基于麩米土炒法的山藥不同炮制品物性參數(shù)與化學(xué)成分回歸關(guān)系分析

趙新紅，耿夢(mèng)麗，孫 超，劉振華，肖 旭，陳天朝*

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 承德 067000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450000）

山藥為薯蕷科植物薯蕷Dioscorea oppositaThunb.的干燥根莖，作為藥食同源的產(chǎn)品，食用及藥用歷史悠久[1]。我國(guó)自夏、商時(shí)期起開始種植山藥，明、清以來逐漸將其應(yīng)用為藥材[2]。山藥在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品[3]，其氣微，味淡、微酸，性平，具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精等功效，用于治療脾虛食少、久瀉不止、脾虛喘咳、腎虛遺精、帶下、尿頻、虛熱消渴等癥；麩炒后增加補(bǔ)脾健胃的功效，用于治療脾虛濕少，泄瀉便溏、白帶過多等癥[4]。現(xiàn)代研究表明，山藥的營(yíng)養(yǎng)成分有淀粉、黏蛋白、氨基酸等，活性成分包括多糖、尿囊素、皂苷、酚類等[5]，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)機(jī)體免疫等諸多藥理作用[6]。

山藥炮制技術(shù)首見于唐代《食醫(yī)心鑒》“刮去皮”“拍令碎用”[7]，以凈制、切制為主，采取熱處理的炮制方法也始于唐代，如《食療本草》中便有“熟者和蜜”的記載，炒制作為最常用的炮制方法，自唐代以后沿用至今[8]，2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）收載了山藥生品和麩炒兩個(gè)品種[4]。此外，在全國(guó)各地炮制規(guī)范的記載中，還有米炒、土炒、蜜麩炒、清炒等炮制工藝制成的炮制品[9]。在課題組前期研究中，初步探討了山藥炒黃、炒焦、炒炭三種不同炮制品的物性參數(shù)與化學(xué)成分之間的相關(guān)性[10]，建立了山藥炒黃、炒焦、炒炭三種炮制品的標(biāo)準(zhǔn)湯劑、丸劑兩種劑型的物性參數(shù)與化學(xué)成分之間定量關(guān)系模型[11-13]，本研究通過制備麩米土炒山藥不同炮制品，德爾菲評(píng)價(jià)優(yōu)選出得分最高者，通過測(cè)定相對(duì)密度等物性參數(shù)，以及淀粉、多糖、尿囊素等指標(biāo)成分含量，從物性參數(shù)、大分子、小分子三個(gè)方面出發(fā)，探究物性參數(shù)與化學(xué)成分之間的回歸關(guān)系，以及兩者之間的相關(guān)性，以期多層次、多角度、全方位探討麩米土炒法對(duì)山藥炮制品質(zhì)量的影響，為中藥炮制品質(zhì)量評(píng)價(jià)研究提供一定的參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；Thermo Evolution 201 型紫外-可見分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛有限公司）；CY-25 型中藥炒藥機(jī)（溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司）；pHSJ-3F 型數(shù)字酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

山藥（批號(hào)：196051，安徽普仁中藥飲片有限公司），經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳天朝主任藥師鑒定為2020 年版《中國(guó)藥典》收載品種；尿囊素（批號(hào)：111501-200202，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；D（+）-無水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：S08J6G）、直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：J11D8N50350）、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：K01DY49573）購(gòu)自于上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥ 98%。甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 山藥不同炮制品的制備與優(yōu)選

結(jié)合前期研究結(jié)果[14]，以輔料種類、炮制溫度、炮制時(shí)間、輔料用量作為考察因素，進(jìn)行均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)，平行炮制3 批樣品。在《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》和2020 年版《中國(guó)藥典》對(duì)山藥飲片規(guī)格分類的基礎(chǔ)上，邀請(qǐng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳天朝主任藥師、王宏賢副主任藥師、沈啟良副主任藥師、施鈞瀚副主任藥師四位河南省中藥炮制專家對(duì)山藥炮制品質(zhì)量等級(jí)進(jìn)行德爾菲評(píng)價(jià)。首先，通過專家咨詢方法，篩選出對(duì)山藥炮制品感官評(píng)價(jià)特征具有重要意義的9 項(xiàng)二級(jí)指標(biāo)，再歸納總結(jié)為形狀、顏色、質(zhì)地、氣、味5 項(xiàng)一級(jí)指標(biāo)，依據(jù)很重要（1.0）、較重要（0.8）、一般重要（0.6）、較不重要（0.4）、很不重要（0.2）5 級(jí)分類進(jìn)行重要性評(píng)分[15]，最終制定山藥不同炮制品評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

將山藥不同炮制品均勻擺放在光照強(qiáng)度為250 lx的同一區(qū)域，根據(jù)山藥不同炮制品評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，從形狀、顏色、質(zhì)地、氣、味五個(gè)方面進(jìn)行“盲法”評(píng)價(jià)和集中會(huì)評(píng)，最終優(yōu)選出得分最高的炮制品（S2、S6、S11）進(jìn)行物性參數(shù)與化學(xué)成分含量測(cè)定，見表2。

2.2 山藥飲片物性參數(shù)測(cè)定

2.2.1 相對(duì)密度 稱取山藥飲片5.0 g（M），置于盛有50 mL 輕質(zhì)液狀石蠟的量筒中，靜置5 min，待凹液面穩(wěn)定后，記錄體積V（mL），由ρ相對(duì)（g/mL）=M/（V-50），計(jì)算相對(duì)密度。

2.2.2 氧化值 稱取山藥飲片5.0 g，參考文獻(xiàn)[16]中的方法，測(cè)定氧化值。

2.2.3 吸水率 稱取山藥飲片4.0 g（M），置于盛有80 mL 蒸餾水量筒中，記錄初始體積（V0），密封量筒，分別于5、10、20、40、60、120、240、480、960、1 440 min 后記錄量筒刻度值（Vt），當(dāng)Vt值不再增加時(shí)記為吸水飽和體積（V飽和），對(duì)應(yīng)的時(shí)間為吸水飽和時(shí)間（t飽和），由吸水率（mL/g）=（V0-V飽和）/M，計(jì)算吸水率。

2.2.4 pH值 稱取山藥飲片5.0 g，置于盛有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，按“2.2.3”項(xiàng)下確定的吸水飽和時(shí)間（t飽和）進(jìn)行浸泡，濾過，測(cè)定濾液pH 值。

2.2.5 蒸餾液pH 值 取“2.2.2”項(xiàng)下的山藥飲片的蒸餾液，測(cè)定pH 值。

2.2.6 色度 取大小、顏色均勻的山藥飲片，參考文獻(xiàn)[17-18]中的方法，測(cè)定色度。

2.2.7 物性參數(shù)測(cè)定結(jié)果 根據(jù)“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行山藥飲片物性參數(shù)測(cè)定，平行測(cè)3 次，取平均值。由于測(cè)定結(jié)果中最小值為土炒法吸水率0.18 mL/g，最大值為麩炒法色度35.68，后者是前者的198 倍，為實(shí)現(xiàn)所有測(cè)定結(jié)果體現(xiàn)在同一坐標(biāo)軸上，以便于物性參數(shù)直觀比較，在GraphPad 9.0 軟件繪制物性參數(shù)柱狀圖時(shí)，選擇縱坐標(biāo)軸刻度以非線性的對(duì)數(shù)形式呈現(xiàn)，見圖1。由結(jié)果可知，與山藥生品相比，經(jīng)過麩米土炒后氧化值、蒸餾液pH 值、色度呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，相對(duì)密度、吸水率、pH 值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖1 山藥飲片物性參數(shù)測(cè)定結(jié)果（n = 3）Fig. 1 The determination results of physical parameters in Chinese yam decoction pieces（n = 3）

以6 種物性參數(shù)測(cè)定結(jié)果為研究對(duì)象，應(yīng)用SPSS 26.0 軟件中的系統(tǒng)聚類分析，采用Ward 聚類方法，以歐氏距離為測(cè)量準(zhǔn)則，繪制系統(tǒng)聚類分析譜系圖，見圖2。以歐式距離6.0 為閾值，將6 種物性參數(shù)聚為3 類。類1：pH 值、蒸餾液pH 值、氧化值；類2：相對(duì)密度、吸水率；類3：色度。

圖2 山藥飲片物性參數(shù)系統(tǒng)聚類分析Fig. 2 The cluster analysis of physical parameters in Chinese yam decoction pieces

2.3 山藥飲片中總淀粉與多糖含量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[10]中的方法，采用雙波長(zhǎng)法測(cè)定山藥不同炮制品中直鏈淀粉、支鏈淀粉含量，兩者之和為總淀粉含量，苯酚-硫酸顯色法測(cè)定多糖含量。

2.3.1 直鏈淀粉、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 直鏈淀粉以599 nm、467 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y= 0.004 9X- 0.002 9（R2= 0.999 6），表明在40.00 ～ 180.00 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；支鏈淀粉以535 nm、709 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y= 0.003 1X- 0.002 2 （R2= 0.999 7），表明在20.00 ～ 240.00 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 以490 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y= 11.02X- 0.070 2，（R2= 0.998 4），表明在0.011 4 ～ 0.057 1 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 方法學(xué)考察 平行取山藥飲片6 份，精密稱定，進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率試驗(yàn)，結(jié)果精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD 值均小于2%；直鏈淀粉平均加樣回收率為100.46%，RSD 值為1.37%，支鏈淀粉平均加樣回收率為101.24%，RSD 值為1.33%，多糖平均加樣回收率為100.86%，RSD 值為1.79%。結(jié)果表明該試驗(yàn)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及準(zhǔn)確度良好。

2.3.4 供試品溶液中總淀粉與多糖含量測(cè)定 平行取山藥飲片3 份，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法分別測(cè)定直鏈淀粉與支鏈淀粉含量（兩者之和為總淀粉）、多糖含量，結(jié)果見表3。

2.4 山藥飲片中尿囊素含量測(cè)定

2.4.1 色 譜 條 件 Agilent C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 - 水（5 ∶95），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為224 nm，進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為30 ℃。對(duì)照品及供試品HPLC色譜圖，見圖3。

圖3 山藥炮制品高效液相色譜圖Fig. 3 High performance liquid chromatography of Chinese yam processed product

2.4.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取尿囊素對(duì)照品25.45 mg，置于5 mL 容量瓶中，加50%甲醇溶解定容，制成質(zhì)量濃度為5.09 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液制備 稱取山藥飲片細(xì)粉1.0 g，精密稱定，置于100 mL 容量瓶中，加50%甲醇25 mL，稱重，超聲處理30 min，冷卻后稱重，補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，得供試品溶液。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液適量，加50%甲醇稀釋成一系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，精密吸取5 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積Y與尿囊素質(zhì)量濃度X（mg/mL）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y= 284.12X+ 1.51（R2= 0.999 9），表明尿囊素在0.169 7 ～ 1.018 0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的尿囊素峰面積RSD 值均小于2%。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取山藥生品細(xì)粉6 份，每份稱取0.5 g，精密稱定，精密加入一定量的尿囊素對(duì)照品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算平均加樣回收率為99.25%，RSD 為1.93%。

2.4.7 含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液5 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)線性方程計(jì)算各樣品溶液中尿囊素含量，見表3。

2.5 山藥不同炮制品化學(xué)成分分析

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析。山藥不同炮制品化學(xué)成分分析見表3。結(jié)果顯示，與生品相比，山藥經(jīng)麩米土炒后總淀粉、尿囊素含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，多糖含量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)（P＜ 0.05）。

表3 山藥不同炮制品中化學(xué)成分比較（±s ，n = 3）Tab. 3 The analysis of variance and pairwise comparison of chemical components in Chinese yam processed products（±s ，n = 3）

表3 山藥不同炮制品中化學(xué)成分比較（±s ，n = 3）Tab. 3 The analysis of variance and pairwise comparison of chemical components in Chinese yam processed products（±s ，n = 3）

注：同列字母完全不同，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

指標(biāo) 總淀粉/% 多糖/（mg/g） 尿囊素/（mg/g）生品 74.43 ± 2.901a 13.08 ± 0.714a 1.24 ± 0.091a米炒 56.87 ± 2.738b 20.98 ± 1.222b 0.57 ± 0.050b土炒 22.52 ± 3.215c 17.65 ± 1.462c 0.90 ± 0.054c麩炒 33.61 ± 2.421d 15.16 ± 0.964d 0.54 ± 0.058db F 270.383 36.502 100.850 P 0.000 0.000 0.000

2.6 物性參數(shù)與化學(xué)成分回歸關(guān)系分析

選擇SPSS 26.0 軟件中的多元逐步回歸方法，在物性參數(shù)與化學(xué)成分之間建立線性回歸模型，GraphPad 9.0 軟件繪制線性關(guān)系圖，見表4、圖4。

表4 山藥物性參數(shù)與化學(xué)成分之間線性回歸模型Tab. 4 The linear regression model between physical parameters and chemical components in Chinese yam

圖4 山藥物性參數(shù)與化學(xué)成分之間的線性關(guān)系圖Fig. 4 The linear diagraml between physical parameters and chemical components in Chinese yam

由結(jié)果可知，吸水率與總淀粉含量存在顯著正相關(guān)（b= 688.32，t= 9.91，P＜ 0.001），相對(duì)密度與多糖含量存在顯著負(fù)相關(guān)（b= -150.87，t= -11.10，P＜0.001），氧化值與尿囊素含量存在顯著負(fù)相關(guān)（b=-0.07，t= -10.08，P＜ 0.001）。

3 討論

傳統(tǒng)的中藥飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)主要是通過眼觀、口嘗、鼻聞、手握、水試、火試等方法，對(duì)飲片的形狀、顏色、大小、斷面、氣、味、質(zhì)地等多方位判斷[19]，具有評(píng)價(jià)速度快、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，但存在評(píng)價(jià)指標(biāo)界限不明確、主觀性強(qiáng)、缺乏量化、易受環(huán)境和評(píng)價(jià)者經(jīng)驗(yàn)影響等不足[20]。由于吸水率可以指征中藥飲片的“形”，相對(duì)密度是飲片的固有屬性，可以指征“質(zhì)”，氧化值、pH 值、蒸餾液pH 值可以表征藥物的氣、味，色度表征藥物的色。因此，本研究以“形”“色”“氣”“味”“質(zhì)”五方面為切入點(diǎn)，選擇吸水率、色度、氧化值、pH 值、蒸餾液pH 值、相對(duì)密度等可量化的物性參數(shù)指標(biāo)，對(duì)山藥不同炮制品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，系統(tǒng)聚類分析將指征形、質(zhì)的物性參數(shù)（吸水率、相對(duì)密度）歸為一類，氣、味（pH 值、蒸餾液pH 值、氧化值）與色（色度）的物性參數(shù)單獨(dú)分開為兩類，進(jìn)一步證明所選物性參數(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)山藥不同炮制品的形、色、氣、味、質(zhì)進(jìn)行數(shù)字化度量。在一定程度上，為中藥炮制品質(zhì)量評(píng)價(jià)從主觀經(jīng)驗(yàn)轉(zhuǎn)向客觀量化提供參考依據(jù)。

山藥在麩米土炒過程中，往往會(huì)發(fā)生飲片的形態(tài)、質(zhì)地、氣味、色澤等外觀特征的改變。首先，由于溫度的參與和水分的散失，不僅使山藥炮制品質(zhì)地變硬阻止水分進(jìn)入、外表色黃美觀[21]，還會(huì)使分子內(nèi)出現(xiàn)氫鍵斷裂，游離出更多的氫離子[22]，從而引起相對(duì)密度、吸水率、pH 值下降；再者，經(jīng)麩米土炒后的山藥炮制品會(huì)形成更多的空腔，往往會(huì)促進(jìn)揮發(fā)性成分的溶出，以及炮制過程中分子內(nèi)部發(fā)生化學(xué)鍵斷裂與重組，通過發(fā)生氧化、還原等化學(xué)反應(yīng)，引起大分子的分解與小分子的隨機(jī)結(jié)合與轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的自由基增加，抗氧化程度增強(qiáng)，從而引起三種炮制品的氧化值均高于生品。在山藥麩米土炒過程中，隨著時(shí)間的推移山藥顏色逐漸由白色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S白色或淡黃色，以及水分的揮發(fā)、美拉德反應(yīng)、新物質(zhì)的產(chǎn)生[10]，會(huì)影響飲片的色度；另外，麩炒法的炮制溫度最高（185℃），炮制時(shí)間最長(zhǎng)（16 min），再加上麥麩煙氣熏制作用，會(huì)進(jìn)一步增加飲片的色度[23]。因此，山藥炮制品的色度高于生品，麩炒的色度最高。

山藥在麩米土炒過程中，除了發(fā)生外觀特征的改變，往往也會(huì)伴隨著化學(xué)成分的變化。由于山藥中含有大量淀粉，其中鮮山藥中淀粉含量為6% ～ 30%，干山藥可達(dá)59% ～ 93%[24]，在麩米土炒過程中，隨著炮制程度的加深，淀粉分子內(nèi)部發(fā)生α-糖苷鍵的斷裂，產(chǎn)生的小分子糖類成分會(huì)重新組合成多糖分子。因此，山藥炮制品中淀粉的含量呈下降趨勢(shì)，多糖含量呈增加趨勢(shì)。尿囊素作為山藥的主要活性成分之一，在80 ～ 90℃下加熱30 min 無變化，但經(jīng)不起高溫（高于100℃）和長(zhǎng)時(shí)間日光暴曬[25]。因此，在炮制溫度（155℃、185℃）高于100℃的情況下進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間（12 min、16 min）的加熱處理，尿囊素會(huì)受熱分解或與其它成分發(fā)生反應(yīng)，從而引起三種炮制品的尿囊素含量下降，與生品相比存在明顯差異（P＜0.05）。同時(shí)，在相同炮制溫度或時(shí)間下，隨著炮制時(shí)間或溫度的增加，出現(xiàn)尿囊素下降趨勢(shì)，如米炒法（185℃、12 min）尿囊素含量高于麩炒法（185℃、16 min），土炒法（155℃、16 min）尿素囊含量高于麩炒法（185℃、16 min），尿囊素含量下降是否與炮制輔料的種類、用量有關(guān)，有待于后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究依托德爾菲評(píng)價(jià)，從三種不同炮制工藝中優(yōu)選出得分最高的山藥炮制品，通過測(cè)定生品與炮制品的物性參數(shù)，以及總淀粉、多糖、尿囊素等化學(xué)成分含量，比較炮制前后的物性參數(shù)與化學(xué)成分變化，并在兩者之間建立線性回歸模型，揭示了物性參數(shù)與化學(xué)成分之間的變化規(guī)律，實(shí)現(xiàn)了從物性參數(shù)、大分子、小分子三個(gè)方面出發(fā)，對(duì)山藥炮制品質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)科學(xué)評(píng)價(jià)，為相關(guān)研究提供參考。在此基礎(chǔ)上，下一步可以擴(kuò)大研究對(duì)象，通過收集不同產(chǎn)地與炮制工藝的山藥飲片，增加物性參數(shù)、化學(xué)成分檢測(cè)指標(biāo)的數(shù)量，隨著樣本量的增加，可以將研究結(jié)果劃分成訓(xùn)練集和驗(yàn)證集兩部分，通過訓(xùn)練集建立定量關(guān)系模型，驗(yàn)證集對(duì)建立模型進(jìn)一步驗(yàn)證，以提高研究結(jié)果的準(zhǔn)確度與可信度，最終實(shí)現(xiàn)依據(jù)物性參數(shù)對(duì)山藥炮制品質(zhì)量進(jìn)行客觀、科學(xué)的評(píng)價(jià)。