夏枯草精準煮散飲片與普通飲片煎煮質(zhì)量評價

曹麗萍，林曉燕，李曙光，梁 奇*

［1.深圳市寶安中醫(yī)院（集團），廣東 518000；2.深圳市中醫(yī)院，深圳市醫(yī)院中藥制劑研究重點實驗室，廣東 518033］

夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗。性味辛、苦，寒，具有清肝瀉火，明目，散結(jié)消腫的作用［1］。夏枯草的有效成分為三萜類及其皂苷類成分，藥理研究顯示其有抗腫瘤、降血脂、抗氧化等作用［2-3］。中藥煮散是傳統(tǒng)用藥形式，唐宋時期盛行“藥力盡出”的煮散，明清時代煮散因為破壞了藥材形態(tài)引起辨藥之難，逐漸被保全藥材鑒別特征的中藥飲片所取代。精準煮散飲片［4-6］是基于傳統(tǒng)中藥煮散用藥方式，經(jīng)標準化生產(chǎn)、批內(nèi)質(zhì)量均一的中藥粗顆粒或粗末飲片。本文通過考查干膏收率、含量均一性、指紋圖譜相似度等指標為研究對象，對比夏枯草精準煮散飲片與普通飲片質(zhì)量差異，進行質(zhì)量綜合評價，揭示精準煮散飲片的優(yōu)勢，為提高中醫(yī)臨床療效的有效穩(wěn)定提供數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀Shimadzu LC-20AT，SIL-20A自動進樣器，CTI-20AC柱溫箱，SPD-M20A檢測器，LC solution數(shù)據(jù)處理工作站（日本島津公司）；Diamonsil（200 mm×4.6 mm，5.0 μm）色譜柱；電子天平（準確至萬分之一，北京賽多利斯科學儀器有限公司）；KQ-500DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；溶劑過濾器（天津津騰公司）。迷迭香酸對照品（HPLC純度大于98%，批號20283-92-5，購于南京春秋生物公司）。3批次的夏枯草飲片（S1：批號1810001、S2：批號1810002、S3：批號1810003）各500 g，由市場購買，經(jīng)深州市中醫(yī)醫(yī)院藥檢室簡曉莉副主任中藥師鑒定為2020版《中國藥典》（一部）夏枯草品種。甲醇、乙腈、冰醋酸為色譜純（Fisher），其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同粒度夏枯草精準煮散的制備 《本草綱目》中記載夏枯草，治療赤白帶下、血崩，研末服用?！稄埵厢t(yī)通》收載夏枯草散，其中夏枯草為末，茶水調(diào)下。查閱文獻得知，“末”約粒度介于二號篩（24目）與四號篩（65目）之間。參考古代典籍記載和現(xiàn)代應用研究，以S1夏枯草原飲片作為T1樣品，同時取S1夏枯草原飲片粉碎，過篩，得到5～10目（T2樣品，95%的粉末粒度為2~4 mm）、10～24目（T3樣品，95%的粉末粒度為0.85~2 mm）、24～65目（T4樣品，95%的粉末粒度為0.25~0.85 mm）和65～80目（T5樣品，95%的粉末粒度為0.18~0.25 mm）等不同粒度的煮散飲片［7-8］。

2.2 迷迭香酸含量測定方法研究

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定適量的迷迭香酸對照品，加甲醇制成每1 ml含迷迭香酸分別為8.868 2、17.736 5、44.341 2、88.682 4、133.023 6和177.364 8 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取已制備的精準煮散樣品100 g，稱定，加12倍量水浸泡10 min，煮沸20 min，濾得煎煮液，剩下的殘渣加10倍量水煎煮20 min。合并兩次煎煮液，濃縮成100 ml溶液，得到相當于含飲片1.0 g/ml藥液，為夏枯草精準煮散儲備液。精密量取上述儲備液1 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，取適量試液離心，取上清液，即得供試液。

2.2.3 色譜條件Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5.0 μm）色譜柱，以0.1%冰醋酸水（A）-乙腈（B）為流動相，按表1中進行梯度洗脫；流速為1.0 ml/min；進樣量10 μl，檢測波長為330 nm，按迷迭香酸峰計算理論板數(shù)應不低于6 000，色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

圖1 對照品（A）供試品（B）空白溶劑（C）HPLC色譜圖

2.2.4 線性范圍考查 取迷迭香酸系列對照品溶液，按以上色譜條件進樣，以濃度（μg/ml）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得迷迭香酸回歸方程：Y=26 705.7X+1 924.6（r=0.999 8）。結(jié)果表明，迷迭香酸在8.868 2～177.364 8 μg/ml之間，與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.5精密度試驗 取17.736 5 μg/ml的迷迭香酸對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，RSD為0.53%，說明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取T4供試液，分別在第0、2、4、8和12 h進樣，測定迷迭香酸峰面積，RSD為0.77%，說明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復性試驗 取同一T4供試液6份，按上述色譜條件，測定迷迭香酸含量。結(jié)果迷迭香酸含量為45.35 μg/ml，RSD為0.64%，說明重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的供試液（迷迭香酸含量為45.35 μg/ml）9份，每份0.5 ml，分別加13.302 4 μg/ml的迷迭香酸1、2和3 ml各3份，按上述色譜條件測定峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果迷迭香酸平均回收率為99.70%，RSD為1.01%，見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.3 粒度評價S1按“2.1”項下方法制備不同粒度煮散飲片，取S1及不同粒度煮散飲片各100 g，加12倍量水浸泡10 min，煮沸20 min，濾得煎煮液，剩下的殘渣加10倍量水煎煮20 min。合并兩次煎煮液，濃縮成100 ml溶液，得到相當于含飲片1.0 g/ml藥液。精密吸取各供試液2 ml于蒸發(fā)皿中，干燥至恒重，稱重，計算出膏率，結(jié)果分別為0.65%±0.04%、0.69%±0.05%、0.90%±0.03%、1.11%±0.10%和1.16%±0.09%。與原飲片相比，煮散飲片的出膏率增加，粒徑不同出膏率不同，其中T1、T2樣品出膏率較低，T3、T4樣品出膏率相對較高，T5樣品出現(xiàn)糊化。出膏率及澄清度結(jié)果見表3。故確定夏枯草精準煮散的粒度10～65目為宜，在后續(xù)試驗中采用10～65目樣品。

表3 夏枯草原飲片與精準煮散飲片粒度考查

2.4 迷迭香酸含量的均一性評價 分別稱取3批不同批次的夏枯草原飲片，各稱100 g，分別標記為（S1～S3），另取與S1～S3相同批次的夏枯草飲片各適量等比例混合，粉碎過篩，取10～65目粉碎物，充分混勻，制成夏枯草煮散飲片，稱取3份夏枯草煮散飲片，每份100 g，標記為（S4～S6）。S1~S6共6份樣品，每份各100 g，按“2.2.2”項下方法分別煎煮濃縮為1.0 g/ml藥液。精密量取濃縮液1 ml置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，取適量試液離心，取上清液，即得待測試溶液，按“2.2.3”項下色譜條件分別測定S1~S6中迷迭香含量。結(jié)果夏枯草原飲片提取液中迷迭香酸含量為（0.312±0.09）mg/g，RSD為28.17%；夏枯草精準煮散飲片提取液中迷迭香酸含量為（0.298±0.01）mg/g，RSD為3.88%。見表4和表5。結(jié)果表明，混合煮散前，各批次夏枯草飲片藥材中指標成分含量差異較大，將其混合制成煮散飲片后，迷迭香酸成分的含量RSD顯著下降，說明質(zhì)量均一性更好。

表4 夏枯草原飲片提取液中迷迭香酸含量測定結(jié)果

表5 夏枯草精準煮散飲片提取液中迷迭香酸含量測定結(jié)果

2.5 指紋圖譜分析

2.5.1 色譜條件 與“2.2.3”項下色譜條件相同，按迷迭香酸峰計算理論板數(shù)應不低于6 000，色譜圖見圖2。

2.5.2 樣品測定 按“2.4”項下方法制備供試液，精密吸取，供試品溶液注入HPLC記錄色譜峰信息。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件”（2004A版）對夏枯草原飲片和煮散飲片樣品指紋圖譜相似度進行比較，見圖2和表6。結(jié)果顯示：應用現(xiàn)有的檢測方法，夏枯草原飲片和煮散飲片樣品的色譜峰可以很好地匹配，相似度結(jié)果顯示：煮散飲片（S4～S6）的相似度均1，指紋圖譜匹配更好。說明了精準煮散飲片與原飲片在提出成分的屬性上沒有顯著差異，采用指紋圖譜相似度分析法可用來鑒別夏枯草煮散飲片的真?zhèn)吻闆r。以精準煮散飲片水煎液中迷迭香酸的平均峰面積為基準，計算飲片和精準煮散飲片水煎液各共有峰的相對峰面積，見表7。

圖2 夏枯草原飲片（S1~S3）及精準煮散飲片（S4~S6）指紋圖譜

表6 夏枯草原飲片及精準煮散飲片水煎液指紋圖譜的相似度

表7 夏枯草原飲片及精準煮散飲片水煎液中共有峰的相對峰面積（±s）

表7 夏枯草原飲片及精準煮散飲片水煎液中共有峰的相對峰面積（±s）

峰號 tR（min） 市售飲片 精準煮散飲片15.64 0.476±0.07 0.528±0.05 2 18.51 0.025±0.004 0.046±0.01 3 19.27 0.049±0.01 0.065±0.01 4 23.99 1 1 1

3 討論

煮散最早記載于秦，漢唐開始較大規(guī)模應用，宋代發(fā)展到巔峰，明清時因較飲片難以鑒別真?zhèn)蔚仍蚨饾u衰落［9］，隨著現(xiàn)代儀器設備和鑒別手段的發(fā)展，難以鑒別真?zhèn)蔚娜秉c被克服，煮散具有的節(jié)省藥材、降低成本、提高藥物有效成分煎出率等方面的優(yōu)勢得到凸顯，煮散又逐步開始受到青睞，應用規(guī)模逐漸擴大。

本試驗選取中藥處方中常見的夏枯草為研究對象，對比夏枯草精準煮散飲片與普通飲片質(zhì)量差異，選取夏枯草3個批次，每批次3個規(guī)格制成精準煮散，分別測定了出膏率和迷迭香酸含量。與原飲片比較，夏枯草精準煮散出膏率和含量均比原飲片有一定程度增加；且粒徑越小，出膏率越高。其中10~24目、24~65目和65～80出膏率相對較高，但在65~80目時，出現(xiàn)輕微糊化現(xiàn)象，大批量的煮散10~65目較為合適。

2020 版《中國藥典》中把迷迭香酸作為夏枯草含量測定的成分，規(guī)定夏枯草飲片中含迷迭香酸（C18H16O8）不得少于0.20%。本文以迷迭香酸為指標成分，通過HPLC含量測定與指紋圖譜分析法研究對了夏枯草煮散飲片與市售飲片的質(zhì)量差異。結(jié)果表明，夏枯草精準煮散飲片與市售飲片在成分上沒有差異，但制成煮散飲片后，迷迭香酸成分的煎出量明顯增加，質(zhì)量均一性更好。