經(jīng)典名方當(dāng)歸建中湯HPLC 指紋圖譜及含量測定方法研究

張瑞彤，王 瑩，熊 輝，孫 暉，張喜武，王喜軍

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，教育部經(jīng)典名方有效性評價及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)工程研究中心，國家中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040）

當(dāng)歸建中湯（DJD）源自唐代孫思邈《千金翼方》[1]，列入國家頒布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》[2]。DJD 由當(dāng)歸、白芍、桂枝、炙甘草、大棗、生姜配伍而成，君藥當(dāng)歸有補血活血之效，桂枝、白芍共作輔藥，前者辛溫益氣，后者滋養(yǎng)陰血，炙甘草補中扶虛，既可助長補益脾胃之氣，又可解白芍寒涼，緩解急性疼痛，大棗和生姜可溫中補脾[3]，諸藥合用，共同發(fā)揮養(yǎng)血復(fù)脈、溫經(jīng)散寒的功效[4-6]。現(xiàn)代臨床應(yīng)用DJD 辨證施治，對原發(fā)性痛經(jīng)、產(chǎn)后腹痛、胃潰瘍等均有確切療效。

基準(zhǔn)樣品承載了古代經(jīng)典名方的有效性、安全性，質(zhì)量研究成為古代經(jīng)典名方復(fù)方制劑開發(fā)的重要內(nèi)容和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而指紋圖譜和含量測定是控制基準(zhǔn)樣品質(zhì)量的主要方法。中藥化學(xué)指紋圖譜利用色譜、波譜等現(xiàn)代分析技術(shù)對中藥化學(xué)成分進(jìn)行整體表征，綜合評價中藥整體質(zhì)量，有效保障了中藥質(zhì)量的穩(wěn)定性。同時，篩選與經(jīng)典名方有效性、安全性相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)志物，建立含量測定方法，可定量表征基準(zhǔn)樣品質(zhì)量。課題組前期利用中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)[7-8]明確了DJD 的效應(yīng)關(guān)聯(lián)成分，主要為阿魏酸、芍藥苷、肉桂酸、甘草苷等[9]。本研究在此基礎(chǔ)上，利用HPLC 法建立DJD 基準(zhǔn)樣品的指紋圖譜分析方法以及相關(guān)指標(biāo)成分的含量測定方法，為古代經(jīng)典名方DJD 復(fù)方制劑的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

2010-AHT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；2996 型紫外檢測器（美國Waters 公司）；CP225D 型電子天平（德國賽多利斯公司）；ModulyoD-230 型真空冷凍干燥機（美國Thermo Savant 公司）；Sorvall ST 16R 型冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；RODI-220A1 型水純化系統(tǒng)（廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥

對照品阿魏酸（批號：110773-201614，純度：99.0%）、芍藥苷（批號：110736-201842，純度：96.8%）、甘草苷（批號：111610-201607，純度：93.1%）、肉桂酸（批號：110786-201604，純度：98.8%）、桂皮醛（批號：110710-201821，純度：99.6%）均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈（色譜級，美國DIKMA 公司）；磷酸（色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙醇（分析級，西隴化工股份有限公司）；超純水（實驗室自制）。

DJD 中6 味飲片各收集15 個批次（由哈爾濱中藥四廠有限公司提供），產(chǎn)地包含道地藥材產(chǎn)地及主產(chǎn)區(qū)，見表1。經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)吳修紅教授鑒定，各飲片均符合2020 年版《中國藥典》[10]規(guī)定。

表1 15 批DJD 基準(zhǔn)樣品飲片信息Tab. 1 15 batches of DJD reference samples decoction pieces information

2 方法與結(jié)果

2.1 DJD 基準(zhǔn)樣品的制備

《千金翼方》原文記載DJD 制法為“當(dāng)歸四兩，桂心三兩，甘草炙二兩，芍藥六兩，生姜三兩，大棗十二枚，擘。上六味，咀，以水一斗，煮取三升，分為三服，一日令盡”。根據(jù)古籍考證及現(xiàn)代文獻(xiàn)[11-12]，1 兩折合現(xiàn)代約13.8 g，1 升折合現(xiàn)代200 mL，1 斗為10 升，折合現(xiàn)代2 000 mL，確定DJD 基準(zhǔn)樣品的制備方法為：取當(dāng)歸55.2 g、白芍82.8 g、大棗55.2 g、生姜41.4 g、桂枝41.4 g 和炙甘草27.6 g，置于鍋內(nèi)加水2 000 mL，浸泡至透心后，調(diào)大火煎沸，而后轉(zhuǎn)小火維持微沸狀態(tài)，直至藥液剩余約600 mL，將藥液趁熱濾過，濾液凍干，得到蜂窩鱗片狀粉末，即為DJD 基準(zhǔn)樣品。將收集到的各批次飲片隨機組合，制備成15 批DJD 基準(zhǔn)樣品，見表2。

表2 15 批DJD 基準(zhǔn)樣品飲片批號Tab. 2 15 batches of DJD reference samples decoction pieces batch number

2.2 指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件 Phenomenex Luna Omega Polar C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），洗脫梯度見表3，流速為1.0 mL/min；波長為220 nm；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為35 ℃。

表3 DJD 基準(zhǔn)樣品指紋圖譜洗脫梯度Tab. 3 DJD material reference corresponds to the elution gradient of fingerprint

2.2.2 供試品溶液制備 取DJD 基準(zhǔn)樣品約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10 mL 甲醇，稱重，超聲90 min（功率：250 W，頻率：40 kHz），放至室溫再稱重，補足失重，混勻，離心，取上清液，即得。

2.2.3 精密度試驗 取DJD 基準(zhǔn)樣品，按“2.2.2”項下方法制備DJD 供試品溶液，在“2.2.1”色譜條件下進(jìn)樣，連續(xù)測定6 次，選擇芍藥苷作為參照峰，結(jié)果各峰的相對保留時間RSD 均小于1%，相對峰面積RSD 均小于3%，表明該儀器的精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗 取DJD基準(zhǔn)樣品，按照“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1”色譜條件下進(jìn)樣，選擇芍藥苷作為參照峰。結(jié)果指紋圖譜中的共有峰相對峰面積RSD 值均小于4%，相對保留時間RSD 值均小于3%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取DJD 基準(zhǔn)樣品，按“2.2.2”項下方法制備DJD 供試品溶液，分別于制備后0、3、6、9、12、18、24 h 在“2.2.1”色譜條件下進(jìn)樣，選擇芍藥苷作為參照峰。指紋圖譜共有峰在24 h 內(nèi)的相對保留時間RSD 值小于3%、相對峰面積RSD 值小于3%，表明24 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.6 指紋圖譜的建立 取15 批基準(zhǔn)樣品，制備供試品溶液，按“2.2.1”項下條件測定。將15 批DJD 基準(zhǔn)樣品指紋圖譜輸入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723 版）”，進(jìn)行多點校正和匹配，得出DJD 基準(zhǔn)樣品中藥指紋圖譜的共有模式（R），見圖1，明確共有峰并記錄峰面積，計算相似度，結(jié)果見表4。

表4 15 批DJD 基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的相似度評價結(jié)果Tab. 4 The similarity evaluation results of the fingerprints of 15 batches of DJD benchmark samples

圖1 DJD 基準(zhǔn)樣品HPLC 指紋圖譜共有模式Fig. 1 The common pattern of HPLC fingerprints of DJD samples

2.2.7 主要共有峰的歸屬及相似度評價 分別制備DJD 基準(zhǔn)樣品、各個單味藥飲片水煎液凍干粉及各個缺味方水煎液凍干粉的供試品溶液，分別采集指紋圖譜（見圖2、3）。將DJD 基準(zhǔn)樣品色譜圖中各共有峰與飲片、缺味方的色譜峰進(jìn)行比對，確定各共有峰的來源。結(jié)果在DJD 指紋圖譜中3、11 和25 號峰源自當(dāng)歸，2、7、8、9、12、16、17、20 和22 號峰源自白芍，4、6、15、16、19、24 和27 號峰源自炙甘草，14 和18 號峰源自桂枝，26 號峰源自生姜，以上色譜峰具有較好的專屬性，可作為特征峰；1 號峰由當(dāng)歸、白芍和炙甘草共同產(chǎn)生，5 號峰由桂枝和白芍共同產(chǎn)生，23 號峰由當(dāng)歸和炙甘草共同產(chǎn)生，10 號峰由白芍和大棗共同產(chǎn)生，13、21 號峰由桂枝和炙甘草共同產(chǎn)生，28 號峰為流動相干擾峰。各藥味產(chǎn)地隨機組合的15 批DJD 基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的相似度均大于0.9，表明優(yōu)質(zhì)藥材制備的基準(zhǔn)樣品質(zhì)量穩(wěn)定、均一。

圖2 DJD 基準(zhǔn)樣品與各單味藥樣品對照結(jié)果Fig. 2 Comparison of sample of DJD and single-flavor medicine sample

圖3 DJD 基準(zhǔn)樣品與陰性樣品對照結(jié)果Fig. 3 Comparison of sample and negative sample of DJD

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 （1）阿魏酸 Diamonsil Spursil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.02%磷酸溶液（23 ∶77）為流動相，流速為1 mL/min，等度洗脫；檢測波長為324 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

（2）芍藥苷 Diamonsil Spursil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.02%磷酸溶液（14 ∶86）為流動相，流速為1 mL/min，等度洗脫；檢測波長為235 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

（3）甘草苷 Diamonsil Spursil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%磷酸溶液（15 ∶85）為流動相，流速為1 mL/min，等度洗脫；檢測波長為276 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

（4）肉桂酸和桂皮醛 Diamonsil Spursil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.05%磷酸溶液（31 ∶69）為流動相，流速為1 mL/min，等度洗脫；檢測波長為280 nm（肉桂酸）、290 nm（桂皮醛）；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

2.3.2 供試品溶液制備 阿魏酸：取DJD 基準(zhǔn)樣品約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱重，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷至室溫，再次稱重，補足失重，混勻，離心，取上清液，即得供試品溶液Ⅰ；芍藥苷：取DJD 基準(zhǔn)樣品約0.1 g，精密稱定，同供試品溶液Ⅰ方法制得供試品溶液Ⅱ；甘草苷：取DJD 基準(zhǔn)樣品約0.4 g，精密稱定，同供試品溶液Ⅰ方法制得供試品溶液Ⅲ；肉桂酸和桂皮醛：取DJD 基準(zhǔn)樣品約0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL75%乙醇，稱重，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷至室溫，再次稱重，補足失重，混勻，離心，取上清液，即得供試品溶液Ⅳ。

陰性樣品溶液制備：按“2.1”項下DJD 基準(zhǔn)樣品制備方法，分別制備缺當(dāng)歸、缺白芍、缺炙甘草、缺桂枝的陰性基準(zhǔn)樣品，并按照供試品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的制備方法分別制備各陰性樣品溶液。

2.3.3 對照品溶液制備 取阿魏酸、芍藥苷、甘草苷對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每l mL 含阿魏酸45.09 μg、芍藥苷298.72 μg、甘草苷77.00 μg 的溶液；取肉桂酸、桂皮醛對照品適量，精密稱定，加75%乙醇制成每1 mL 含肉桂酸21.09 μg、桂皮醛17.02 μg 的混合對照品溶液，即得。

2.3.4 專屬性試驗 精密吸取各指標(biāo)成分的對照品溶液、供試品溶液及其陰性樣品溶液，設(shè)置相應(yīng)的色譜參數(shù)，測定并記錄色譜圖，結(jié)果表明陰性對照無干擾，專屬性強。

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密移取各對照品儲備液適量，分別按照線性濃度稀釋，依次進(jìn)樣，設(shè)置相應(yīng)的色譜參數(shù)測定。以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），建立回歸方程。結(jié)果表明，阿魏酸、芍藥苷、甘草苷、肉桂酸和桂皮醛在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表5。

2.3.6 精密度試驗 取“2.3.3”項下各對照品溶液，設(shè)置相應(yīng)的色譜參數(shù)，同一對照品溶液連續(xù)測定5 次，阿魏酸、芍藥苷、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛峰面積的RSD 見表5，表明該儀器精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗 取DJD 基準(zhǔn)樣品，制備“2.3.2”項下供試品溶液6 份，設(shè)置相應(yīng)的色譜參數(shù)，分別進(jìn)樣，阿魏酸、芍藥苷、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛含量的RSD 見表5，說明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取DJD 基準(zhǔn)樣品，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，于制備后的第0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣，設(shè)置相應(yīng)的色譜參數(shù)并進(jìn)樣測定，阿魏酸、芍藥苷、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛峰面積的RSD 見表5，表明各供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 按“2.3.2”項下方法取已知含量的DJD 基準(zhǔn)樣品，分別按待測成分含量與對照品加入量1 ∶0.5、1 ∶1、1 ∶1.5 的比例加入對照品，再同“2.3.2”項下方法制得供試品溶液，分別進(jìn)樣，計算加樣回收率，結(jié)果見表5。

表5 DJD 中指標(biāo)成分含量測定方法學(xué)考察Tab. 5 Methodological study on the determination of index components in reference samples of DJD

2.3.10 樣品的含量測定 取15 批DJD 基準(zhǔn)樣品，制備供試品溶液，測定各成分色譜峰面積，計算阿魏酸、芍藥苷、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛的含量，見表6。

表6 15 批DJD 基準(zhǔn)樣品含量測定結(jié)果（%，n = 2）Tab. 6 Content determination results of 15 batches of DJD reference samples （%，n = 2）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

本研究前期利用中醫(yī)方證代謝組學(xué)方法從DJD入血的化學(xué)成分中選定藥效相關(guān)成分，再結(jié)合成分的生物活性研究報道確定了指標(biāo)成分。當(dāng)歸為DJD 中的君藥，而阿魏酸是當(dāng)歸重要藥效成分，其具有鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化、抗炎、抗血栓等作用[13-14]，與DJD主治病癥完全吻合；芍藥苷是臣藥白芍發(fā)揮藥效的重要成分之一，眾多研究表明芍藥苷具有鎮(zhèn)痛抗炎[15]、保肝[16]、抗心腦血管疾病[17]等生物活性，推測芍藥苷是DJD 加減湯治療慢性低血壓的關(guān)鍵成分之一；桂皮醛和肉桂酸作為桂枝的活性成分，桂皮醛在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化成肉桂酸[18]，共同發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等療效[19]；炙甘草中黃酮類活性成分甘草苷具有抗炎、解毒、抗氧化等多種藥理活性[20]。DJD 中的藥效成分均與其治療產(chǎn)后腹痛、痛經(jīng)、胃潰瘍等極度相關(guān)，各個藥味的組方配伍，充分體現(xiàn)了DJD 有效成分的協(xié)同作用機制。因此，選擇阿魏酸、芍藥苷、肉桂酸、桂皮醛、甘草苷作為DJD 指標(biāo)成分。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

3.2.1 流動相考察 指紋圖譜設(shè)計中分別對水-乙腈、0.05%磷酸水-乙腈、0.1%磷酸水-乙腈、0.2%磷酸水-乙腈進(jìn)行考察，結(jié)果表明0.1%磷酸水-乙腈作為流動相時出峰較多，分離效果最佳。

各指標(biāo)成分含量測定參考2020年版《中國藥典》，分別考察了0.02%、0.05%、0.1%磷酸水-乙腈，結(jié)果肉桂酸和桂皮醛色譜峰在0.05%磷酸水-乙腈作為流動相時分離效果較好，甘草苷色譜峰在0.1%磷酸水-乙腈作為流動相時能獲得良好的分離度，而不同濃度的酸均能使芍藥苷、阿魏酸色譜峰獲得較好的分離，選擇最小磷酸濃度組成流動相。

3.2.2 波長的選擇 鑒于中藥復(fù)方的復(fù)雜性和整體性，DJD 基準(zhǔn)樣品HPLC 指紋圖譜的檢測波長應(yīng)選擇能獲得較多指紋峰且各峰強度均適中的波長，故從190 ～ 400 nm 范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)檢測波長為220 nm 時能獲得的峰最多，峰強度均適中，且包含方中全部藥味，故采用220 nm 作為檢測波長。

為確定實際含量測定時各組分的檢測波長，利用光電二極管陣列檢測器測定200 ～ 400 nm 范圍內(nèi)的紫外吸收光譜圖，結(jié)果顯示，阿魏酸、芍藥苷、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛分別在324 nm、235 nm、276 nm、280 nm、290 nm 波長處出現(xiàn)最大吸收峰。

3.2.3 柱溫考察 本實驗考察了DJD 指紋圖譜在柱溫為25、30、35、40 ℃時的出峰情況，結(jié)果表明指紋圖譜在35 ℃柱溫時各峰能獲得較好的分離。各成分的含量測定分別考察了25、30、35 ℃的柱溫，并且均在30 ℃柱溫時能獲得較適宜的保留時間和分離度，因此指紋圖譜選定柱溫為35 ℃、各指標(biāo)成分的含量測定柱溫選定為30 ℃。

4 結(jié)論

本研究建立了DJD 基準(zhǔn)樣品化學(xué)成分指紋圖譜分析方法，并開展了效應(yīng)關(guān)聯(lián)成分的含量測定，建立的方法準(zhǔn)確、簡便、可靠，是 DJD 基準(zhǔn)樣品質(zhì)量控制的有效方法，為經(jīng)典名方DJD 現(xiàn)代顆粒劑的研究及質(zhì)量控制提供參考。