓舒肝丸的藥物代謝動(dòng)力學(xué)及毒理學(xué)，為柴苓舒肝丸進(jìn)一步的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。