棉花黃萎病抗性相關(guān)基因GhTIFY9的克隆與功能分析

李秀青 胡子曜 雷建峰代培紅 劉超 鄧嘉輝 劉敏 孫玲 劉曉東李月

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

棉花是一種在世界范圍內(nèi)普遍種植的經(jīng)濟(jì)作物，同時(shí)也是天然纖維和油料的主要來(lái)源［1］。黃萎病是一種主要由大麗輪枝菌（Verticillium dahliaeKleb）引起的土傳維管束真菌病害；大麗輪枝菌寄主范圍廣泛，可以侵染包括棉花在內(nèi)的200多個(gè)雙子葉植物品種；此外它還可以在棉花的整個(gè)生命周期內(nèi)發(fā)生，造成棉花產(chǎn)量的大幅損失，嚴(yán)重影響其纖維品質(zhì)［2］。由于目前還沒(méi)有針對(duì)性的殺菌劑及其他有效的防御措施，因此，選育抗病品種是控制該病原菌危害的最有效途徑，而發(fā)掘棉花抗病相關(guān)基因是棉花抗病育種的關(guān)鍵和基礎(chǔ)［3］。

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TF）在植物抗逆中發(fā)揮著不可或缺的作用，已逐漸成為植物抗逆育種的關(guān)鍵。TIFY家族是一類包含TIFY結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，只存在于植物中，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［4］。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域組成的不同，TIFY家族可分為T(mén)IFY、JAZ、ZML和PPD四個(gè)亞家族，均包含一個(gè)高度保守的TIFY結(jié)構(gòu)域。然而，JAZ亞家族蛋白在C端還存在一個(gè)保守的Jas結(jié)構(gòu)域；ZML亞家族蛋白還含有一個(gè)GATA鋅指結(jié)構(gòu)域和一個(gè)CCT基序；PPD亞家族蛋白則還存在一個(gè)N端PPD結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PY基序缺失的Jas結(jié)構(gòu)域；TIFY亞家族則只含有一個(gè)TIFY結(jié)構(gòu)域［5］。最早由Nishii等［6］在擬南芥中鑒定出了一個(gè)TIFY家族基因ZIM，此后TIFY家族基因陸續(xù)在水稻、玉米、小麥、丹參、柳枝稷、毛竹、番茄、大豆、香蕉、蘋(píng)果、沙梨、西瓜、葡萄、牽牛花及雷蒙德氏棉等多種植物中鑒定出來(lái)［7］，對(duì)TIFY家族基因的功能分析也逐漸成為研究熱點(diǎn)。JAZ亞家族基因作為茉莉酸（JA）信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子和激素網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控樞紐，近年來(lái)對(duì)其功能的研究報(bào)道較多，且主要集中在調(diào)控植物抗逆反應(yīng)。Meng等［8］研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥JAZ7基因參與了植物的光合作用、氧化還原反應(yīng)、氨基酸、植物激素和防御代謝物的調(diào)控，進(jìn)而正向調(diào)節(jié)擬南芥的耐旱性。Ebel等［9］研究發(fā)現(xiàn)，小麥JAZ亞家族基因TdTIFY11a響應(yīng)鹽脅迫誘導(dǎo)，過(guò)表達(dá)該基因后顯著降低了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱的敏感性。Zhu等［10］通過(guò)敲除2個(gè)JAZ亞家族基因AtTIFY10a和AtTIFY10b后顯著增強(qiáng)了植株對(duì)堿脅迫的敏感性，而過(guò)表達(dá)苜蓿JAZ亞家族基因GsTIFY10a后顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐堿性，推測(cè)TIFY10蛋白在植物對(duì)堿脅迫的響應(yīng)中起正向調(diào)控的作用。Zhao等［11］過(guò)表達(dá)大豆GsJAZ2后，顯著降低了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)堿脅迫的敏感性。Seo等［12］研究發(fā)現(xiàn)OsJAZ1通過(guò)調(diào)控JA信號(hào)通路繼而參與水稻的抗旱反應(yīng)。Yang等［13］利用RT-qPCR分析了西瓜TIFY基因在不同脅迫下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)部分TIFY基因?qū)Σ煌{迫均有所響應(yīng)，其中ClJAZ1和ClJAZ7最為顯著。Zhang等［14］研究發(fā)現(xiàn)，玉米ZmJAZ響應(yīng)莖腐病和炭疽病等真菌病害的誘導(dǎo)。Yu等［15］在擬南芥中過(guò)表達(dá)葡萄VvTIFY9后顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的白粉病抗性，且相關(guān)抗病基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。劉嘉鵬等［16］利用RT-qPCR分析了香蕉JAZ亞家族基因MaTIFY9在不同脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)該基因響應(yīng)低溫、高溫、脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）及枯萎病菌的誘導(dǎo)。

目前，對(duì)于TIFY、ZML和PPD亞家族基因功能的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，對(duì)于TIFY亞家族基因參與棉花抗黃萎病反應(yīng)的相關(guān)研究更是未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選得到一個(gè)響應(yīng)黃萎病菌誘導(dǎo)表達(dá)的TIFY亞家族基因GhTIFY9，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)對(duì)該基因在棉花抗黃萎病中的功能進(jìn)行了初步探究，為進(jìn)一步研究該基因的抗病分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1，種子由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室繁存；農(nóng)桿菌菌株GV3101為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；TRV病毒載體、陽(yáng)性對(duì)照TRV：GhCLA1載體和大麗輪枝菌菌株V991（Verticillium dahliaKleb）均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院黃全生研究員惠贈(zèng)。EcoR I和KpnI等限制性內(nèi)切酶均購(gòu)于賽默飛（Thermo）世爾科技有限公司，F(xiàn)astPfu Fly DNA聚合酶、Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、pEASY Blunt-Zero克隆載體、T4 DNA Ligase和DNA分子量Marker均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和RNase A購(gòu)于南京諾維贊生物科技有限公司，植物總RNA提取試劑盒購(gòu)于杭州博日生物科技有限公司；熒光定量試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于加拿大ABM生物科技有限公司；試驗(yàn)所用卡那霉素、慶大霉素、MES、乙酰丁香酮、MgCl2及培養(yǎng)基配制等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；PCR所用引物的合成和DNA測(cè)序均由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 棉花的培育及種植 選取經(jīng)硫酸脫絨后大小一致且顆粒飽滿的種子，參照胡子曜等［17］方法進(jìn)行培育及種植。

1.2.2 黃萎病菌的培養(yǎng)及誘導(dǎo)處理 參照Li等［18］方法將-80℃保存的大麗輪枝菌V991取出進(jìn)行活化培養(yǎng)及接菌處理，對(duì)照組（MOCK）用Czapek’s培養(yǎng)基處理，分別在0、6、12、24、48和72 h取棉株根部組織；每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均取3-4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，取樣后立即置于液氮中速凍，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 棉花總RNA的提取及cDNA的合成 參照植物總RNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行棉花根部樣品總RNA的提取，經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.2.4 棉花GhTIFY9的克隆及序列分析 通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得GhTIFY9序列并在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，獲得其登錄號(hào)：XM_016837092。根據(jù)該基因的ORF（open reading frame）序列設(shè)計(jì)引物GhTIFY9-F：5'-ATGTCGAGAGCTAGCGTCGA-3'和GhTIFY9-R：5'-CTAGCAAGCATATGGAGATGC-3'，參照胡子曜等［17］方法，以陸地棉TM-1的cDNA為模板，使用FastPfu Fly DNA聚合酶（北京，全式金）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收目的條帶，并連接pEASY Blunt-Zero克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性單克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

使 用（http://web.expasy.org/protparam/）在 線程序計(jì)算GhTIFY9編碼蛋白質(zhì)的理化參數(shù)；使用SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）在線程序?qū)υ摰鞍踪|(zhì)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析；使用在線軟件TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)其跨膜結(jié)構(gòu)域；使用ProtComp-Version9.0（http://linux1.softberry.com/）在線軟件對(duì)該蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析；使用在線網(wǎng)站SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.5 黃萎病菌誘導(dǎo)下GhTIFY9的表達(dá)模式分析 以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，以棉花管家基因GhUBQ7［19］為內(nèi)參基因，參照熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)（加拿大，ABM）進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)。內(nèi)參基因GhUBQ7的引物序列為q-GhUBQ7-F：5'-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3'，q-GhUBQ7-R：5'-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3'；GhTIFY9的熒光定量引物序列為q-GhTIFY9-F：5'-CCGTTTTTAATGTACCTCGAG-3'，q-GhTIFY9-R：5'-TGTCGATCGCTAGGAGGAC-3'。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因Ct值，使用2-ΔΔCt方法［20］計(jì)算目的基因的表達(dá)量。

1.2.6GhTIFY9的VIGS載體構(gòu)建 根據(jù)GhTIFY9的ORF（594 bp）序列，利用SGN-VIGS在線軟件設(shè)計(jì)抑制目的基因表達(dá)的靶序列（550 bp），手動(dòng)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物并在其上、下游5'端分別加入EcoR I和KpnI的 酶 切 位 點(diǎn)（CM-GhTIFY9-F：5'-GAATTCCGTCGAGCTTGATTTCTTTG-3'，CM-GhTIFY9-R：5'-GGTACCCCTCTCTTTGCGCTTTTCC-3'），以cDNA為模板進(jìn)行目標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增，回收、檢驗(yàn)、測(cè)序方法同1.2.4。將測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列完全匹配的質(zhì)粒和VIGS載體TRV2用EcoR I和KpnI進(jìn)行雙酶切并回收目的片段，用T4 DNA Ligase連接3-4 h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，用EcoR I和KpnI進(jìn)行雙酶切鑒定，正確的質(zhì)粒取10-15 μL使用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，28℃倒置培養(yǎng)1-2 d，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的VIGS侵染棉花及沉默效率檢測(cè) 將重組載體TRV:RNA1、TRV:RNA2、TRV:GhCLA1和TRV:GhTIFY9轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，待棉苗生長(zhǎng)至兩片子葉完全展開(kāi)且真葉未露出時(shí)，選取生長(zhǎng)較為一致的棉花幼苗，參照Li等［18］方法，進(jìn)行菌體的活化、重懸及VIGS侵染棉花。將包含TRV:GhTIFY9和TRV:RNA1、TRV:GhCLA1和TRV:RNA1、TRV:RNA2和TRV:RNA1的 重 懸 菌 液所侵染的棉花植株分別作為試驗(yàn)組及陽(yáng)性、陰性對(duì)照。侵染大約3周后，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照植株的葉片出現(xiàn)明顯的白化表型時(shí)，對(duì)試驗(yàn)組和陰性、陽(yáng)性對(duì)照的第二片真葉及根部進(jìn)行取樣，每個(gè)樣本3-4個(gè)技術(shù)重復(fù)。將所取樣本進(jìn)行RNA提取及cDNA合成，利用RT-qPCR技術(shù)進(jìn)行沉默效率檢測(cè)。陽(yáng)性對(duì)照GhCLA1的熒光定量引物為q-GhCLA1-F：5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3'；q-GhCLA1-R：5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3'。

1.2.8 棉苗的接種處理 參照Li等［18］方法，選取生長(zhǎng)狀況一致的GhTIFY9沉默植株和陰性對(duì)照植株進(jìn)行黃萎病菌的接種處理。

1.2.9GhTIFY9的黃萎病抗性鑒定 在接種黃萎病菌15 d后拍照記錄GhTIFY9沉默植株和陰性對(duì)照植株的表型差異，并采用葉片分級(jí)法統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)［18］，同時(shí)對(duì)GhTIFY9沉默植株和陰性對(duì)照植株進(jìn)行剖稈檢測(cè)及莖段恢復(fù)培養(yǎng)試驗(yàn)［21］。

2 結(jié)果

2.1 GhTIFY9的克隆與序列分析

以陸地棉TM-1的葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1），大小符合預(yù)期，表明GhTIFY9基因的ORF序列克隆成功。利用在線軟件對(duì)GhTIFY9進(jìn)行生物學(xué)分析（表1），GhTIFY9的ORF為594 bp，編碼197個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為21.65 kD，脂肪系數(shù)為76.63，理論等電點(diǎn)為9.08，平均疏水性為負(fù)值，表明該蛋白為堿性、親水性蛋白；信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示GhTIFY9蛋白無(wú)信號(hào)肽；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其定位于細(xì)胞核，符合轉(zhuǎn)錄因子的特征；跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白為非跨膜蛋白；蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，該蛋白只含有一個(gè)TIFY結(jié)構(gòu)域（圖2），屬于TIFY亞家族。

圖2 GhTIFY9蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.2 Protein domain prediction of GhTIFY9

表1 GhTIFY9的生物信息學(xué)分析Table 1 Bioinformatics analysis of GhTIFY9

圖1 GhTIFY9的克隆Fig. 1 Cloning of GhTIFY9 gene

2.2 黃萎病菌誘導(dǎo)下GhTIFY9的表達(dá)模式分析

黃萎病菌誘導(dǎo)處理后（圖3），與對(duì)照組相比，GhTIFY9表達(dá)量在12和72 h顯著上調(diào)，在24和48 h顯著下調(diào)，6 h無(wú)明顯變化。表明GhTIFY9響應(yīng)黃萎病菌誘導(dǎo)處理，可能在棉花抗黃萎病反應(yīng)中發(fā)揮一定的作用。

圖3 黃萎病誘導(dǎo)下GhTIFY9的表達(dá)模式分析Fig.3 Analysis of the expression patterns of GhTIFY9 under the treatment of Verticillium dahliae

2.3 GhTIFY9的VIGS載體構(gòu)建

利用PCR方法擴(kuò)增抑制GhTIFY9表達(dá)的靶序列（CM-GhTIFY9），電泳檢測(cè)產(chǎn)物大小符合預(yù)期（圖4-A）。將產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆并測(cè)序，所得結(jié)果與目標(biāo)序列完全匹配。陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和KpnI酶切后與VIGS載體TRV2連接、轉(zhuǎn)化，并用上述2個(gè)酶進(jìn)行雙酶切鑒定（圖4-B），結(jié)果呈2條帶（TRV:GhTIFY9），一條大于8 000 bp的載體條帶和大小為500-750 bp的目標(biāo)條帶，表明GhTIFY9的VIGS載體構(gòu)建成功。

圖4 GhTIFY9的VIGS載體構(gòu)建Fig. 4 VIGS vector construction of GhTIFY9

2.4 GhTIFY9的沉默效率檢測(cè)

將TRV:GhTIFY9、TRV:GhCLA1和TRV:RNA2分別與TRV:RNA1混合，分別侵染棉花子葉。大約3周后進(jìn)行表型觀察，與陰性對(duì)照TRV:00相比，陽(yáng)性對(duì)照TRV:GhCLA1的葉片出現(xiàn)明顯的白化現(xiàn)象（圖5-A）；利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照GhCLA1和目的基因GhTIFY9在根部和真葉中的表達(dá)量，結(jié)果（圖5-B，C）顯示，與陰性對(duì)照相比，目的基因的表達(dá)量均顯著性下調(diào)表明VIGS沉默載體能夠在植株體內(nèi)正常工作，成功獲得GhTIFY9的沉默植株。

圖5 GhTIFY9的沉默效率檢測(cè)Fig. 5 Silencing efficiency detection of GhTIFY9 gene

2.5 GhTIFY9沉默植株的黃萎病抗性鑒定

選取生長(zhǎng)狀況一致的GhTIFY9沉默植株和TRV:00陰性對(duì)照植株進(jìn)行黃萎病菌侵染處理，15 d后拍照記錄其表型差異并進(jìn)行病情指數(shù)的統(tǒng)計(jì)及剖稈檢測(cè)和莖段恢復(fù)培養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果（圖6-A）顯示，GhTIFY9沉默棉株的葉片黃化和植株萎蔫程度高于陰性對(duì)照植株，與陰性對(duì)照植株相比其整體健康狀況更差；病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖6-B）顯示，GhTIFY9沉默植株病情指數(shù)顯著高于陰性對(duì)照植株；剖稈檢測(cè)結(jié)果（圖6-C）顯示，與陰性對(duì)照植株相比，GhTIFY9沉默植株莖稈的褐變程度更加嚴(yán)重；莖段恢復(fù)培養(yǎng)結(jié)果（圖6-D）顯示，與陰性對(duì)照植株相比，GhTIFY9沉默植株的莖段在培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的真菌菌絲數(shù)量更多。以上結(jié)果表明，GhTIFY9是棉花抗黃萎病反應(yīng)的一個(gè)正調(diào)控因子，干涉GhTIFY9表達(dá)后顯著增強(qiáng)了棉花對(duì)黃萎病菌的敏感性。

圖6 GhTIFY9沉默植株的抗病性鑒定Fig. 6 Disease resistance identification of GhTIFY9 genesilenced plants

3 討論

我國(guó)作為棉花種植大國(guó)，超過(guò)40%的棉花正遭受著黃萎病菌的嚴(yán)重威脅，黃萎病菌通過(guò)根部侵染棉花，隨后蔓延至根皮層并侵入木質(zhì)部導(dǎo)管，形成菌絲和分生孢子造成維管組織的功能損傷，導(dǎo)致棉花出現(xiàn)葉片萎蔫、變色、脫落甚至死亡，最終導(dǎo)致棉花產(chǎn)量大幅下降繼而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［22］。為保護(hù)自身免受病原體的攻擊，植物已進(jìn)化出一系列的防御機(jī)制，包括復(fù)雜的信號(hào)感知、轉(zhuǎn)導(dǎo)和交換；植物抗病反應(yīng)是由一系列復(fù)雜的信號(hào)分子調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)錄因子作為一種多功能蛋白，可以同時(shí)參與包括對(duì)脅迫信號(hào)的感知和相應(yīng)基因的表達(dá)在內(nèi)的多種信號(hào)途徑的調(diào)控，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要作用［23］。近年來(lái)，許多研究顯示，轉(zhuǎn)錄因子參與棉花抗黃萎病反應(yīng)的相關(guān)調(diào)控，其調(diào)控方式及參與的調(diào)控機(jī)制也各不相同。Yu等［24］過(guò)表達(dá)棉花GhWRKY15后顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草的黃萎病抗性，推測(cè)該基因正向調(diào)控棉花抗黃萎病反應(yīng)。Ma等［25］利用VIGS技術(shù)干涉BEL1-Like轉(zhuǎn)錄因子GhBLH7-D06表達(dá)后顯著降低了沉默植株對(duì)黃萎病菌的敏感性，同時(shí)沉默植株中木質(zhì)素合成和JA信號(hào)通路基因表達(dá)顯著上調(diào)，表明該基因可能通過(guò)抑制木質(zhì)素的生物合成和JA信號(hào)傳導(dǎo)途徑從而負(fù)調(diào)控棉花對(duì)黃萎病的抗性。Hu等［26］研究發(fā)現(xiàn)，GhWAKY1通過(guò)正向調(diào)控木質(zhì)素的生物合成繼而增強(qiáng)了棉花對(duì)于黃萎病的抗性。而相反的是，Xiao等［27］研究發(fā)現(xiàn)GhMYB4下調(diào)木質(zhì)素的生物合成卻正向調(diào)控棉花的黃萎病抗性，推測(cè)該基因還參與了別的抗病相關(guān)通路的調(diào)控，最終表現(xiàn)出的抗性是多種抗病途徑效果總和抵消后的結(jié)果。He等［28］過(guò)表達(dá)HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子GhHB12后抑制了JA響應(yīng)基因GhJAZ2和GhPR3的表達(dá)，增強(qiáng)了棉花對(duì)大麗輪枝菌的敏感性。此外還有一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因如GhMYB36［29］、GhWRKY70D13［30］、GhATAF1［31］、GhMYB108［32］、GbVIP1［33］、GbERF1［34］、GhWIN2［35］等通過(guò)調(diào)控不同的信號(hào)通路，參與了棉花對(duì)黃萎病的抗性反應(yīng)。

TIFY家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。目前對(duì)于該家族基因在棉花抗病反應(yīng)中的研究主要集中在JAZ亞家族基因，例如He等［36］研究發(fā)現(xiàn)，GhJAZ2通過(guò)負(fù)調(diào)控JA信號(hào)通路并抑制GhbHLH171的轉(zhuǎn)錄活性，在棉花抗病反應(yīng)中扮演一個(gè)負(fù)調(diào)控因子。張祥瑞［37］利用VIGS技術(shù)結(jié)合過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，GhJAZ4同樣參與JA信號(hào)通路的調(diào)控，繼而在棉花抗黃萎病反應(yīng)中作為一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)因子。此外Song等［38］研究發(fā)現(xiàn)，BIN2可以與JAZ亞家族蛋白發(fā)生互作，繼而負(fù)調(diào)控棉花對(duì)大麗輪枝菌的防御反應(yīng)。但目前對(duì)于TIFY亞家族基因參與棉花抗黃萎病反應(yīng)的相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選并克隆出一個(gè)TIFY家族基因GhTIFY9。該基因的ORF長(zhǎng)度為594 bp，編碼197個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為21.65 kD，定位于細(xì)胞核，所編碼蛋白為堿性、親水性、非跨膜蛋白，只含有一個(gè)TIFY結(jié)構(gòu)域，屬于TIFY亞家族。RT-qPCR分析表明該基因響應(yīng)黃萎病菌誘導(dǎo)處理，推測(cè)其可能在棉花抗病反應(yīng)中發(fā)揮一定的作用。利用VIGS技術(shù)抑制該基因表達(dá)后，沉默植株對(duì)黃萎病菌的抗性顯著降低，其病情指數(shù)顯著高于陰性對(duì)照植株。剖稈檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照植株相比，GhTIFY9沉默植株維管束的褐變程度更加嚴(yán)重。莖段恢復(fù)培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，GhTIFY9沉默植株莖段的真菌菌絲數(shù)量明顯多于陰性對(duì)照植株。以上結(jié)果初步表明GhTIFY9正向調(diào)控了棉花抗黃萎病反應(yīng)，但該基因的抗病分子機(jī)制及可能參與的抗病信號(hào)通路仍需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

克隆獲得一個(gè)TIFY轉(zhuǎn)錄因子GhTIFY9，其ORF為594 bp，編碼197個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為21.65 kD，定位于細(xì)胞核，編碼蛋白為堿性、親水性、非跨膜蛋白，屬于TIFY亞家族。抑制GhTIFY9的表達(dá)可以顯著降低棉花對(duì)黃萎病的抗性。