植物脅迫相關(guān)microRNA研究進展

王楠楠 王文佳 朱強

（福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福州 350000）

miRNA是一種植物體內(nèi)廣泛存在的內(nèi)源性非編碼RNA。1993年，Lee等［1］在秀麗隱桿線蟲中首次發(fā)現(xiàn)動物miRNA lin-4，隨后在2002年，Reinhart等［2］在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)了16條miRNA。隨著高通量測序和生物信息技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多miRNA被發(fā) 現(xiàn)，截 至2019年，miRBase（http://mirbase.org/）已經(jīng)收錄了來自271個物種的38 598條miRNA前體和48 860條成熟體［3］。近年來，越來越多的研究表明miRNA在植物的諸多生物學(xué)過程中都起著重要作用，其中miRNA在植物生長發(fā)育過程中的重要作用已經(jīng)由前人較為詳細(xì)的總結(jié)［4-5］。本文側(cè)重闡述挖掘miRNA在植物脅迫響應(yīng)過程中的作用。

1 miRNA的產(chǎn)生及作用方式

1.1 miRNA的產(chǎn)生

miRNA的基因（MIR）被RNA聚合酶II（Pol II）轉(zhuǎn)錄成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初級miRNA（pri-miRNA）。pri-miRNA在RNase III家族酶DICER-LIKE1（DCL1）的作用下加工形成miRNA/miRNA*雙鏈體。雙鏈體的3'端被甲基轉(zhuǎn)移酶HUA ENHANCER1（HEN1）2'-O-甲基化。之后，雙鏈體中的一條鏈被整合到ARGONAUTE1（AGO1）中以形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）。以下將詳細(xì)介紹miRNA復(fù)雜的產(chǎn)生過程。

1.1.1MIR轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄調(diào)控 Mediator作為一種通用的轉(zhuǎn)錄共激活因子，有助于將Pol II募集到MIR基因座［6］。還存在一些其他幫助MIR轉(zhuǎn)錄的蛋白，包括NEGATIVE ON TATA LESS2（NOT2）、含有MYB結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合蛋白CELL DIVISION CYCLE 5（CDC5）和被認(rèn)為有助于轉(zhuǎn)錄延伸的Elongator復(fù)合物［7-9］。NOT2、CDC5和Elongator都 與Pol II以 及miRNA前體加工復(fù)合物相互作用。MIR轉(zhuǎn)錄中的Pol II活性還受到磷酸化調(diào)節(jié)［10］。

1.1.2 miRNA前體加工 pri-miRNA由包含DCL1、HYPONASTIC LEAVES1（HYL1）和SERRATE（SE）作為核心成分的切割復(fù)合物加工，以產(chǎn)生成熟的miRNA/miRNA*雙鏈體［11］。DCL1起到剪切的作用，將pri-miRNA剪切成21-nt的miRNA/miRNA*雙鏈體，HYL1與DCL1相互作用以促進有效和精確的primiRNA的加工［12］。SE被認(rèn)為是擬南芥miRNA加工復(fù)合體的核心成員，SE突變導(dǎo)致成熟miRNA水平降低、pri-miRNA水平增加以及pri-miRNA剪切缺陷［13］。

1.1.3 miRNA穩(wěn)定化和RISC形成 miRNA/miRNA*雙鏈體的3'-末端被HEN1 2'-O-甲基化以穩(wěn)定。HEN1最初是在擬南芥中作為甲基轉(zhuǎn)移酶被發(fā)現(xiàn)的，它可以特異性地甲基化小RNA［14］。擬南芥HEN1-small RNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)表明小RNA雙鏈體與HEN1雙鏈RNA結(jié)合域（dsRBD）結(jié)合，其中一個末端位于甲基轉(zhuǎn)移酶（MTase）活性位點并依賴于Mg2+甲基化［15］。

隨后，miRNA雙鏈體的一條鏈被選為引導(dǎo)鏈，而另一條鏈則被降解。RISC的形成包括4個部分。第一步，AGO1和HEAT SHOCK PROTEIN 90（HSP90）的二聚體形成復(fù)合物。第二步，三磷酸腺苷（ATP）與HSP90的結(jié)合引起AGO1構(gòu)象變化，從而允許雙鏈體結(jié)合到AGO1-HSP90蛋白復(fù)合物中。第三步，ATP水解誘導(dǎo)HSP90從AGO1解離。最后，HSP90解離引起的AGO1構(gòu)象變化去除非引導(dǎo)鏈并形成成熟RISC［16］。

目前尚不清楚miRNA是否在RISC形成之前被輸送至細(xì)胞質(zhì)。在早期模型中，miRNA/miRNA*雙鏈體通過HASTY運輸至細(xì)胞質(zhì)，然后裝載到AGO1上［17］。然而，最近提出了另一種模型，即AGO1的裝載發(fā)生在細(xì)胞核中［18］。

1.2 miRNA的作用方式

植物miRNA通過兩種主要機制在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因：mRNA的剪切和翻譯抑制［19］。在植物中，miRNA與靶標(biāo)mRNA具有近乎完美的互補性，因此，對轉(zhuǎn)錄本剪切被認(rèn)為是植物miRNA的主要作用方式。然而，這是一種誤解。雖然高度互補的序列有利于對mRNA的切割，但它也同樣發(fā)揮翻譯抑制的作用。事實上，經(jīng)過實驗驗證，靶基因也會經(jīng)歷miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制［20］。除了mRNA切割和翻譯抑制外，一些miRNA還觸發(fā)一些特殊靶基因轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生次級siRNA（phasiRNAs），成熟的phasiRNA通過堿基互補配對原理在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用，這是植物中普遍且保守的現(xiàn)象［21］。

2 miRNA參與脅迫響應(yīng)

研究表明，miRNA在多種生物學(xué)過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，包括植物的發(fā)育、代謝、非生物脅迫以及病原體防御等過程（圖1）。環(huán)境脅迫能誘導(dǎo)植物在表型和生理生化上產(chǎn)生一系列的變化以適應(yīng)其正常生長，例如在表型上調(diào)整植株的大小、葉片大小及卷曲程度、根的生長情況、氣孔開合以及細(xì)胞大小等；生理生化上表現(xiàn)在次級代謝物積累、光合作用的抑制、呼吸作用的加強以及一些抗氧化酶的激活等。并且為了適應(yīng)環(huán)境，植物也進化出各種抗逆機制，例如脫落酸（abscisic acid，ABA）合成、活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除、離子平衡、乙烯反應(yīng)和調(diào)節(jié)下游防御反應(yīng)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑等。探究miRNA在植物響應(yīng)環(huán)境脅迫過程中的分子機制，有利于未來利用基因工程技術(shù)提高植物抗性、改良植物品質(zhì)。

圖1 miRNA在脅迫響應(yīng)過程中的作用Fig. 1 Role of microRNA in plant stress responses

2.1 非生物脅迫

2.1.1 干旱脅迫 干旱是決定植物生產(chǎn)力和分布的重要環(huán)境因素之一。miR156是植物中最早被發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，它與SQUAMOSA-promoter binding like（SPL）轉(zhuǎn)錄因子的相互關(guān)系在植物中普遍保守。玉米miR156在煙草內(nèi)過表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性，進一步研究表明，抗旱性的提高與脯氨酸等次級代謝物的積累以及抗氧化酶表達(dá)量升高有關(guān)［22］。番茄miR159也可通過調(diào)節(jié)MYB33的轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)脯氨酸和腐胺的積累從而幫助植物提高抗旱性［23］?；ㄇ嗨刈鳛橐环N次級代謝產(chǎn)物通過清除ROS以保護植物免受脅迫。在擬南芥、水稻、紫花苜蓿以及楊樹中，都存在miR156/SPL通過調(diào)節(jié)花青素的積累水平響應(yīng)植物干旱脅迫的機制［24-26］。其中，苜蓿SPL13可以直接與編碼花青素生物合成過程關(guān)鍵酶基因DIHYDROFLAVONOL-4-REDUCTASE（DFR）的啟動子區(qū)域相結(jié)合調(diào)節(jié)其表達(dá)。

1.1.1納入標(biāo)準(zhǔn) （1）有高血壓病史，或者正在服用降壓藥者。（2）明顯心律不齊或者心房顫動者。（3）血脂異常者。（4）吸煙者。（5）無體育運動者。（6）糖尿病者。（7）BMI（身體指數(shù)）在26kg/m2以上者。（8）有腦卒中家族史者。

氣孔是植物葉片表皮中的“窗口”，在植物與環(huán)境之間的氣體交換中起核心作用，氣孔的開關(guān)受環(huán)境信號和內(nèi)源性激素調(diào)節(jié)進而影響植物對干旱脅迫的反應(yīng)和耐受性。而ABA作為一種內(nèi)源性植物激素，是調(diào)節(jié)水分流失和氣孔開合的關(guān)鍵激素。有研究表明Auxin response factors 10（ARF10）作為miR160的靶基因通過影響氣孔開合進而參與番茄干旱脅迫過程，35S∶mSlARF10轉(zhuǎn)基因番茄表現(xiàn)出葉片變窄、氣孔變大等表型，SlARF10不僅影響ABA合成，而且也影響氣孔發(fā)育和水通道蛋白基因（AQPs）表達(dá)，這兩者協(xié)同作用可以控制番茄葉片水分的流失［27］。miR393-OE（miR393 overexpressing transgenic line）表現(xiàn)出氣孔密度的增加以及保衛(wèi)細(xì)胞長度的減少，而缺失型突變體表現(xiàn)出相反的表型，這可能與miR393靶基因ARF5以及氣孔發(fā)育相關(guān)基因EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 1（EPF1）、SPEECHLESS（SPCH）以及MUTE的沉默有關(guān)。miR393-OE對干旱處理更為敏感，能積累多于野生型的丙二醛（malondialdehyde，MDA）和過氧化氫（H2O2），同時還能抑制ABA在葉片的積累。這些結(jié)果也證明了miR393通過與ABA之間的相互作用以及調(diào)控氣孔密度從而響應(yīng)植物干旱脅迫［28］。Zhao等［29］構(gòu)建的過表達(dá)Osa-miR393a的轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎表現(xiàn)出與氣孔密度和表皮致密相關(guān)的干旱脅迫耐受性的增強，還確定了miR393的兩個靶標(biāo)Auxin signalling F-BOX 2（AsAFB2）和TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1（AsTIR1）。獨腳金內(nèi)酯是植物地上部分適應(yīng)干旱脅迫所需的一種植物激素。對番茄施加外源的獨腳金內(nèi)酯誘導(dǎo)miR156的積累，miR156-OE和獨腳金內(nèi)酯的處理都會使植物氣孔導(dǎo)度降低以及ABA敏感性增加［30］。而miR398c卻負(fù)向調(diào)控大豆的抗旱性，過表達(dá)miR398c通過下調(diào)過氧化物酶體相關(guān)基因（GmCSD1a/b、GmCSD2a/b/c和GmCCS）的表達(dá)削弱其清除ROS的能力，引起電解質(zhì)泄漏和氣孔打開［31］。

植物通過表型的改變以適應(yīng)干旱脅迫，例如改變根構(gòu)型以更好的吸收土壤中的水分、調(diào)整葉片大小及卷曲程度以減輕水分蒸發(fā)等。研究人員在擬南芥中鑒定出miR167的新靶點IAA-Ala Resistant 3（IAR3），IAR3具有將非活性形式的生長素水解并釋放出活性形式的功能。干旱脅迫下miR167表達(dá)量下降導(dǎo)致IAR3積累從而提高生長素（auxin）水平以促進側(cè)根生成［32］。Yang等［33］在擬南芥中研究了miR160和miR165/166之間的相互作用及其對擬南芥葉片發(fā)育和耐旱性的影響。發(fā)現(xiàn)STTM160蓮座葉呈現(xiàn)明顯的鋸齒狀，STTM165/166呈現(xiàn)出嚴(yán)重的向上卷曲，而STTM160×165/166呈現(xiàn)出輕微的向下卷曲。研究結(jié)果還顯示，miR160指導(dǎo)ARF通過生長素信號途徑促進葉片發(fā)育，而miR165/166介導(dǎo)的HD-ZIP IIIs通過ABA信號途徑賦予植物耐旱性。在干旱脅迫下，異源表達(dá)OsmiR408的轉(zhuǎn)基因黑麥草與野生型相比，表現(xiàn)出葉片卷曲、氣孔凹陷等表型，這與其保持較高的葉片相對含水量、較低的電解質(zhì)滲透率和較少的脂質(zhì)氧化相關(guān)，使轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更強的抗旱能力［34］。

2.1.2 鹽脅迫 土壤鹽堿化是植物面臨的一種非常普遍的非生物脅迫，它影響了世界上約6%的土地和23%的耕地。鹽堿化嚴(yán)重影響了作物的生存環(huán)境和產(chǎn)量，造成了相當(dāng)大的經(jīng)濟損失。植物受到鹽脅迫會顯著影響多種內(nèi)源性信號分子的水平，包括ABA、乙烯、赤霉素（gibberellin，GA）、ROS、一氧化氮（NO）等。這些信號分子及其下游信號成分已被證明在植物鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。擬南芥miR394及其靶基因LEAF CURLING RESPONSIVENESS（LCR）將ABA與鹽脅迫響應(yīng)聯(lián)系起來。miR394受ABA誘導(dǎo)而積累，LCR則相反。鹽脅迫實驗表明miR394作為植物鹽脅迫響應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，過表達(dá)促進ABA引起的氣孔關(guān)閉、ROS的積累以及ABA響應(yīng)基因的表達(dá)［35］。過表達(dá)Sm-MIR408的轉(zhuǎn)基因煙草則能在促進種子萌發(fā)的同時減少鹽脅迫下ROS的積累，并且增強抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄水平及其酶活性［36］。乙烯信號途徑主要通過調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生和ROS清除機制來響應(yīng)鹽脅迫反應(yīng)。Liu等［37］在柳枝稷耐鹽性實驗研究中發(fā)現(xiàn)，miR319-OE轉(zhuǎn)基因柳枝稷通過抑制靶基因PvPCF5的表達(dá)進而下調(diào)蛋氨酸循環(huán)中關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而促進乙烯合成相關(guān)基因表達(dá)以提高耐鹽性。

在研究匍匐剪股穎植物響應(yīng)鹽脅迫的分子機制時發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Osa-miR528的轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎節(jié)間縮短、分蘗數(shù)增加，通過改善植物保水性、細(xì)胞膜完整性、葉綠素含量，維持鉀離子穩(wěn)態(tài)、過氧化氫酶活性以及降低抗壞血酸氧化酶（ascorbic acid oxidase，AAO）活性而提高植物對鹽脅迫的耐受性［38］。過表達(dá)Osa-miR393a的轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎通過正向調(diào)控離子轉(zhuǎn)運相關(guān)基因（AsNHX1）的表達(dá)，促進轉(zhuǎn)基因植物鉀離子的吸收以達(dá)到耐鹽性增強的作用［29］。Yuan等［39］對miR396與耐鹽性之間機制進行研究時發(fā)現(xiàn)，Osa-miR396c轉(zhuǎn)基因植物與野生型相比，表現(xiàn)出生物量減少、節(jié)間減短、葉片面積減少、葉脈數(shù)量減少、單位面積表皮細(xì)胞減少的表型，而在高鹽脅迫下表現(xiàn)出保水性增強、葉綠素含量增加、細(xì)胞膜完整性高和鈉離子外排增強等耐鹽性等表型。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過參與ABA合成、ROS清除、離子平衡和乙烯反應(yīng)途徑參與鹽脅迫耐受相關(guān)的生物學(xué)途徑以保護植物免受鹽脅迫損害。然而關(guān)于WRKY上游的調(diào)控機制尚未可知。近期在蘋果鹽脅迫與miR156的研究中發(fā)現(xiàn)，miR156-OE減弱植物耐鹽性，其靶基因SPL13的過表達(dá)能增強耐鹽性，同時揭示了SPL13直接與WRKY100相互作用以增強植物耐鹽性［40］。

2.1.3 低溫脅迫 低溫脅迫通過影響光合作用、呼吸作用以及ROS的產(chǎn)生和積累而對植物產(chǎn)生一系列負(fù)面作用。miR319已被證明可靶向TEOSINTE BRANCHED/CYCLOIDEA/PCF（TCP）轉(zhuǎn) 錄 因 子，TCP基因家族是高等植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，這類轉(zhuǎn)錄因子通過控制細(xì)胞增殖以參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的多個過程，它們的特征是在N末端具有高度保守的59個氨基酸構(gòu)成的TCP結(jié)構(gòu)域。OsamiR319的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)下調(diào)，其靶基因OsPCF6和OsTCP21則相反。Osa-miR319過表達(dá)導(dǎo)致植物對低溫脅迫耐受性增強，這可能與脯氨酸的積累、OsPCF6和OsTCP21調(diào) 節(jié) 的ROS的 清 除 以 及以一些低溫響應(yīng)基因表達(dá)量升高有關(guān)［41］。在甜瓜中，低溫誘導(dǎo)miR319c表達(dá)量降低，引起TCP2介導(dǎo)的ELONGATED HIPOCOTYL 5（HY5）水平增加，HY5轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)花青素生物合成途徑中關(guān)鍵成分積累從而響應(yīng)低溫脅迫［42］。番茄miR319d過表達(dá)也增強其冷脅迫耐受性，具體表現(xiàn)在電解質(zhì)滲透率、MDA濃度、O2-濃度和H2O2濃度的降低以及葉綠素含量和Fv/Fm值的增高，這可能與FeSOD、CuZnSOD和過氧化氫酶（CAT）基因表達(dá)水平升高以及GAMYB-like1表達(dá)水平降低有關(guān)［43］。

OsmiR528過表達(dá)增強了擬南芥、松樹和水稻的冷脅迫耐受性。OsmiR528通過靶向F-box進而降低轉(zhuǎn)錄因子OsMYB30的表達(dá)。據(jù)報道，OsMYB30促 進β淀 粉 酶（β-amylase，BMY）基 因OsBMY2、OsBMY6和OsBMY10表達(dá)從而增加細(xì)胞中糖含量以增強植物冷脅迫耐受性［44］。香蕉miR528在冷脅迫下顯著下調(diào)，其靶基因多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）基因的表達(dá)量則上調(diào)100倍以上，這引起ROS含量激增，使得香蕉果實果皮褐變［45］。水稻miRNA156過表達(dá)導(dǎo)致擬南芥、松樹和水稻在冷脅迫下細(xì)胞活力和生長速率增加。OsmiR156通過靶向OsSPL3增加植物耐寒性，OsSPL3正向調(diào)節(jié)OsWRKY71的表達(dá)，而OsWRKY71是轉(zhuǎn)錄因子OsMYB2和OsMYB3R-2的 負(fù) 調(diào) 節(jié) 因 子。OsMYB2和OsMYB3R-2分別通過激活OsLEA3、OsRab16A、OsDREB2A和OsKNOLLE2、OsCTP1、OsCycB1.1、OsCycB2.1和OsCDC20.1表達(dá)來抵消低溫脅迫所帶來的負(fù)面影響［46］。

2.1.4 高溫脅迫 高溫作為一個重要的環(huán)境因素，會對植物生長、發(fā)育、繁殖等過程產(chǎn)生負(fù)面影響。植物響應(yīng)高溫脅迫是一個復(fù)雜的過程，涉及各種代謝和生化過程。苜蓿中的相關(guān)研究證明miR156參與植物熱脅迫響應(yīng)過程，mi156-OE轉(zhuǎn)基因植物通過抑制靶基因SPL13從而增強其耐熱性［47］。Arshad等［48］測量了熱脅迫下野生型和miR156-OE轉(zhuǎn)基因植物的各項生理參數(shù)，并收集了葉組織進行蛋白組分析，發(fā)現(xiàn)miR156-OE植物中的脯氨酸和抗氧化劑含量高于野生型，miR156-OE植物特有的蛋白質(zhì)與多種功能有關(guān)，包括代謝、光合作用、應(yīng)激反應(yīng)和植物防御。

miR159/MYB在小麥和白菜的熱應(yīng)激過程中都起重要作用，小麥miR159過表達(dá)與靶基因GAMYB表達(dá)的下調(diào)相結(jié)合會導(dǎo)致其耐熱性的降低，但單獨過表達(dá)GAMYB卻沒有提高幼苗的耐熱性，所以，miR159/GAMYB途徑與熱應(yīng)激耐受性之間的因果關(guān)系還需要進一步研究［49-50］。此外，過表達(dá)miR160可以增加棉花對高溫脅迫的敏感性，這與ARF10和ARF17表達(dá)受到抑制從而激活導(dǎo)致花藥開裂的Auxin信號通路有關(guān)［51］。

2.1.5 養(yǎng)分脅迫 氮是植物中許多重要化合物的主要成分，參與植物一系列生化反應(yīng)，并在作物的生物量積累和產(chǎn)量提升中發(fā)揮重要作用。鉀則參與滲透調(diào)節(jié)、光合作用、物質(zhì)運輸?shù)冗^程，可以提高植物的抗逆性。因此，缺乏這兩種元素會導(dǎo)致植物生長受到限制。對花生的營養(yǎng)缺乏機制研究中發(fā)現(xiàn)，氮和鉀缺乏會影響植物的生長，使植物表現(xiàn)出地上和地下部分組織干重降低，根長、根表面積、根體積、根活力降低和根呼吸減弱。氮缺乏顯著降低初生根長度和側(cè)根數(shù)量，這可能與miR160、miR167、miR393和miR396的上調(diào)以及AFB3和GRF的下調(diào)有關(guān)。主根和側(cè)根對缺鉀的反應(yīng)與缺氮條件相反，表現(xiàn)為miR156、miR390、NAMATAF-CUC 4（NAC4）、ARF2和AFB3的 上 調(diào)，以 及miR160、miR164、miR393和SPL10的下調(diào)，這些可能有助于缺鉀條件下初生根和側(cè)根的生長［52］。

磷是植物不可或缺的一種常量營養(yǎng)元素，在發(fā)育和代謝過程中都很重要。雖然土壤中磷含量豐富，但大多數(shù)土壤中磷與鈣、鐵和鋁等元素結(jié)合形成不溶性的化合物，限制了植物對磷的獲取。缺磷是植物生長和發(fā)育過程中的常見脅迫。miR156/SPL3在擬南芥磷吸收過程中發(fā)揮著重要作用，過表達(dá)miR156的轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比磷吸收速度加快，并在缺磷狀態(tài)下能減少根際酸化和花青素積累［53］。據(jù)報道，miR399是磷饑餓信號途徑中的重要組分。最早在擬南芥中闡明miR399在磷饑餓信號傳導(dǎo)中的功能，在磷饑餓條件下，miR399的表達(dá)被顯著提高，而靶基因ubiquitin-conjugating E2 enzyme（PHO2）表達(dá)降低。為進一步研究miR399的功能，Hu等［54］對OsmiR399過表達(dá)植物進行了基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，除了磷饑餓反應(yīng)基因外，許多參與鐵、鉀、鈉和鈣吸收的基因也被顯著上調(diào)，鐵、鉀、鈉和鈣的濃度也有所增加。此外，OsmiR399下游靶標(biāo)LTN1（OsPHO2）的功能喪失也導(dǎo)致這些營養(yǎng)元素濃度增加以及相關(guān)基因的上調(diào)。miR399-PHO2途徑參與植物對磷缺乏的適應(yīng)性反應(yīng)同樣在玉米中存在［55］。

硫元素參與植物發(fā)育的許多重要機制和途徑。土壤中的硫元素主要以硫酸鹽（SO4-）形式存在并被吸收入根組織，通過脈管系統(tǒng)輸送至地上部分，被還原成亞硫酸鹽后在葉綠體和線粒體等亞細(xì)胞器官中硫化，用于半胱氨酸和蛋氨酸生物合成。而空氣中的SO2是一種常見的污染物，在植物中，SO2主要通過葉組織氣孔吸收，然后水合形成亞硫酸鹽和亞硫酸氫鹽。Yuan等［56］發(fā)現(xiàn)Osa-miR395的轉(zhuǎn)錄水平在硫酸鹽缺乏條件下增加，這與前人在擬南芥中的研究結(jié)果相同。將Osa-miR395h在煙草中異源過表達(dá)損害了煙草硫酸鹽穩(wěn)態(tài)，NtaSULTR2作為miR395的靶點，屬于低親和力硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白。Li等［57］發(fā)現(xiàn)擬南芥暴露在SO2中，miR398的表達(dá)下調(diào)，而靶基因銅或鋅超氧化物歧化酶（Cu or Zn superoxide dismutases，CSD）的轉(zhuǎn)錄水平增加，同時SOD活性隨著CSD轉(zhuǎn)錄水平的增加而增強，表明miR398在響應(yīng)SO2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中起重要作用。然而，miR395的表達(dá)受SO2影響增加，下游靶基因APS3和APS4以及SULTR2；1的轉(zhuǎn)錄水平在擬南芥中降低，表明miR395在SO2暴露期間硫酸鹽同化和易位的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。

2.1.6 重金屬脅迫 重金屬元素被認(rèn)為是植物的生長和產(chǎn)量的主要限制因素，包括必需金屬元素和非必需金屬元素。多種生理過程需要必需金屬元素，例如鋅、錳和銅等，其他一些金屬，如鎘、鉛或汞則是非必需金屬元素。植物重金屬中毒的顯著特征是酶反應(yīng)的中斷和氧化應(yīng)激。天然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白（natural resistance-associated macrophage proteins，NRAMP）是植物中不可或缺的膜轉(zhuǎn)運蛋白，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運必需金屬元素如錳或鐵以及非必需金屬如鎘或鉛。在甘藍(lán)型油菜中發(fā)現(xiàn)了一個組成型基因BnNRAMP1b，它受鎘脅迫而上調(diào)。結(jié)合降解組相關(guān)信息驗證了BnNRAMP1b作為miR167的靶基因參與金屬脅迫響應(yīng)［58］。過表達(dá)miR156的轉(zhuǎn)基因擬南芥減少地上部分重金屬鎘積累，增強了植物對鎘脅迫的耐受性。在鎘脅迫下，miR156OE具有初生根增長、生物量和葉綠素含量增高、抗氧化酶活性增強、ROS水平降低以及鎘轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達(dá)量降低的表現(xiàn)，而MIM156則相反［59］。

miR393在植物根組織鋁中毒脅迫中具有一定的生物學(xué)功能。土壤中鋁離子抑制大麥根尖miR393的表達(dá)，miR393的過表達(dá)可以消除鋁離子對根伸長的抑制以及ROS積累所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。此外，miR393過表達(dá)減弱了外源生長素對鋁誘導(dǎo)的根生長抑制的影響，并下調(diào)了鋁脅迫下生長素響應(yīng)基因的表達(dá)，這意味著miR393是通過改變大麥中的生長素信號輸出來調(diào)節(jié)根對鋁的敏感性［60］。

葡萄miR398通過調(diào)節(jié)靶基因VvCSD1和VvCSD2的表達(dá)，調(diào)控其對銅脅迫的響應(yīng)過程。Vv-miR398的表達(dá)受到不同濃度銅脅迫抑制，而VvCSD1和VvCSD2基因的表達(dá)增強。與野生型相比，VvCSD過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株具有更高的銅耐受性，并且在高濃度銅脅迫條件下降低ROS積累、提高SOD活性，這表明VvCSD增強ROS清除系統(tǒng)從而保護植物免受更多氧化損傷［61］。

2.2 生物脅迫

植物病原體包括害蟲、真菌、細(xì)菌以及病毒，它們嚴(yán)重威脅植物的正常發(fā)育。植物免疫系統(tǒng)通過上調(diào)或下調(diào)miRNA的表達(dá)來誘導(dǎo)下游轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)以抵抗病原體的入侵。Caruana等［62］發(fā)現(xiàn)miR167通過ARF6和ARF8調(diào)節(jié)植物對病原體的防御反應(yīng)。miR167響應(yīng)細(xì)菌病原體假單胞桿菌而差異表達(dá)，其過表達(dá)賦予植物更高的抗菌性。這種抗性與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、水楊酸信號傳導(dǎo)及氣孔運動有關(guān)。此外，miR167-OE轉(zhuǎn)基因植物的系統(tǒng)性獲得抗性（systemic acquired resistance，SAR）反應(yīng)也受到嚴(yán)重?fù)p害，進一步研究表明SAR的激活需要完整的生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。總之，miR167在激素平衡以及植物生物防御過程中起著重要作用。

miR169在植物生物脅迫過程同樣發(fā)揮著重要的作用。擬南芥miR169靶基因CLAVATA1（CLV1）和CLAVATA2（CLV2）的突變賦予植物更強的抗病性，而miR169的過表達(dá)能夠消除clv突變體的抗病性表型［63］。水稻miR169過表達(dá)植株對病菌的侵染高度敏感，這與防御相關(guān)基因表達(dá)量的降低以及感染部位缺乏過氧化氫積累有關(guān)。此外，miR169通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子Y（Nuclear factor Y，NF-YA）基因的表達(dá)而在對病菌的免疫過程中起負(fù)向調(diào)節(jié)因子的作用［64］。然而，香蕉miR169a和miR169b表達(dá)量在被病原體侵染后上調(diào)并在香蕉抗性品種中保持較高表達(dá)水平［65］。

NAC4作為miR164的靶基因之一，在擬南芥響應(yīng)生物脅迫的細(xì)胞程序性死亡中發(fā)揮作用。研究表明NAC4過表達(dá)體和miR164沉默型植株對細(xì)菌病原體的過敏反應(yīng)更加強烈，細(xì)胞死亡癥狀增強，而NAC4的 下 游 基因LURP1、WRKY40和WRKY54在細(xì)胞程序性死亡過程充當(dāng)負(fù)向調(diào)節(jié)因子［66］。Wang等［67］發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR164的靶基因OsNAC60增加細(xì)胞程序性死亡、加快離子泄漏、增強ROS積累、胼胝質(zhì)沉積以及防御相關(guān)基因的上調(diào)，而增強水稻對稻瘟癥的抵御能力。在上述研究中，miR164在植物生物脅迫過程中發(fā)揮消極作用，然而，在最新研究中也發(fā)現(xiàn)其具有積極調(diào)控作用。Hu等［68］在對棉花黃萎病的研究中發(fā)現(xiàn)，ghr-miR164作為正向調(diào)節(jié)因子可提高棉花對黃萎病的抗性，沉默其靶基因GhNAC100也可增強抗病性。還發(fā)現(xiàn)GhNAC100與GhPR3啟動子的CGTA box結(jié)合抑制其表達(dá)，從而減弱植物抗病性。此外，miR164也在小麥的葉銹病以及楊樹黑斑病防御過程中發(fā)揮重要作用［69-70］。

miR319在生物脅迫過程也起重要作用。番茄miR319-TCP4通過影響茉莉酸（jasmonic Acid，JA）合成基因表達(dá)和葉片內(nèi)源JA水平，進而影響植物對根結(jié)線蟲的抗性［71］。Zhang等［72］發(fā)現(xiàn)米曲霉菌株感染能特異性誘導(dǎo)水稻miR319的表達(dá)，抑制其靶基因OsTCP21表達(dá)。當(dāng)miR319b-OE水稻受米曲霉菌感染時，LIPOXYGENASE2（LOX2）和LOX5作為JA合成過程中的關(guān)鍵酶被抑制表達(dá)［72］。Fan等［73］報告了miR319a/TCP參與毛白楊GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及毛狀體形成過程。miR319a過表達(dá)降低靶向的TCP轉(zhuǎn)錄水平，顯著提高轉(zhuǎn)基因楊樹的葉毛密度，從而減輕昆蟲危害性。

大蒜受病原體侵害誘導(dǎo)miR394表達(dá)而下調(diào)F-box和cytochrome P450（CYP450）基 因，因 此miR394及其對靶基因調(diào)控強度的差異可作為選擇抗病大蒜品種的標(biāo)志［74］。miR394作為擬南芥應(yīng)對細(xì)菌感染的負(fù)調(diào)控因子，其過表達(dá)通過影響LCR以及許多參與植物miRNA代謝的關(guān)鍵基因AGO1表達(dá)從而提高植物對細(xì)菌的易感性［75］。Zhang等［76］在番茄中的研究也驗證了miR394參與負(fù)向調(diào)控生物脅迫，miR394的過表達(dá)抑制其靶基因LCR的表達(dá)，進而抑制JA合成相關(guān)基因，從而降低番茄對致病疫霉的抗性。

在研究miR396在植物生物脅迫過程中作用時發(fā)現(xiàn)，miR396表達(dá)量降低賦予植物對真菌病原體的廣泛抗性［77］。水稻過表達(dá)miR396靶基因Growth Regulating Factor（GRF）的轉(zhuǎn)基因植物顯示出更強的抗菌性，表明miR396通過抑制GRF而負(fù)向調(diào)控水稻對細(xì)菌侵染的抗性［78］。Chandran等［78］證明過表達(dá)miR396轉(zhuǎn)基因株系對米曲霉高度敏感，而過表達(dá)其靶基因OsGRF6、OsGRF7、OsGRF8和OsGRF9的轉(zhuǎn)基因植物對米曲霉的抗性增強。進一步研究顯示，MIM miR396和GRF8-OE植物中類黃酮含量均增加，黃酮含量的增加與病原體抗性增強相關(guān)，這揭示了miR396-GRF8-F3H-類黃酮途徑介導(dǎo)的新的病原體抗性機制［79］。

Zhang等［80］在對蘋果抗菌性研究中發(fā)現(xiàn)，接種葉斑病真菌的葉片上，MdmiR395表達(dá)水平升高而其靶基因MdMRKY26、MdWRKYN1表達(dá)降低。過表達(dá)MdWRKY或抑制MdmiR395可以增加與抗病相關(guān)（pathogenesis-related，PR）基因的表達(dá)從而增強蘋果的抗病性。Wu等［81］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水稻遭受病毒危害時，miR528表達(dá)受抑制，這促進其靶基因L-抗壞血酸氧化酶（L-ascorbate oxidase，AO）表達(dá)從而減少AO介導(dǎo)的活性氧的積累。在之后的研究中又發(fā)現(xiàn)miR528-AO防御模塊受SPL9的調(diào)控，SPL9與miR528啟動子區(qū)域內(nèi)特定基序結(jié)合從而激活miR528基因的表達(dá)［82］。

3 總結(jié)與展望

環(huán)境脅迫是影響植物正常生長發(fā)育的重要因素之一，不同的環(huán)境脅迫會誘導(dǎo)miRNA的差異性表達(dá)。miRNA作為調(diào)節(jié)植物脅迫響應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心，其一舉一動都會引起“蝴蝶效應(yīng)”，因此對miRNA的研究有助于改良植物的遺傳性狀，提高其抗逆性。研究表明即使是同種miRNA在不同物種中對脅迫響應(yīng)表現(xiàn)不同。例如，不同物種miR156在鹽脅迫下的表達(dá)模式不同，蘋果、玉米相似，擬南芥、甘蔗和水稻相似［24，40，83-85］。木本植物和草本植物在生命周期方面的差異可能解釋了這種現(xiàn)象。一年生草本植物的生命周期比多年生木本植物短，所以當(dāng)草本植物受到鹽脅迫時，它們會將能量分配給防御機制，于是引起miR156積累抑制SPL表達(dá)，從而延長植物的幼年期，使其增強對不利環(huán)境條件的耐受性。與擬南芥和其他草本植物不同，多年生木本植物的幼年期較長，其與耐鹽性之間的關(guān)系可能比草本植物更復(fù)雜。當(dāng)蘋果受到鹽脅迫時，它通過下調(diào)miR156以上調(diào)下游靶基因SPL。某些SPL可增強側(cè)根伸長和生物量積累，以抵消鹽脅迫引起的能量消耗。其他SPL通過調(diào)控下游基因表達(dá)以調(diào)節(jié)植物生理和代謝過程以響應(yīng)鹽脅迫。除此之外，miR164、miR169在不同物種的生物脅迫方面也起著不同的調(diào)控作用［64-68］。即便依據(jù)miRNA片段小以及遺傳冗余等特點，研究人員已經(jīng)開發(fā)了Target mimicry（MIM）、Short tandem target mimic（STTM）技術(shù)等，但是大量的研究結(jié)果顯示，miRNA具有組織和器官特異性。例如miR159在不同組織的表達(dá)量不同［86-88］。但目前尚沒有確切的機制解釋這些現(xiàn)象。未來對于單個miRNA的通路研究將可能說明這一現(xiàn)象，這將會成為未來研究趨勢之一，其中單細(xì)胞測序技術(shù)可能在其中發(fā)揮重要作用。

隨著二代測序技術(shù)以及miRNA研究技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多新的miRNA被發(fā)現(xiàn)。然而目前的研究大多僅局限于miRNA及其靶基因在生物學(xué)過程中的作用，而miRNA是如何接收到上級信號以及通過級聯(lián)反應(yīng)影響下游各種調(diào)控途徑的分子機制尚不清楚。因此，建立更為系統(tǒng)的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將會成為未來另一個趨勢。