利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與鑒定石斑魚EcBAG3互作因子

蔡佳 梁振宇 黃瑜 魯義善 施鋼 簡紀常

（1. 廣東海洋大學水產(chǎn)學院 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室 南方海洋科學與工程廣東省實驗室（湛江），湛江 524088；2. 廣西科學院 廣西北部灣海洋研究中心 廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學重點實驗室，南寧 530007）

石斑魚作為我國南海諸省與東南亞各國重要的海水經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類，其養(yǎng)殖業(yè)近年來受到病害問題的困擾，其中虹彩病毒病（iridovirus disease）和病毒性神經(jīng)壞死?。╲iral nervous necrosis）便是危害最大和影響最廣的兩種病毒性疫?。?-2］，虹彩病毒感染和神經(jīng)壞死病毒感染能誘導魚類細胞產(chǎn)生凋亡與自噬等不同類型的細胞死亡［3-4］，并且兩類病毒感染誘導的細胞死亡在病毒增殖以及抗病毒免疫調(diào)控的過程中發(fā)揮著重要作用［5-7］，然而魚類細胞死亡調(diào)控因子在病毒感染過程中的作用尚不清楚。因此，探究細胞死亡影響病毒感染的分子機制不僅能更好地了解魚類抗病毒天然免疫反應的分子機制，還能為新型抗病毒策略的制定提供科學依據(jù)。

BAG（Bcl-2 associated athanogene）是一類重要的細胞死亡調(diào)控因子，該家族有6個成員 BAG1-6，其中BAG3在部分正常細胞和腫瘤細胞中被認為是抗凋亡和前自噬因子，通過與Bcl2與HSP70家族蛋白等的相互作用，BAG3能調(diào)節(jié)細胞的凋亡與自噬、增殖、遷移、黏附以及細胞的應激反應［8-10］。此外，BAG3在病毒感染中也扮演了重要的角色［11］。在HIV-1 感染的膠質(zhì)細胞和 T 淋巴細胞中，BAG3 表達上調(diào)，BAG3 沉默明顯降低 Tat 蛋白誘導的 LC3-II水平并增加 sub-G0/G1期的細胞凋亡，這表明BAG3能通過調(diào)節(jié)自噬/凋亡平衡影響病毒的感染［8］；HIV-1 感染后BAG3 表達的增加還可以抑制小膠質(zhì)細胞中 HIV-1 LTR 的轉(zhuǎn)錄［12］；BAG3 沉默則能促進HIV-1 感染誘導的Caspase-3 活化，促進病毒誘導的細胞凋亡［13］。在單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）的感染中，BAG3能促進病毒α蛋白的表達和積累以及病毒的增殖［14］。但是BAG3影響病毒感染的分子互作網(wǎng)絡的相關(guān)報道還相對較少。

本研究團隊在石斑魚脾臟轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選得到了石斑魚BAG3基因（EcBAG3），通過熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)該基因在病毒感染GS細胞后表達上調(diào)（數(shù)據(jù)未發(fā)表），表明該基因可能參與了石斑魚抗病毒感染的免疫反應。為深入研究了解EcBAG3的功能與作用機理，本研究構(gòu)建了石斑魚脾臟細胞（GS）的酵母雙雜交cDNA 文庫，并利用EcBAG3作為誘餌篩選互作蛋白，為闡明EcBAG3及其互作相關(guān)因子影響病毒感染的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

石斑魚脾臟細胞（GS細胞）和攜帶目的基因EcBAG3的PMD18T-EcBAG3質(zhì)粒由本實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、酵母質(zhì)粒提取試劑盒等購自OMEGA公司；酵母雙雜交試劑盒Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System（含酵母菌株、載體、培養(yǎng)基等），及限制性內(nèi)切酶等購自Clontech 公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與雙鏈cDNA合成 采用TRizol法提取石斑魚脾臟細胞總RNA，用1%瓊脂糖凝膠和NanoDrop2000分光光度計檢測其質(zhì)量和濃度。以CDS III/3' PCR Primer為引物，總RNA為模板，利用MMLV Reverse Transcriptase合成cDNA一鏈，以cDNA一鏈為模板，利用50×Advantage 2 Polymerase Mix合成雙鏈cDNA。合成的雙鏈cDNA利用蛋白酶K處理后回收凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雙鏈cDNA與核蛋白酵母雙雜交載體pGADT7的重組和庫容量鑒定 將雙鏈cDNA均一化處理后與雙酶切（NdeI/XhoI）處理線性化的pGADT7載體混合，加入ExnaseTM II，混勻反應體系后，置于37℃反應30 min后冰浴冷卻5 min終止反應。通過電擊轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，轉(zhuǎn)化后的混合物置于37℃，225-250 r/min培養(yǎng)1 h。取轉(zhuǎn)化后細菌原液10 μL稀釋100倍后取50 μL涂布LB平板（抗性Amp+抗性），剩余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度20%存于-80℃，第2天對平板的克隆進行計數(shù)，確定庫容量：CFU/mL= 平板上的克隆數(shù)/50 μL× 100倍×1×103μL，文 庫 總CFU= CFU/mL×文庫菌液總體積（mL）。

1.2.3 EcBAG3誘導質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)EcBAG3序列和pGBKT7 載體序列設計帶酶切位點的特異性引物，其中上游引物帶NdeI 酶切位點（5'-ATCTCAGAGGA GGACCTGCATATGTTTCAGTACTCGAC-3'），下游引物帶SalI 酶切位點（5'- ATGCGGCCGCTGCAGGTC GACTTATGATATCTCCTTTGCC-3'）；并以PMD18TEcBAG3 質(zhì)粒為模板進行PCR 擴增，膠回收目的片段；同時對pGBKT7 載體進行NdeI 和SalI 的雙酶切，并膠回收線性化后的載體；參照試劑盒的操作方法，將目的片段和載體進行連接、轉(zhuǎn)化、挑選單克隆并測序，測序正確的克隆進行質(zhì)粒提取，即為誘餌載體pGBKT7-EcBAG3。

1.2.4 誘餌載體的自激活及毒性檢測 利用pGBKT7-Lam Control Vector和pGADT7-T Control Vector 作為陰性對照，pGBKT7-53 Control Vector 和pGADT7-T Control Vector作為陽性對照，將對照與誘餌載體pGBKT7-EcBAG3分別轉(zhuǎn)化酵母Y2H Gold感受態(tài)細胞，酵母感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化方法參考Yeastmaker Yeast Transformation System 2 操作手冊。將轉(zhuǎn)化液分別涂布在SD/-Trp、SD/-Trp-Leu 缺失培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)2-4 d 后觀察生長情況。通過觀察克隆判斷誘餌載體是否對酵母菌株有毒性，對報告基因是否存在自激活現(xiàn)象。

1.2.5 酵母cDNA 文庫篩選 參照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System操作手冊，采用共轉(zhuǎn)法進行雙雜交文庫篩選，制備3 mL Y2H Gold感受態(tài)，將10 μg酵母文庫質(zhì)粒、5 μg誘餌質(zhì)粒與50 μL預變性兩次后的Carrier DNA混勻后與Y2H Gold感受態(tài)混合，加入2.5 mL的1X PEG/LiAc后混勻，30℃水浴45 min，每15 min搖勻一次，隨后加入160 mL DMSO，混勻后42℃熱激20 min，每10 min上下顛倒混勻一次，700×g離心5 min收集菌體后加入3 mL YPD Plus，30℃培養(yǎng)90 min，700×g離心5 min后加入0.9% NaCl 溶液至6 mL重懸菌體，取100 μL按1/10、1/100涂 布100 mm SD/-Trp-Leu平 板，用于計算轉(zhuǎn)化效率，剩余菌液涂布于添加了SD/-Trp-Leu/X-α-Gal/AbA平 板 上（150 mL/塊，約50塊），30℃倒置培養(yǎng)3-5 d 后觀察單克隆。

1.2.6 互作蛋白的分離鑒定與測序分析 挑取上述QDO 四缺培養(yǎng)基中長出的單克隆，利用酵母質(zhì)粒提取試劑盒提取誘餌與互作蛋白表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，涂布于LB 固體培養(yǎng)基上（含50 μg/mL Ampicillin），37℃，260 r/mim振 蕩 培養(yǎng)20 h后提取質(zhì)粒，隨后進行測序。

將插入片段進行測序，根據(jù)測序結(jié)果去除重復或結(jié)構(gòu)異常的克??；將篩選后的插入片段在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blastn 比對分析，找到與插入片段同源性最高的基因序列；利用該基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.arabidopsis.org/）中進行Blastx 比對分析，找到其在數(shù)據(jù)庫中同源性最高的蛋白，通過注釋對插入片段的功能進行推測。

1.2.7 互作蛋白的一對一驗證 采用與1.2.5相同的方法，取200 ng測序后的質(zhì)粒與100 ng的EcBAG3誘餌質(zhì)粒、與10 μL Carrier DNA混勻后轉(zhuǎn)化Y2H Gold，轉(zhuǎn) 化 液 涂 布 在SD/-Trp-Leu-His/-Ade/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-5 d后觀察是否有藍色的陽性克隆。

2 結(jié)果

2.1 石斑魚脾臟細胞總RNA質(zhì)量檢測

利用Trizol法提取石斑魚脾臟細胞（GS）總RNA，在1%瓊脂糖膠中檢測總RNA的質(zhì)量。如圖1所示，28S和18S條帶清晰，無明顯彌散條帶，說明總RNA質(zhì)量較好，無明顯降解。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠檢測Fig. 1 Agarose gel electrophoresis for the detection of total RNA

2.2 酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建和質(zhì)量評估

將雙鏈cDNA連接到pGADT7載體后，電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中獲得酵母雙雜交cDNA文庫，取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物10 μL稀釋100倍后取50 μL涂布到平板上，計算得到初始文庫容量為5.6×106CFU。隨機挑取24個單克隆進行進行PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖2所示，24個單克隆均能擴增出條帶，重組率為100%，平均長度大于750 bp，且具有良好的多態(tài)性。

圖2 文庫部分插入片段瓊脂糖凝膠檢測Fig. 2 Agarose gel electrophoresis for the detection of partial inserted cDNA fragments in library

2.3 誘餌蛋白酵母雙雜交載體的構(gòu)建及其自激活檢測

將含有pGBKT7 空載體與pGBKT7-EcBAG3誘餌載體的Y2H Gold 酵母涂布于SD/-Leu/-Trp/X-αgal上生長，pGBKT7-EcBAG3質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入酵母菌株 后 在SD/-Leu/-Trp/-His/X-α-gal和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/AbA平板上不生長（圖3），說明pGBKT7-EcBAG3在Y2H Gold酵母菌株中沒有自激活活性，可進行后續(xù)篩選實驗。

圖3 pGBKT7-EcBAG3自激活檢測Fig. 3 Self-activation verification of pGBKT7-EcBAG3

2.4 EcBAG3互作蛋白的初步篩選及其序列分析

將GS細胞的酵母cDNA文庫質(zhì)粒和pGBKT7-EcBAG3共轉(zhuǎn)化入酵母感受態(tài)細胞Y2H Gold。將酵母菌液涂布于SD/-Leu-Trp-Ade-His培養(yǎng)基上進行篩選，再將生長的陽性克隆挑到SD/-Leu-Trp-Ade-His/X-α-Gal/Aba培養(yǎng)皿上（圖4），共獲得83個轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色的陽性克隆，測序后經(jīng)過序列分析，去除重復序列和測序信號為雙峰的結(jié)果，獲得7個可能與EcBAG3互作的候選蛋白（表1），涉及免疫調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、脅迫響應、信號轉(zhuǎn)導、細胞發(fā)育與遷移等多個方面。

圖4 SD/-Leu-Trp-Ade-His/X-α-Gal/Aba平板上篩選獲得的部分陽性克隆Fig. 4 Partial positive clones screened from SD/-Leu-Trp-Ade-His/X-α-Gal/Aba plates

表1 酵母雙雜交陽性克隆比對結(jié)果Table 1 Alignments of positive clones screened through yeast two hybrid

2.5 互作蛋白的一對一驗證

將2.4中篩選出的7個互作候選基因克隆的質(zhì)粒提取出來后與pGBKT7-EcBAG3、Carrier DNA共轉(zhuǎn)化至Y2H Gold酵母菌種，進行一對一驗證。結(jié)果顯示除了候選蛋白“CCN family member 1”，其余蛋白的候選轉(zhuǎn)化酵母菌在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上均能正常生長且呈藍色（圖5）。

圖5 EcBAG3與候選互作蛋白驗證Fig. 5 Verification of EcBAG3 and candidate interacting protein

3 討論

目前篩選鑒定相互作用蛋白的方法主要有酵母雙雜交、Co-IP、pull-down 等［15］，其中酵母雙雜交系統(tǒng)常用的方法之一，但是該方法篩選獲得的假陽性較高，需要一對一驗證等技術(shù)手段進一步確認。本實驗以石斑魚脾臟細胞（GS）構(gòu)建cDNA酵母雙雜交文庫，使用EcBAG3作為誘餌蛋白初步篩選出83個單克隆并進行了測序，通過分析測序結(jié)果去除了測序結(jié)果相同以及測序信號為雙峰的克隆，獲得了7個備選互作基因，進一步的驗證結(jié)果顯示有1個克隆未能正常生長，剩余的6個克隆測得的序列僅為功能結(jié)構(gòu)而并非完全的編碼區(qū)，因此后續(xù)還需要克隆互作基因全長再通過Co-IP、亞細胞定位等技術(shù)進行確認。

在篩選到的7個互作蛋白中，HSP70、HSC71與BAG3的相互作用已被廣泛報道，HSP家族蛋白與BAG3的互作能介導胞內(nèi)蛋白的聚集與清除［16-17］、調(diào)控細胞的自噬與凋亡［18］等過程。病毒感染能誘導胞內(nèi)的未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR），引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力啟動炎癥反應［19］，細胞自噬則能清除細胞中過度累積的蛋白，同時調(diào)節(jié)宿主抗病毒免疫反應、病毒的侵染與增殖［20-21］。此外，哺乳動物HSC71與HSP70還參與了病毒的復制、裝配與釋放［22］。Rao等［23］的研究表明草魚HSP70能增強HMGB1b與自噬因子Beclin 1互作來促進自噬介導的抗病毒免疫反應，表明魚類HSP蛋白對細胞死亡的調(diào)控在魚體抵御病毒感染的過程中也扮演著重要的角色。Ec-BAG3也是真核細胞中一類重要的細胞死亡調(diào)控因子，其與HSP的互作在病毒感染中的作用可能與Rao等的發(fā)現(xiàn)類似。Filamin蛋白是一類肌動蛋白交聯(lián)蛋白，在細胞受到外界壓力時該蛋白通過折疊狀態(tài)的改變維持激動蛋白的柔性，BAG3則能通過監(jiān)測Filamin狀態(tài)的改變及時活化自噬清除外力導致的受損蛋白［24］，F(xiàn)ilamin A蛋白的表達還與病毒侵染與增殖相關(guān)［25-26］。與Filamin類似，Collagen作為細胞外基質(zhì)蛋白，其表達有助于病毒的吸附及在細胞間的傳播［27-28］。篩選蛋白剩余的CCN1、ZNF、SOCS則參與病毒感染過程中炎癥通路、干擾素通路的調(diào)節(jié)，從而影響病毒的增殖［29-31］，但是目前關(guān)于BAG3與這3個蛋白的關(guān)聯(lián)還未見報道，因此在本實驗的基礎上，進一步開展EcBAG3與候選互作蛋白的作用模式研究，對深入了解EcBAG3的功能及其在病毒感染過程中的作用機理具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究在用石斑魚脾臟細胞構(gòu)建酵母雙雜交cDNA 文庫后，利用石斑魚EcBAG3作為誘餌篩選到了脾臟細胞中與EcBAG3互作的蛋白。文庫容量為5.6×106CFU，插入片段大小均在750 bp以上，重組率為100%。獲得的候選互作蛋白提示BAG3 可能通過調(diào)控細胞死亡、細胞骨架的重排以及抗病毒免疫反應來影響病毒的侵染與增殖。