巨大戟醇甲基丁烯酸酯有關(guān)物質(zhì)的合成

李彥赟，楊 昱，孫傳騰，吳 瀟

（天津市中藥質(zhì)量控制企業(yè)重點實驗室，天津中新藥業(yè)研究院有限公司，天津 300457）

巨大戟醇甲基丁烯酸酯（ingenol mebutate，ingenol-3-angelate，巨大戟醇-3-當歸酸酯，1）是從南歐大戟中分離得到的二萜類化合物，由丹麥利奧制藥開發(fā)為治療日光性角化病的外用凝膠劑，商品名為Picato?，2012年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準上市［1］，隨后在歐洲、澳大利亞、加拿大、韓國等30多個國家和地區(qū)上市。藥理研究表明，巨大戟醇甲基丁烯酸酯通過化療作用及免疫治療作用的雙重機制發(fā)揮治療日光性角化病的作用［2］：一方面迅速誘導畸變的角質(zhì)細胞壞死，另一方面誘導定向病損區(qū)的免疫應答，通過嗜中性粒細胞介導的抗體依賴的細胞毒作用（ADCC）進一步殺死異常細胞，因而可以在較短的治療周期中起到殺傷畸變細胞的作用。與其他用于治療日光性角化病的皮膚外用制劑（咪喹莫特、雙氯芬酸鈉等）相比，巨大戟醇甲基丁烯酸酯僅需用藥2~3 d即可，具有用藥周期短、患者依從性好的特點［3-4］。因其獨特的作用機制和顯著的臨床療效，入選國家藥品審評中心（CDE）《首批專利權(quán)到期、終止、無效且尚無仿制申請的藥品清單》且居于首位。大量臨床試驗及案例報道顯示，巨大戟醇甲基丁烯酸酯對基底細胞癌、跖疣、尖銳濕疣、鮑恩病、黑色素瘤等與人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染、紫外線損傷相關(guān)的皮膚病具有良好改善作用，為近年來皮膚病研究領(lǐng)域的熱門藥物之一［5-9］。

本文以巨大戟醇為起始物料，對巨大戟醇甲基丁烯酸酯的2個主要有關(guān)物質(zhì)進行合成，為其原料藥與制劑的質(zhì)量控制提供對照品合成方法。

1 雜質(zhì)來源及合成路線

巨大戟醇甲基丁烯酸酯為巨大戟醇的3位羥基當歸酰化形成的酯（3-O-當歸?；薮箨迹捎诰薮箨冀Y(jié)構(gòu)中4位、5位及20位均有游離羥基，故在貯存過程中會生成酯交換產(chǎn)物，酯交換產(chǎn)物5-O-當歸?；薮箨迹?，雜質(zhì)A，巨大戟醇-5-當歸酸酯）、20-O-當歸酰基巨大戟醇（3，雜質(zhì)B，巨大戟醇-20-當歸酸酯）含量也是原料藥及凝膠劑的關(guān)鍵質(zhì)量控制指標（結(jié)構(gòu)見圖1），原研藥巨大戟醇甲基丁烯酸酯凝膠劑通過添加緩沖液控制pH值及低溫冷藏保存的方式控制兩種酯交換產(chǎn)物的生成［10-11］。

圖1 巨大戟醇甲基丁烯酸酯及有關(guān)物質(zhì)化學結(jié)構(gòu)

雜質(zhì)A和雜質(zhì)B均無合成路線研究報道，市面上也沒有雜質(zhì)對照品銷售。利奧制藥生產(chǎn)巨大戟醇甲基丁烯酸酯凝膠劑所用的原料藥為從南歐大戟（Euphorbia peplus）的地上部分分離純化而獲得［12］，其含量僅為0.000 11%。由于從南歐大戟中未分離到酯交換產(chǎn)物5-O-當歸?；薮箨己?0-O-當歸?；薮箨?，原研藥的雜質(zhì)相關(guān)研究是將原料藥制備成溶液，經(jīng)長時間放置后分離獲得酯交換產(chǎn)物。該方法效率低，特定雜質(zhì)的收率不受控。

巨大戟醇甲基丁烯酸酯的母核為經(jīng)典的二萜類化合物巨大戟醇（ingenol），此類化合物多以羧酸酯的形式廣泛存在于大戟屬植物中，簡單易得，其中千金子中含量高達0.07%，為市售巨大戟醇的主要來源［13］。本文以巨大戟醇為原料，利用選擇性保護基團對3位、20位的羥基進行保護，將5位羥基當歸?；磻笤倜撊ケＷo基，合成雜質(zhì)A。由于20位羥基的反應活性強于其他游離羥基，可利用低溫反應在20位進行選擇性酯化，合成雜質(zhì)B。2種雜質(zhì)的合成路線見圖2和圖3。

圖2 5-O-當歸?；薮箨迹?，雜質(zhì)A）的合成路線

圖3 20-O-當歸?；薮箨迹?，雜質(zhì)B）的合成路線

2 儀器與試劑

2.1 儀器Waters e2695高效液相色譜儀（美國沃特世科技有限公司）；Bruker AvanceⅡ400 MHz核磁共振儀（德國布魯克公司）；BUCHI R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀［步琦實驗室設(shè)備貿(mào)易（上海）有限公司］；ACQUITY UPLC H-Class Quattro Micro API三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國沃特世科技有限公司）；METTLER TOLEDO MS105電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］。

2.2 試劑 巨大戟醇（含量：98%，南京春秋生物工程有限公司，批號JDJC21900102）；咪唑（批號LOA0Q79）、叔丁基二甲基氯硅烷（TBDMSCl，批號LB70Q66）、三乙基氯硅烷（TESCl，批號L160P47）購自北京百靈威科技有限公司；雙三甲基硅基胺基鋰（LiHMDS，批號SHBJ0605）購自sigma-aldrich公司；當歸酸酐（批號GGB7K-UA）購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司（TCI）；其他常規(guī)試劑均采購自天津科密歐化學試劑有限公司。

3 合成方法

3.1 20 -O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇（20-OTBDMS-ingenol，中間體1）的合成 稱取44.80 mg巨大戟醇（ingenol）至10 ml茄形瓶中，用2 ml無水二氯甲烷溶解，冰鹽浴控制溫度約-8℃，依次加入31.56 mg叔丁基二甲基氯硅烷（TBDMSCl）、32.00 mg咪唑，攪拌反應40 min，TLC檢測［石油醚-丙酮（3∶1）］反應完全。加6 ml水攪拌，用相同體積的乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯層合并后減壓濃縮至干，經(jīng)快速硅膠柱色譜純化，洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯（3∶1），得到53.60 mg無色固體，利用核磁共振波譜法確證結(jié)構(gòu)為20-O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇（中間體1），收率為90%。

1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ:5.98（1H，brd，J=4.2 Hz），5.89（1H，d，J=1.2 Hz），4.49（1H，d，J=4.4 Hz），4.31（1H，d，J=4.4 Hz），4.25-4.10（3H，m），4.04（1H，s），3.84（1H，d，J=4.2 Hz），2.76（1H，d，J=4.6 Hz），2.49-2.40（1H，m），2.26-2.36（1H，m），1.84（3H，d，J=1.0 Hz），1.79-1.70（1H，m），1.66（1H，s），1.11（3H，s），1.05（3H，s），0.95（3H，d，J=7.2 Hz），0.88（9H，s），0.74-0.63（1H，m），0.07（6H，d，J=2.1 Hz）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:206.8，139.5，138.4，129.4，127.6，84.5，80.7，76.3，72.3，68.2，43.9，39.5，31.0，28.6，25.9（3C），24.1，23.4，23.2，18.2，17.3，15.7，15.6，-5.1，-5.3。

3.2 3 -O-三乙基硅基-20-O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇（3-O-TES-20-O-TBDMS-ingenol，中間體2）的合成 向10 ml茄形瓶中依次加入45.20 mg中間體1和57.60 mg咪唑，用2 ml無水二氯甲烷溶解，加入88 μl三乙基氯硅烷（TESCl），室溫攪拌反應40 min，TLC檢測［（石油醚-丙酮（20∶1）］反應完全。加水6 ml攪拌，用相同體積的乙酸乙酯萃取3次，有機相合并后減壓濃縮至干，經(jīng)快速硅膠柱色譜純化，洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯（20∶1），得到41.20 mg無色固體，利用核磁共振波譜法確證結(jié)構(gòu)為3-O-三乙基硅基-20-O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇（中間體2），收率為73%。

1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ:5.98（1H，brd，J=3.0 Hz），5.88（1H，d，J=1.4 Hz），4.51（1H，s），4.24（1H，d，J=13.0 Hz），4.11（1H，d，J=13.0 Hz），4.08-4.01（1H，m），3.82（1H，d，J=1.0 Hz），3.68（1H，d，J=9.8 Hz），3.15（1H，d，J=9.8 Hz），2.44-2.32（1H，m），2.24-2.16（1H，m），1.80（3H，d，J=1.0 Hz），1.79-1.68（1H，m），1.13（3H，s），1.05（3H，s），0.98（9H，t，J=8.0 Hz），0.96-0.86（12H，m），0.79（7H，q，J=7.8 Hz），0.04（6H，d，J=5.6 Hz）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:207.7，140.5，138.8，130.1，124.5，84.4，81.7，74.8，72.6，66.2，43.9，38.8，31.2，28.8，26.0（3C），23.8，23.7，23.4，18.4,17.7，16.1，15.7，6.9（3C），5.3（3C），-5.0，-5.2。

3.3 3 -O-三乙基硅基-5-O-當歸?；?20-O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇（3-O-TES-5-O-angeloyl-20-O-TBDMS-ingenol，中間體3）的合成 稱取40.9 mg中間體2至10 ml茄形瓶中，用橡膠塞密封，用3 ml無水四氫呋喃溶解后，氬氣保護條件下依次加入214 μl雙三甲基硅基胺基鋰（LiHMDS）和38 μl當歸酸酐，冰鹽?。?10℃）低溫攪拌1 h，TLC檢測［石油醚-丙酮（20∶1）］反應完全。加水9 ml攪拌，用相同體積的乙醚萃取3次，有機相合并后減壓濃縮至干，經(jīng)快速硅膠柱色譜純化，洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯（50∶1），得到31.3 mg無色固體，利用核磁共振波譜法確證結(jié)構(gòu)為3-O-三乙基硅基-5-O-當歸?；?20-O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇（中間體3），收率為67%。

1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ:6.13（2H，brs），5.95（1H，s），5.42（1H，s），4.20（1H，d，J=11.4 Hz），3.97（1H，s），3.81（1H，d，J=3.3 Hz），2.53-2.40（1H，m），2.2 4-2.15（1H，m），2.01（3H，d，J=7.0 Hz），1.94（3H，s），1.79（3H，s），1.14（3H，s），1.06（3H，s），0.97-0.86（12H，m），0.84（9H，s），0.67-0.55（6H，m），-0.01（6H，d，J=4.3 Hz）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：207.6，166.9，139.8，138.9，138.1，130.4，127.6，124.6，85.2，80.9，74.1,73.1，64.8，43.9，38.3，31.3，28.8，26.1（3C），23.9，23.8，23.5，20.7，18.5，18.1，16.2，16.1，15.9，6.9（3C），5.2（3C），-5.2，-5.3。

3.4 5 -O-當歸?；薮箨迹s質(zhì)A）的合成 稱取30.1 mg中間體3至10 ml茄形瓶中，用3 ml甲醇溶液溶解后，加入6 mol/L鹽酸80 μl，室溫攪拌反應45 min，TLC檢測［石油醚-丙酮（3∶1）］反應完全。加水9 ml攪拌，用相同體積的乙醚萃取3次，有機相合并后減壓濃縮至干，經(jīng)快速硅膠柱色譜純化，洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯（2∶1），得到10.3 mg無色固體，利用質(zhì)譜及核磁共振波譜法確證結(jié)構(gòu)為5-O-當歸?；薮箨迹s質(zhì)A），收率為52.4%，經(jīng)HPLC檢測純度為99.19%［面積歸一化法：色譜柱Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為水（A）-乙腈（B）；洗脫梯度（0~12 min，40% B；12~50 min，40%B→60%B）；流速1.0 ml/min；檢測波長210 nm；柱溫30℃；進樣量10 μl；保留時間20.8 min］。

1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：6.18（1H，d，J=4.7 Hz），6.13（1H，d，J=7.2 Hz），5.81（1H，s），5.39（1H，s），4.36-4.28（1H，m），3.95（2H，q，J=12.8 Hz），3.88-3.75（2H，m），3.03（1H，d，J=5.6 Hz），2.53（1H，t，J=6.0 Hz），2.39（1H，brs），2.16（2H，s），1.99（3H，d，J=7.2 Hz），1.93（3H，s），1.81（3H，s），1.14（3H，s），1.04（3H，s），0.98（3H，d，J=6.6 Hz），0.70（1H，q，J=7.6 Hz）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:207.5，168.1，139.9，139.6，138.6，129.3，128.3，127.2，85.5，79.3，75.3，74.0，65.3，44.0，38.4，31.9，28.7，24.1，23.7，23.5，20.7，18.4，16.0，15.7，15.1。ESI-MS m/z：475.3［M+HCOO］-，429.2［M-H］-。

3.5 20 -O-當歸酰基巨大戟醇（雜質(zhì)B）的合成 稱取102.16 mg巨大戟醇（ingenol）至25 ml茄形瓶中，加入無水碳酸鈉150.71 mg，依次加入5 ml無水乙腈、當歸酸酐300 μl，冰鹽浴控制溫度約-8℃，攪拌反應24 h。加水15 ml攪拌，用相同體積的乙酸乙酯萃取3次，有機相合并后減壓濃縮至干，經(jīng)快速硅膠柱色譜純化，洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯（2∶1），得到27.5 mg無色固體，利用質(zhì)譜及核磁共振波譜法確證結(jié)構(gòu)為20-O-當歸?；薮箨迹s質(zhì)B），收率為22%，經(jīng)HPLC檢測純度為99.84%（面積歸一化法，色譜條件同雜質(zhì)A，保留時間25.0 min）。

1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：6.14-6.02（2H，m），5.93（1H，d，J=1.2 Hz），4.78（1H，d，J=13.0 Hz），4.61（1H，d，J=13.0 Hz），4.41（1H，s），4.18-4.05（2H，m），3.68（1H，d，J=10.0 Hz），3.12（1H，d，J=6.5 Hz），2.77（1H，brs），2.40-2.20（2H，m），1.93（3H，d，J=7.2 Hz），1.87（3H，s），1.83（3H，s），1.11（3H，s），1.06（3H，s），0.96（3H，d，J=7.2 Hz），0.69（1H，q，J=8.6 Hz）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:206.7，168.3，138.9，138.3，137.0，130.1，128.4，127.9，84.5，80.8，74.0，72.7，66.3，44.2，39.9，31.1，28.6，24.1，23.3，23.2，20.7，17.4，15.9，15.6，15.5。ESI-MS m/z：475.2［M+HCOO］-，429.2［M-H］-。

4 討論

藥物合成工藝中引入的雜質(zhì)、原料藥降解產(chǎn)物等有關(guān)物質(zhì)會對藥品質(zhì)量與療效產(chǎn)生較大影響，毒性雜質(zhì)甚至對人體健康有害或產(chǎn)生其他不良反應，因此，化學原料藥及制劑中有關(guān)物質(zhì)的研究與控制是確保用藥安全有效的重要工作。本文首次報道了巨大戟醇甲基丁烯酸酯的2個酯交換產(chǎn)物5-O-當歸酰基巨大戟醇和20-O-當歸?；薮箨迹s質(zhì)A和雜質(zhì)B）的合成方法，利用核磁共振波譜（1H-NMR、13C-NMR）及質(zhì)譜（MS）確證了雜質(zhì)及中間體的結(jié)構(gòu)；HPLC檢測結(jié)果顯示，經(jīng)純化后兩個目標雜質(zhì)的純度其達到99%以上，可以作為巨大戟醇甲基丁烯酸酯原料藥及凝膠劑有關(guān)物質(zhì)研究的對照品。

雜質(zhì)的合成起始物料選擇了來源廣泛、方便易得的經(jīng)典二萜類天然產(chǎn)物巨大戟醇，其結(jié)構(gòu)中共含有4個游離羥基，其中20位的伯醇羥基反應活性最強，3位及5位的仲醇羥基次之，4位叔醇羥基反應活性最弱，故20-O-當歸酰基巨大戟醇（雜質(zhì)B）可在低溫條件下直接一步?；磻@得，但由于選擇性不高，會生成3-O-當歸酰基巨大戟醇、3，20-O-二當歸?；薮箨嫉雀碑a(chǎn)物，雜質(zhì)B的收率為22%。5-O-當歸酰基巨大戟醇（雜質(zhì)A）合成過程中則利用不同保護基依次對20位、3位的羥基進行了選擇性保護，當歸?；磻髢煞N保護基可在酸性條件下同步脫去。

本文所述巨大戟醇甲基丁烯酸酯有關(guān)物質(zhì)的合成方法簡單易行，中間體及目標產(chǎn)物分離純化簡便，產(chǎn)物純度高，為2種雜質(zhì)的大量制備及巨大戟醇甲基丁烯酸酯產(chǎn)品的有關(guān)物質(zhì)研究、質(zhì)量標準研究和雜質(zhì)限度控制奠定了基礎(chǔ)。