生血方的鑒別與含量測(cè)定

郭懷宇，陳金鋒，謝俊杰，郁冬冬，姜 蕾

六安市中醫(yī)院 藥劑科，安徽六安 237001

生血方是六安市中醫(yī)院生產(chǎn)的醫(yī)院制劑穴位貼，處方由黃芪、女貞子、當(dāng)歸、炒白術(shù)、茯苓、菟絲子、枸杞子等10 味中藥組成，具有補(bǔ)腎、活血的功效。該方聯(lián)合他藥常規(guī)治療宮頸癌和胃癌等疾病，經(jīng)臨床驗(yàn)證，臨床效果理想[1，2]。黃芪中含有皂苷、黃酮、氨基酸等成分。其中，皂苷類成分具有抗癌等藥理作用[3，4]；黃酮類成分具有抗缺血和改善血相作用[5，6]。女貞子中含有三萜、黃酮、多糖類成分，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用[7]。當(dāng)歸中含有揮發(fā)油和有機(jī)酸等成分，具有補(bǔ)血、促進(jìn)免疫等作用[8]。馬靖、孟楣等采用高效液相-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）測(cè)定黃芪中的黃酮類成分和皂苷類成分[9，10]。本研究通過(guò)黃芪等薄層色譜鑒別以及高效液相色譜法（HPLCELSD），建立了黃芪甲甘和芒柄花素的含量測(cè)定，用于控制該制劑的質(zhì)量。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Agilent 1200 高效液相色譜儀（含奧泰ELSD 6000 蒸發(fā)光檢測(cè)器、CSChormPlus 工作站），美國(guó)安捷倫公司；BT125D 型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；KQ-5200DA 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 藥品與試劑

黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-201717）、芒柄花素對(duì)照品（批號(hào)：111703-201504），女貞子對(duì)照藥材（批號(hào)：121041-201404）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：121137-201606）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；生血方（3 批：批號(hào)：20180521、20180618、20180713），六安市中醫(yī)院制劑室自制。乙腈為色譜純；其他試劑為分析醇；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品溶液制備 取本品6g，研細(xì)，加甲醇100mL，超聲處理30 分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，固體物加水20mL 使溶解，用水飽和正丁醇提取4 次（40mL/次），合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次（40 mL/次），棄去氨試液，正丁醇液水浴蒸干，固體物加適量甲醇溶解，定容至1 mL，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含1 mg 的溶液，即得。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液制備 取缺黃芪藥材，根據(jù)制劑工藝制成相應(yīng)陰性對(duì)照，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.4 鑒別方法 吸取供試品、對(duì)照品，陰性對(duì)照溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13∶7∶2）的下層溶液（10 ℃以下分層靜置30 分鐘以上）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱約5 分鐘，結(jié)果見(jiàn)圖1A。由圖1A 可知，供試品色譜與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。

2.2 女貞子薄層色譜鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品粉末2 g，加稀乙醇50 mL，超聲處理30 分鐘，濾過(guò)，濾液即為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照藥材溶液的制備 取女貞子對(duì)照藥材2g，同法制成對(duì)照藥材溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液制備 取缺女貞子各藥材，根據(jù)制劑工藝制成相應(yīng)陰性對(duì)照，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 鑒別方法 吸取供試品、對(duì)照藥材、陰性對(duì)照溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（30 ℃～60 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置碘蒸氣中熏至斑點(diǎn)清晰，置日光下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖1B。由圖1B 可知，供試品色譜與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。

2.3 當(dāng)歸的薄層鑒別

2.3.1 供試品溶液的制備 取本品粉末6 g，加1%碳酸氫鈉溶液50mL，超聲處理10 分鐘，離心，取上清液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至2～3，用乙醚振搖提取2 次，每次20mL，合并乙醚液，揮干，固體物加甲醇1mL 使溶解，即得。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取阿魏酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含1 mg 的溶液，即得。

2.3.3 陰性對(duì)照溶液制備 取缺當(dāng)歸各藥材，根據(jù)制劑工藝制成相應(yīng)陰性對(duì)照，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3.4 鑒別方法 吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（1∶1∶1∶0.1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖1C。由圖1C 可知，供試品色譜與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。

圖1 生血方中的薄層鑒別

2.4 黃芪甲苷和芒柄花素含量測(cè)定

2.4.1 溶液制備

2.4.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取黃芪甲苷、芒柄花素對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含黃芪甲苷1.326 mg、芒柄花素0.894 mg 的的混合對(duì)照品溶液，搖勻即得。

2.4.1.2 供試品溶液 取生血方粉末約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶，加2%氫氧化鉀甲醇溶液100 mL，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz）30 分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，固體物加水10 mL 使溶解，用水飽和的正丁醇提取4 次（30 mL/次），合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次（3 mL/次），棄去氨試液，正丁醇液蒸干，固體物加水5 mL 溶解，過(guò)D101 型大孔吸附樹(shù)脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，長(zhǎng)12 cm），以50 mL 水洗脫，棄去洗脫液，再用40%乙醇30 mL 洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，固體物加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.1.3 陰性對(duì)照溶液 取缺黃芪陰性樣品，按照“2.4.1.2”項(xiàng)下方法制備缺黃芪的陰性對(duì)照溶液。

2.4.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-水（34:66），流速為1mL·min-1，柱溫為30 ℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度為100 ℃，載氣為空氣，載氣流量為2.6 L·min-1，進(jìn)樣量為20 μL。

在上述色譜條件下，黃芪甲苷和芒柄花素的色譜峰分離比較理想，分離度＞1.5，理論塔板數(shù)以黃芪甲苷和芒柄花素計(jì)算分別為14166 和23835，且陰性無(wú)干擾。對(duì)照品、樣品及陰性樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 對(duì)照品（A）、樣品（B）、黃芪陰性樣品（C）的HPLC 色譜圖

2.4.3 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，置于5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL 測(cè)定。以進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)和對(duì)應(yīng)峰面積對(duì)數(shù)得到回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回歸方程和線性范圍

2.4.4 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算峰面積，結(jié)果黃芪甲苷和芒柄花素峰面積的RSD 分別為1.6%和1.4%。表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得黃芪甲苷和芒柄花素峰面積的RSD 分別為0.2%和0.9%，表明樣品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4.6 耐用性試驗(yàn) 選用3 種不同品牌的色譜柱[色譜柱1：Agilent Zorbax SB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;色譜柱2：依利特Hypersil ODS2 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），色譜柱3：Unitary C8色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）]，分別取“2.4.1.2”項(xiàng)下的供試品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，均能達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)生血方樣品適量，共6 份，分別按“2.4.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣，記錄黃芪甲苷和芒柄花素峰面積，根據(jù)外標(biāo)法，計(jì)算6 份樣品中各自所含的黃芪甲苷和芒柄花素的含量，測(cè)得黃芪甲苷和芒柄花素的含量分別為0.683 mg·g-1和0.477 mg·g-1，RSD 分別為0.3%和1.1%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的生血方9份，每份1.5g，精密稱定，按“2.4.1.2”項(xiàng)下方法制備供試液，精密加入低、中、高混合對(duì)照品溶液，平行制備9 份樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄黃芪甲苷和芒柄花素的峰面積，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算平均加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

黃芪甲苷和芒柄花素的回收率分別在97.7%～100.1%和97.7%～98.8%，其平均回收率分別為99.1%和98.5%，RSD 分別為0.7%和0.3%。表明該方法的回收率符合要求。

2.4.9 樣品含量測(cè)定 分別取3 個(gè)批號(hào)生血方樣品適量，按“2.4.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄黃芪甲苷和芒柄花素的峰面積，由回歸方程計(jì)算樣品中黃芪甲苷和芒柄花素的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)分別對(duì)甲醇/水，乙腈/水兩個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行考察，得出乙腈/水為系統(tǒng)的流動(dòng)相分離效果較為理想，供試品溶液中2 個(gè)成分有較好的峰形且能完全分離，溶劑噪音水平較低，所得圖譜較理想。

生血方是由10 味中藥組成，本實(shí)驗(yàn)除了對(duì)生血方中黃芪、女貞子、當(dāng)歸進(jìn)行定性鑒定，以及對(duì)黃芪甲苷、芒柄花素2 種成分進(jìn)行定量測(cè)定外，還針對(duì)黃精、山藥等其余7 種中藥進(jìn)行了薄層鑒別，嘗試不同極性展開(kāi)系統(tǒng)和顯色劑的效用，均未能獲得滿意結(jié)果，存在未見(jiàn)相同特征斑點(diǎn)、陰性樣品干擾等問(wèn)題，故未將該部分納入質(zhì)控研究中。

黃芪中的活性成分黃芪甲苷為皂苷類，芒柄花素為黃酮類，本試驗(yàn)通過(guò)建立HPLC-ELSD 法同時(shí)檢測(cè)2 個(gè)成分含量的方法，為控制生血方質(zhì)量提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。