黃芪總皂苷通過激活Nrf2/HO-1 信號通路緩解L-精氨酸誘導的小鼠急性胰腺炎氧化損傷的研究

王 欣，周文勇，孫 月

（1. 滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 普外科，河北 滄州 061000； 2. 滄州市中心醫(yī)院 肝膽外科，河北 滄州061000；3. 滄州市人民醫(yī)院 普外科，河北 滄州 061000）

急性胰腺炎（Acute pancreatitis, AP）是常見消化系統(tǒng)急腹癥疾病之一，臨床癥狀多為劇烈腹脹腹痛、惡心、嘔吐、發(fā)熱等，嚴重者伴有胰腺出血、感染、壞死或休克等并發(fā)癥，其發(fā)病率逐年升高，病死率更是高達20%[1]。但因AP 發(fā)病機理和病理學尚不明確，所以臨床缺乏有效治療方案，多以開腹手術(shù)治療為主。研究表明，氧化應激反應在AP 發(fā)病機制中起重要作用，抗氧化反應和清除自由基也成為研究臨床治療AP 的重點[2]。黃芪是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，具有益氣補中、升陽固表、利尿生肌等功效，中醫(yī)臨床多用于治療氣血不足、中氣下陷、食欲減退、久瀉脫肛等[3-4]。皂苷是其主要活性成分之一，現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)其對抗氧化應激反應具有良好效用，可以調(diào)節(jié)氧化反應酶系和清除自由基等[5]。因此，本研究旨在通過建立AP 小鼠模型，探討黃芪總皂苷對AP 小鼠氧化損傷的影響及其可能作用機制，為黃芪總皂苷藥物開發(fā)及AP臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6 ～ 8 周齡SPF 級健康雄性C57BL/6 小鼠80 只，體質(zhì)量為18 ～ 22 g。動物來源：廣東省實驗動物檢測所，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-0044。所有小鼠于相同環(huán)境進行適應性飼養(yǎng)7 d，試驗期間進食普通飼料，可自由飲水。環(huán)境溫度調(diào)節(jié)范圍為22 ～ 24℃，環(huán)境相對濕度調(diào)節(jié)范圍為40% ～60%，環(huán)境光暗周期為光照12 h、黑暗12 h。

1.1.2 藥品、主要試劑和儀器 黃芪總皂苷（批號：A52540，純度≥98%，規(guī)格：20 mg，上海吉至生化科技有限公司）；L-精氨酸粉劑（批號：R003157，純度≥99%，規(guī)格：100 g，上海易恩生物科技有限公司）；血清淀粉酶（AMY）ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）（南京建成生物工程研究所）；兔抗β-actin 多克隆抗體、兔抗鼠核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素加氧酶1（HO-1）多克隆抗體、山羊抗兔二抗IgG（美國CST 公司）；Stat Fax2600型多功能洗板機（美國AWARENESS 公司）；WD-2102 型自動酶標儀（上海惠誠生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 AP 小鼠模型建立 適應性飼養(yǎng)7 d 后禁食12 h，隨機選取65 只小鼠建立AP 模型，每間隔1 h 給予小鼠腹腔注射pH = 7，20% L-精氨酸溶液（生理鹽水配制）2.5 mg/kg，連續(xù)注射2 次。末次給藥后，觀察小鼠行為，若小鼠表現(xiàn)為腹部收縮明顯，痛苦異常，且伴有間歇性嘔吐，采集小鼠尾靜脈血液，若AMY 水平較對照組小鼠相比呈倍數(shù)增加，則視為建模成功[6]。

1.2.2 分組與給藥 建模成功小鼠（60 只）隨機分為模型組（15 只）、黃芪總皂苷低劑量組（15 只）、中劑量組（15 只）、高劑量組（15 只），其余小鼠為對照組（15 只）。參考文獻[7-8]用量，黃芪總皂苷低、中、高劑量組灌胃給藥25、50、100 mg/kg 黃芪總皂苷混懸液（生理鹽水配制），對照組及模型組給予等量生理鹽水，各組給藥1 次/d，連續(xù)7 d。

1.3 檢測指標

1.3.1 樣本采集 各組小鼠末次給藥后6、12、24 h 采集尾靜脈血液，于4 ℃以3 000 r/min 離心15 min，分離血清，-20℃保存。采集完畢，各組小鼠稱重，腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg 麻醉，開腹，采集小鼠腹主動脈血液，靜置血液4 h，以3 000 r/min 離心15 min，分離血清。處死小鼠，冰上剝離小鼠胰腺組織，稱量胰腺質(zhì)量并計算胰腺指數(shù)[胰腺指數(shù)（%） = （胰腺濕重/小鼠體質(zhì)量）×100%]，再用預冷的生理鹽水多次沖洗，將胰腺組織分為兩部分，一部分胰腺組織使用4%多聚甲醛液固定24 h 備用，其余組織裝入無菌凍存管內(nèi)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 AMY 水平檢測 取出各時間點采集的尾靜脈血液分離出的血清，將ELISA 試劑盒取出并恢復至室溫后開始檢測。嚴格按照試劑盒說明書操作，將已知濃度的標準品與待測樣品加入微孔酶標板內(nèi)，再加入提前做好預熱的生物素抗體，待完全反應后棄液并清洗板孔，加入提前預熱的標記酶，完全反應后再次棄液并清洗板孔，加入底物A、B 出現(xiàn)顏色梯度變化后，終止反應。使用酶標儀測定OD，根據(jù)標準品梯度濃度結(jié)果建立標準曲線，代入待測樣品OD計算樣本濃度。

1.3.3 氧化應激因子水平檢測 取出腹主動脈血液分離出的血清和ELISA 試劑盒，于室溫下待試劑盒和待測樣品恢復至室溫后開始檢測，按照MDA、GSHPx、SOD、CAT 試劑盒說明書操作，主要步驟為：將稀釋好的標準樣品50 μL及待測樣品添加至相應板孔中，封膜于37℃恒溫水浴箱中靜置60 min，清洗板孔 6 次。每孔中加入50 μL 工作液，封膜避光，于37℃恒溫水浴箱中靜置60 min，清洗板孔6 次。加入顯色底物A、B 各50 μL，混勻，37℃反應15 min，加入終止液終止反應。于酶標儀450 nm 測定OD，根據(jù)標準品濃度及其OD導出標準曲線，結(jié)合待測樣品OD計算樣品濃度并做好記錄。

1.3.4 胰腺組織HE 染色觀察 將經(jīng)過4%甲醛固定24 h 的胰腺組織取出，沖洗固定液后，使用從低濃度到高濃度的乙醇溶液對胰腺組織逐步脫去水分，脫水后將組織泡入二甲苯中透明。取出透明好的胰腺組織完全浸入已溶化的石蠟中，包埋后待組織塊變硬。對石蠟塊修整并切片，切成5 μm 厚度的薄片，再使用二甲苯和乙醇脫蠟復水，蘇木素染色15 min，流水沖洗15 min 返藍，放入1%鹽酸乙醇褪色10 s，清水漂洗，不同梯度乙醇溶液脫水，0.5%伊紅溶液染色3 min，再浸入二甲苯、不同梯度乙醇脫蠟脫水，用中性樹脂封片。陰涼處晾干后，將胰腺組織切片置于光學顯微鏡下觀察分析并拍片。

1.3.5 Nrf2、HO-1 mRNA 表達 取出備用的胰腺組織加入EP 管內(nèi)，再加入RNA iso plus 500 μL，勻漿后靜置10 min，依次加入氯仿、異丙醇，離心并棄去上清液，獲得總RNA。取2 μL RNA 樣品使用超微量核酸蛋白測定儀檢測RNA 濃度。測定結(jié)束后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。加入2 μL cDNA，10 μL SYBRGreen PCR Master Mix，0.8 μL 上、下游引物，6.4 μL RNase Free Water 制備PCR 反應體系。于95℃ 5 s，60℃ 10 s，72℃ 15 s 共進行40 個循環(huán)。反應引物序列設(shè)計為Nrf-2：上游（5′-TCTTGGAGTAAG TCGAGAAGTGT-3′），下游（5′-GTTGAAACTGAG CGAAAAAGGC-3′）；HO-1：上游（5′-CTTTAGTCAG CGACAGAAGGAC-3′），下游（5′-AGGCATCTTGTT TGGGAATGTG-3′）；β-actin：上游（5′-TAGATGACCAT GAGTCGCTTGC-3′），下游（5′-GCCAAACTTGCTCCA TGTCCGG-3′）。延伸步驟采集熒光信號，反應結(jié)束后繪制融解曲線，以ΔCt 值和2-△△Ct進行數(shù)據(jù)分析，計算待測樣品目的基因相對定量結(jié)果。

1.3.6 Nrf2、HO-1 蛋白表達 先按照比例制備RIPA裂解液，冰上預冷備用，取出備用的胰腺組織加入EP管內(nèi)，再加入500 μL 裂解液，于4℃以12 000 r/min（r= 12 cm）高速離心機離心10 min，吸取上清液，利用BCA 蛋白測量試劑盒測定組織蛋白濃度。計算出蛋白上樣量，將制備好的分離膠和濃縮膠加入垂直電泳槽，恒壓80 V，15 min，待蛋白電泳至濃縮膠處，電壓120 V，45 min，切膠轉(zhuǎn)模。用TBST 配制5%脫脂奶粉，封閉1 h 后，加入1 ∶2 000 稀釋一抗，4℃，搖床慢速孵育過夜，TBST 清洗4 次，加入1 ∶3 000稀釋二抗，封閉1 h，TBST 清洗4 次，配制ECL 發(fā)光液，滴在PDVF 膜上，置于成像儀內(nèi)，曝光3 min，獲得成像，分析目的條帶光密度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

用SPSS 23.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺指數(shù)比較

與對照組比較，模型組小鼠胰腺指數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪總皂苷低、中、高劑量組小鼠胰腺指數(shù)降低（P＜0.05），且隨著給藥濃度的增加，胰腺指數(shù)呈下降趨勢（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠胰腺指數(shù)比較（±s, n = 15）Tab. 1 Comparison of pancreatic index of mice in each group（±s, n = 15）

表1 各組小鼠胰腺指數(shù)比較（±s, n = 15）Tab. 1 Comparison of pancreatic index of mice in each group（±s, n = 15）

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05；與黃芪總皂苷低劑量組比較，▲P ＜ 0.05；與黃芪總皂苷中劑量組比較，#P ＜ 0.05。

組別 胰腺指數(shù) / %對照組 3.94 ± 0.32模型組 12.73 ± 1.35*黃芪總皂苷低劑量組 8.49 ± 0.72*△黃芪總皂苷中劑量組 6.58 ± 0.53*△▲黃芪總皂苷高劑量組 4.26 ± 0.36*△▲＃F 340.997 P 0.000

2.2 AMY 水平比較

與對照組比較，模型組小鼠各時間點血清AMY水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪總皂苷低、中、高劑量組小鼠各時間點血清AMY 水平均呈現(xiàn)不同程度的降低（P＜0.05），以高劑量組最為明顯。隨著時間變化，模型組、黃芪總皂苷低、中劑量組小鼠血清AMY 水平升高（P＜0.05），對照組與黃芪總皂苷高劑量組小鼠血清AMY 水平間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組小鼠不同時間點血清AMY 水平比較（±s, n = 15）Tab. 2 Comparison of serum AMY levels in mice at different time points（±s, n = 15）

表2 各組小鼠不同時間點血清AMY 水平比較（±s, n = 15）Tab. 2 Comparison of serum AMY levels in mice at different time points（±s, n = 15）

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05；與黃芪總皂苷低劑量組比較，▲P ＜ 0.05；與黃芪總皂苷中劑量組比較，#P ＜ 0.05。

組別 AMY / （U/L） F P 6 h 12 h 24 h對照組 2 017.69 ± 186.51 2 115.78 ± 150.42 2 162.84 ± 163.47 2.933 0.064模型組 4 673.27 ± 380.32* 5 468.82 ± 430.27* 6 783.47 ± 561.28* 79.258 0.000黃芪總皂苷低劑量組 3 754.06 ± 291.26*△ 4 611.03 ± 384.27*△ 5 362.19 ± 465.34*△ 64.884 0.000黃芪總皂苷中劑量組 2 961.28 ± 239.97*△▲ 3 218.69 ± 254.82*△▲ 4 213.08 ± 367.25*△▲ 76.403 0.000黃芪總皂苷高劑量組 2 349.46 ± 190.85*△▲＃ 2 388.11 ± 209.76*△▲＃ 2 514.24 ± 216.94*△▲＃ 2.621 0.085 F 243.034 336.106 380.371 - -P 0.000 0.000 0.000 - -

2.3 氧化應激因子比較

與對照組比較，模型組小鼠血清MDA 水平升高，GSH-Px、SOD、CAT 水平降低（P＜ 0.05）。與模型組比較，黃芪總皂苷低、中、高劑量組小鼠血清MDA水平降低，GSH-Px、SOD、CAT 水平升高（P＜ 0.05）， 以高劑量組最為明顯，見表3。

表3 各組小鼠氧化應激因子水平比較（±s, n = 15）Tab. 3 Comparison of levels of oxidative stress factors in mice of each group（±s, n = 15）

表3 各組小鼠氧化應激因子水平比較（±s, n = 15）Tab. 3 Comparison of levels of oxidative stress factors in mice of each group（±s, n = 15）

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05；與黃芪總皂苷低劑量組比較，▲P ＜ 0.05；與黃芪總皂苷中劑量組比較，#P ＜ 0.05。

組別 MDA / （nmol/mg） GSH-Px / （U/mg） SOD / （U/mg） CAT / （U/mg）對照組 1.54 ± 0.12 246.43 ± 21.53 328.24 ± 26.37 2.73 ± 0.23模型組 5.62 ± 0.42* 121.82 ± 10.17* 129.42 ± 11.23* 1.06 ± 0.08*黃芪總皂苷低劑量組 4.46 ± 0.39*△ 163.24 ± 13.34*△ 227.05 ± 18.84*△ 1.43 ± 0.12*△黃芪總皂苷中劑量組 3.29 ± 0.28*△▲ 204.96 ± 19.47*△▲ 266.94 ± 22.56*△▲ 1.69 ± 0.15*△▲黃芪總皂苷高劑量組 1.62 ± 0.15*△▲＃ 235.15 ± 20.51*△▲＃ 304.62 ± 24.61*△▲＃ 2.61 ± 0.21*△▲＃F 534.359 130.101 200.102 289.138 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 胰腺組織HE 染色比較

結(jié)果顯示，對照組小鼠胰腺腺泡結(jié)構(gòu)完整，細胞排列整齊，邊界清晰，染色均勻。胰腺組織未見出血、壞死等現(xiàn)象，胰管形態(tài)正常，小葉間隙正常，未見炎性細胞浸潤。模型組小鼠胰腺細胞形態(tài)異常，細胞邊界模糊，染色不均。胰腺組織出現(xiàn)細胞水腫，間質(zhì)可見出血現(xiàn)象。小葉排列散亂無序，可見大量炎性細胞浸潤。黃芪總皂苷低、中、高劑量組小鼠胰腺腺泡形態(tài)得到改善，細胞界限清晰，染色均勻，細胞水腫變性現(xiàn)象減少，小葉走勢整齊，炎性細胞浸潤現(xiàn)象顯著減少，見圖1。

圖1 胰腺組織HE 染色結(jié)果（×200）Fig. 1 HE staining results of pancreatic tissue（×200）

2.5 Nrf2、HO-1 mRNA 比較

與對照組比較，模型組小鼠Nrf2、HO-1 mRNA表達水平降低（P＜ 0.05）。與模型組比較，黃芪總皂苷低、中、高劑量組小鼠胰腺組織Nrf2、HO-1 mRNA 表達水平均升高（P＜ 0.05），以高劑量組最為明顯，見表4。

表4 各組小鼠Nrf2、HO-1 mRNA 水平比較（±s, n = 15）Tab. 4 Comparison of Nrf2 and HO-1 mRNA levels in mice of each group（±s, n = 15）

表4 各組小鼠Nrf2、HO-1 mRNA 水平比較（±s, n = 15）Tab. 4 Comparison of Nrf2 and HO-1 mRNA levels in mice of each group（±s, n = 15）

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05；與黃芪總皂苷低劑量組比較，▲P ＜ 0.05；與黃芪總皂苷中劑量組比較，#P ＜ 0.05。

對照組 3.64 ± 0.34 2.73 ± 0.12模型組 1.27 ± 0.13* 0.94 ± 0.07*黃芪總皂苷低劑量組 1.96 ± 0.18*△ 1.35 ± 0.14*△黃芪總皂苷中劑量組 2.46 ± 0.21*△▲ 1.98 ± 0.17*△▲黃芪總皂苷高劑量組 3.58 ± 0.32*△▲＃ 2.52 ± 0.23*△▲＃F 255.207 357.869 P 0.000 0.000

2.6 Nrf2、HO-1 蛋白比較

與對照組比較，模型組小鼠胰腺組織Nrf2、HO-1 蛋白表達水平降低（P＜ 0.05）。與模型組比較，黃芪總皂苷低、中、高劑量組小鼠胰腺組織Nrf2、HO-1 蛋白表達水平均升高（P＜ 0.05），以高劑量組最為明顯，見表5、圖2。

表5 各組小鼠Nrf2、HO-1 蛋白水平比較（±s, n = 15）Tab. 5 Comparison of Nrf2 and HO-1 protein expression levels in mice of each group（±s, n = 15）

表5 各組小鼠Nrf2、HO-1 蛋白水平比較（±s, n = 15）Tab. 5 Comparison of Nrf2 and HO-1 protein expression levels in mice of each group（±s, n = 15）

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05；與黃芪總皂苷低劑量組比較，▲P ＜ 0.05；與黃芪總皂苷中劑量組比較，#P ＜ 0.05。

組別 Nrf2 HO-1對照組 1.64 ± 0.14 1.37 ± 0.12模型組 0.47 ± 0.05* 0.34 ± 0.03*黃芪總皂苷低劑量組 0.96 ± 0.08*△ 0.65 ± 0.06*△黃芪總皂苷中劑量組 1.26 ± 0.11*△▲ 0.98 ± 0.07*△▲黃芪總皂苷高劑量組 1.58 ± 0.16*△▲＃ 1.25 ± 0.13*△▲＃F 263.542 333.667 P 0.000 0.000

圖2 胰腺組織蛋白檢測圖Fig. 2 Detection of protein in cerebral artery tissue

3 討論

AP 病程進展中胰腺腺泡受損產(chǎn)生大量氧自由基，超過機體內(nèi)抗氧化能力，過量氧自由基加重胰腺局部炎癥反應，增加毛細血管通透性，損傷血管內(nèi)皮細胞，釋放大量有毒物質(zhì)最終引起細胞結(jié)構(gòu)、生理和代謝機制調(diào)節(jié)異常[9]。因此，盡早開發(fā)抗氧化藥物對AP 臨床治療有重要意義。黃芪總皂苷是黃芪主要有效成分之一，常用來治療心肌損傷、氧化損傷等[10-11]。研究報道黃芪可以通過減少自由基產(chǎn)生、改善供氧，調(diào)節(jié)抗氧化酶活性等途徑提高機體抗氧化能力，但其作用機制尚不明確[12]。腹腔注射L-精氨酸法誘導AP 模型，病理進程與人類疾病類似，現(xiàn)已被廣泛應用于AP 疾病研究以及相應藥物開發(fā)[13-14]。故本研究腹腔注射L-精氨酸法建立AP 小鼠模型，從分子機制上探討黃芪總皂苷對AP 小鼠氧化損傷的改善，探究其可能作用機制。結(jié)果顯示，模型組小鼠胰腺指數(shù)、血清AMY、MDA 水平升高，GSH-Px、SOD、CAT 水平降低，提示模型組小鼠抗氧化因子水平降低，氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，小鼠體內(nèi)存在嚴重的氧化應激反應。過度的氧化應激對胰腺組織造成損傷，血清AMY 下降，胰腺組織受損嚴重。在給予不同劑量的黃芪總皂苷干預下小鼠均表現(xiàn)出胰腺指數(shù)、血清AMY、MDA 水平降低，血清GSH-Px、SOD、CAT水平升高，且諸項指標以高劑量組效果最佳。提示不同劑量的黃芪總皂苷均可在一定程度上緩解小鼠體內(nèi)的氧化損傷，提高抗氧化因子水平，減少氧化應激對胰腺組織的損傷，100 mg/kg 黃芪總皂苷對小鼠氧化/抗氧化系統(tǒng)損傷的改善效果最佳。此外，胰腺組織HE 染色結(jié)果也表現(xiàn)出胰腺腺泡破損現(xiàn)象得到改善，細胞水腫變性減少，炎性細胞浸潤減少，胰腺受損現(xiàn)象得到改善。

Nrf2/HO-1 通路廣泛參與機體內(nèi)各組織器官抗氧化應激損傷，是內(nèi)源性保護體系之一[15]。Nrf2 是一種與抗氧化應激密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)應激狀態(tài)下細胞氧化還原狀態(tài)[16]。正常狀態(tài)下，Nrf2 位于細胞骨架上，并與其阻遏蛋白Keapl 耦聯(lián)。當受到過量氧自由基、親電性試劑刺激時，Nrf2 從泛素化降解途徑中脫離出來，與抗氧化反應元件結(jié)合，啟動下游多種抗氧化基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控與氧化相關(guān)抗氧化酶的表達[17]。在本研究中，黃芪總皂苷各劑量組小鼠Nrf2、HO-1 mRNA 和蛋白表達水平較模型組小鼠均明顯升高，以黃芪總皂苷高劑量組效果最為明顯，結(jié)合小鼠血清中抗氧化因子水平變化，可見激活Nrf2/HO-1 信號通路，對AP 小鼠氧化損傷有積極影響。

4 結(jié)論

黃芪總皂苷能夠有效調(diào)節(jié)急性胰腺炎小鼠血清AMY 水平，減輕胰腺組織損傷，提高小鼠Nrf2 和HO-1mRNA 與蛋白表達水平，通過激活Nrf2/HO-1信號通路提高小鼠抗氧化因子水平，從而發(fā)揮抗氧化作用，黃芪總皂苷可以作為臨床治療急性胰腺炎的備選藥物。