外周血Circ_0070934/miR?199a?5p/MGAT3 作為生物標志物在過敏性鼻炎?哮喘綜合征中的診斷價值

胡鈺潔，吳 迪，黃燕華，劉志光，施宇佳，張 倩

南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，江蘇 常州 213003

支氣管哮喘（哮喘）是一種反復發(fā)作的慢性氣道疾病，以慢性氣道炎癥、氣道高反應、可逆性氣流受限和氣道重塑為特征，表現(xiàn)為反復發(fā)作的喘息、氣促、胸悶、咳嗽等呼吸道癥狀［1］。過敏性鼻炎和哮喘分別表現(xiàn)為上呼吸道和下呼吸道炎癥，兩者在病因、免疫學和發(fā)生機制等方面均極為相似，因此，根據(jù)“同一氣道、同一疾病”概念，近年來提出過敏性鼻炎?哮喘綜合征（combined allergic rhinitis and asth?ma syndrome，CARAS）這一新醫(yī)學診斷名稱，指同時發(fā)生的臨床或亞臨床上呼吸道過敏（過敏性鼻炎）和下呼吸道過敏性癥狀（哮喘）［2］。

非編碼RNA（non?coding RNA，ncRNA）是指轉錄組中不翻譯為蛋白質的RNA分子，包括長鏈非編碼RNA（long non?coding RNA，lncRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）、環(huán)形RNA（circular RNA，circ?RNA）等［3］。ncRNA在過敏性疾病（包括過敏性鼻炎和哮喘）的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，參與了氣道炎癥應答、氣道重塑、氣道高反應、上皮分化、黏液生成等重要過程，并有望成為疾病診斷的生物標志物和治療靶標［4］。研究報道，miR?199a?5p在中性粒細胞哮喘患者外周血及誘導痰液中的表達升高，并且和肺功能呈負相關［5］，但在CARAS患者中的表達水平變化及相關研究未見文獻報道。本研究通過circBANK 基因庫預測到環(huán)形RNA circ_0070934 與miR?199a?5p 結合，并且通過Targetscan 預測miR?199a?5p 靶向調控甘露糖甙乙酰氨基葡糖轉移酶（mannoside acetylglucosaminyltransferase 3，MGAT3）。本研究旨在通過比較CARAS患者和健康對照外周血中circ_0070934/miR?199a?5p/MGAT3 的表達差異，探討其作為CARAS早期診斷生物標志物的價值，評估其與CARAS患者相關臨床指標之間的相關性，為進一步研究其在CARAS發(fā)生發(fā)展中的機制打下基礎。

1 對象和方法

1.1 對象

本研究于2020 年7 月—2021 年12 月在南京醫(yī)科大學附屬常州二院呼吸與危重癥醫(yī)學科門診收集38 例CARAS 患者和43 例性別、年齡匹配的健康對照。過敏性鼻炎診斷標準參照中國過敏性鼻炎診治指南［6］，哮喘診斷根據(jù)我國2020版支氣管哮喘防治指南［7］，CARAS 的診斷須同時符合過敏性鼻炎和哮喘的診斷標準。正常對照組為健康志愿者，無哮喘和過敏性鼻炎病史，無其他過敏性及免疫系統(tǒng)疾病等。CARAS患者為初診患者，未使用抗哮喘藥物。所有受試者均需排除合并感染、肺栓塞、慢性阻塞性肺疾病、肺結核、血液系統(tǒng)疾病及肝臟功能異常等疾病，均進行血常規(guī)、肝功能、腎功能、血糖、血脂以及心電圖等檢查以排除基礎疾病。所有受試者均需簽署知情同意書，本研究獲得南京醫(yī)科大學附屬常州二院倫理委員會批準（批件號：［2020］KY213?01）。

1.2 方法

1.2.1 采集血液樣本

用EDTA抗凝管收集患者和健康對照的靜脈外周血10 mL，其中5 mL 低速離心機3 000 r/min 離心10 min，分離血清，用于ELISA 測量MGAT3 蛋白水平；另留存5 mL 全血用于qRT?PCR 測定circ_0070934、miR?199a?5p及MGAT3的表達水平。所有受試者的血液樣本均儲存于-80 ℃。

1.2.2 ELISA測定

人MGAT3 ELISA試劑盒（上海科興生物科技有限公司）對CARAS 患者和對照組血清樣本中MGAT3的含量進行檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行實驗和操作。

1.2.3 qRT?PCR檢測

使用RNAliquid 超速全血總RNA 提取試劑盒（北京匯天東方科技有限公司）提取總RNA，實驗步驟按照說明書進行。使用紫外線分光光度計對提取的RNA 濃度及純度進行檢測。采用FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司）進行反轉錄，合成mRNA cDNA/circRNA cDNA。采用miRNA 第一鏈cDNA 合成（加尾法）（上海生工生物工程股份有限公司）進行反轉錄。使用Super?Real PreMix Plus（SYBR Green）（北京天根生化科技有限公司）對mRNA和circRNA進行擴增，使用miR?NA 熒光定量PCR 試劑盒（染料法）（上海生工生物工程股份有限公司）對miRNA 進行擴增，用ABI 7300型熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。circ0070934 的內參為GAPDH，MGAT3 的內參為GAPDH+ACTB，miRNA 的內參為U6。MGAT3、circ_0070934、ACTB、GAPDH 的上下游引物和miR?199a?5p的上游引物由北京博邁德公司合成，U6 的上下游引物和miR?199a?5p 的下游引物為miRNA 熒光定量PCR 試劑盒提供的通用引物。引物序列如下：MGAT3（F：5′?TCCTGTTTCCCT?CACTGTGC?3′；R：3′?ACACACGCACAA?ACAT?GAGC?5′）；circ_0070934（F：5′?GGTGAAAG?GACT?GATCAACCAT?3′；R：5′?TGTCTTGAGCTT?TCCT?GCCT?3′）；miR?199a?5p（F：5′?CCCAGTGTT?CAGACTACCTGTTC?3′）；ACTB（F：5′?TCCGCAAA?GACCTGTACGC?3′；R：5′?CTGGAAGGTGGACAGC?GAG?3′）；GAPDH（F：5′?TCGACAGTCAGCCGCAT?CTTCTTT?3′，R：5′?ACCAAATCCGTTGACTCCGAC?CTT?3′）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件，計量資料采用Kol?mogorov?Smirnov 檢驗進行正態(tài)性檢驗，對符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，分類變量資料以比例表示，兩樣本比較采用t檢驗（正態(tài)分布的資料）或Mann?WhitneyU檢驗（非正態(tài)分布資料），相關關系采用Pearson 相關分析（正態(tài)分布的資料）或Spearman 秩相關分析（非正態(tài)分布的資料），受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線判斷診斷靈敏度與特異度，通過曲線下面積（area under the curve，AUC）判斷診斷效果，AUC=0.5，無診斷價值，AUC 越接近1，提示診斷越準確，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義（雙尾法）。

2 結果

2.1 研究對象的臨床特征

本研究納入38 例CARAS 患者及43 例健康對照，兩組年齡、性別、體重指數(shù)（body mass index，BMI）匹配。與健康對照組相比，CARAS 組患者肺功能第1 秒用力呼氣容積占預計值百分比（percent predicted forced expiratory volume in one? second，F(xiàn)EV1%pred）及第1 秒用力呼氣容積占用力肺活量比值（the first second forced expiratory volume ratio of forced vital capacity，F(xiàn)EV1/FVC）顯著降低（P<0.05），而嗜酸性粒細胞（eosinophils，EOS）絕對值、EOS 比例及呼出氣一氧化氮（FeNO）明顯高于對照組（P<0.001，表1）。

表1 研究對象臨床特征Table 1 Clinical characteristics of subjects

2.2 CARAS 組與健康對照組血漿MGAT3 的表達水平

ELISA 實驗結果顯示，CARAS 組患者外周血血漿MGAT3 的表達量（0.20±0.05）較對照組（0.32±0.31）明顯下降（P=0.035，圖1）。

圖1 CARAS組與健康對照組血漿MGAT3的表達水平Figure 1 Expression level of plasma MGAT3 in CARAS group and healthy control group

2.3 CARAS 組與健康對照組circ_0070934、miR?199a?5p及MGAT3的表達水平

qRT?PCR 結果顯示，與健康對照組相比，MGAT3 在CARAS 組中表達明顯降低（圖2A，P<0.001），circ_0070934 在CARAS 組中表達也明顯降低（圖2B，P=0.001），而miR?199a?5p 的表達量則明顯上調（圖2C，P=0.013）。

圖2 CARAS組與健康對照組外周血中MGAT3、miR?199a?5p和circ_0070934表達水平Figure 2 Expression levels of MGAT3，miR?199a?5p and circ_0070934 in peripheral blood of CARAS group and healthy control group

2.4 circ_0070934/MGAT3/miR?199a?5p 與CARAS患者臨床指標的相關性

CARAS 患者外周血MGAT3 mRNA 水平與EOS絕對值（r=0.412，P=0.011）、EOS 比例呈正相關（r=0.469，P=0.003），circ_0070934 與EOS 絕對值（r=-0.516，P=0.001）、EOS 比例呈負相關（r=-0.348，P=0.035）（表2，圖3）。MGAT3、circ_0070934與FeNO、FEV1%pred 及FEV1/FVC 沒有相關性。miR?199a?5p與EOS 絕對值、EOS 比例、FeNO、FEV1%pred 及FEV1/FVC均沒有明顯相關性（表2）。

圖3 circ_0070934/MGAT3與CARAS患者臨床指標的相關性Figure 3 Correlation between circ_0070934/MGAT3 and clinical indexes of CARAS patients

表2 circ_0070934/miR?199a?5p/MGAT3與CARAS患者臨床指標的相關性Table 2 Correlation between circ_0070934/miR?199a?5p/MGAT3 and clinical indexes of CARAS patients

2.5 circ_0070934/miR?199a?5p/MGAT3 在CARAS中的診斷效果

ROC 曲線分析以評估MGAT3、miR?199a?5p 和circ0070934 作為CARAS 生物標志物的價值（表3、圖4）。當界值（cut?off value）為0.208 時，MGAT3 mRNA作為CARAS 生物標志物的靈敏度為73.7%，特 異度 為100.0%，AUC 為0.933（95%CI：0.882～0.984，P<0.001），此指標作為CARAS 生物標志物的診斷價值最佳。多因素聯(lián)合診斷ROC 曲線分析（表3、圖5），當界值為0.539 時，MGAT3、miR?199a?5p 與circ_0070934 作為聯(lián)合診斷CARAS 的生物標志物的靈敏度為92.1%，特異度為93.0%，AUC 為0.959（95%CI：0.916～1.000，P<0.001）。

圖4 MGAT3、miR?199a?5p 和circ_0070934 作為CARAS生物標志物的ROC曲線分析Figure 4 ROC curve analysis of MGAT3，miR?199a?5p and circ_0070934 as CARAS biomarkers

圖5 MGAT3、miR?199a?5p和circ_0070934作為CARAS生物標志物的多因素聯(lián)合ROC曲線分析Figure 5 Multivariate combined ROC curve analysis of MGAT3，miR?199a?5p and circ_0070934 as CARAS biomarkers

表3 MGAT3、miR?199a?5p和circ_0070934作為CARAS生物標志物的價值Table 3 Value of MGAT3，miR?199a?5p，circ_0070934 as biomarkers of CARAS

3 討論

過敏性鼻炎和哮喘被認為是同一疾病的兩種表現(xiàn)，80%的哮喘患者患有過敏性鼻炎，而60%的過敏性鼻炎會發(fā)展為哮喘［2，8］。目前CARAS的診斷主要參照過敏性鼻炎和哮喘的兩個診治指南，尚無CARAS 相關診斷生物標志物的報道。本研究首次在CARAS 患者外周血中檢測circ_0070934/miR?199a?5p/MGAT3 水平，發(fā)現(xiàn)circ_0070934 與MGAT3的表達較健康對照下調，而miR?199a?5p 的表達水平上調。

研究報道，miR?199a?5p在中性粒細胞哮喘患者外周血及誘導痰液中的表達升高，并且和肺功能呈負相關，但與外周血EOS 無相關性［5］。本研究也未發(fā)現(xiàn)miR?199a?5p與CARAS患者EOS之間存在相關性，提示miR?199a?5p可能不參與調節(jié)EOS。但本研究發(fā)現(xiàn)CARAS患者的外周血circ_0070934表達水平與EOS絕對計數(shù)和EOS比例都呈負相關，MGAT3的表達水平則與之呈正相關，提示circ_0070934 和MGAT3可能與EOS炎癥密切相關，其具體機制有待進一步研究。

本研究用ROC 曲線分析circ_0070934、miR?199a?5p 和MGAT3 在CARAS 中的診斷價值，發(fā)現(xiàn)MGAT3取界值為0.208時，靈敏度和特異度高（分別為73.7%和100.0%），為最佳參數(shù)。其次是circ_0070934，取界值為0.620 時，靈敏度為71.1%，特異度為69.8%。而miR?199a?5p則相對較低，取界值為1.166 時，靈敏度為55.3%，特異度為72.1%。另外，本研究又對這些指標進行了多因素聯(lián)合的ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)當circ_0070934、miR?199a?5p 和MGAT3 3 個指標聯(lián)合時，對CARAS 的診斷價值最高，取界值為0.539 時，靈敏度為92.1%，特異度為93.0%?？梢钥闯觯趩我蛩卦\斷CARAS 時，MGAT3的診斷價值最高，但多因素聯(lián)合診斷的價值要明顯高于單因素，尤其是circ_0070934、miR?199a?5p 和MGAT3 3個檢測指標聯(lián)合后，對于CARAS 的診斷有著非常重要的意義。因此，外周血circ_0070934、miR?199a?5p 和MGAT3 都可以作為診斷CARAS 的潛在生物標志物，值得擴大樣本進一步驗證。

上皮?間充質轉化（epithelial?mesenchymal tran?sition，EMT）是上皮細胞呈現(xiàn)遷移性間充質表型的過程，EMT 可分為3種類型，Ⅰ型與胚胎著床、發(fā)育和器官形成相關，Ⅱ型與損傷修復、組織再生、纖維化和炎癥相關，Ⅲ型參與了癌癥的進展和轉移。其中，與特應性疾病相關的Ⅱ型EMT，對肺、鼻腔、腸道和皮膚的上皮更新和炎癥有很大影響［9］。EMT對正常組織修復和通過多種炎癥途徑發(fā)出信號至關重要。支氣管上皮細胞EMT 的增加會導致支氣管哮喘屏障功能障礙。支氣管哮喘的典型特征即慢性氣道炎癥、氣道重塑、氣道高反應和可逆性氣流受限，氣道重塑過程涉及氣道上皮細胞中纖維母細胞的增加，最終導致纖維化，而EMT 可以解釋這些纖維母細胞的起源［10］。EMT 在過敏性鼻炎中的研究相對較少，并且大多數(shù)研究主要使用患者的慢性鼻竇炎組織，通過活檢組織中EMT標志物將其分為發(fā)生鼻息肉和未發(fā)生鼻息肉的亞型［11］。

MGAT3基因最初在母雞輸卵管中被發(fā)現(xiàn)，由它編碼的N?乙酰氨基葡萄糖轉移酶3（N?acetylglucos?aminyltransferase Ⅲ，Gnt Ⅲ），參與了多種腫瘤的EMT 過程，對腫瘤細胞的遷移有調控作用［12］。在TGF?β1誘導處理的人肝癌細胞中，GnT Ⅲ基因表達及其催化產(chǎn)物——平分型N?乙酰葡萄糖胺（N?acetyl?glucosamine，GlcNAc）結構降低，Smad3和Erk1/2的磷酸化上調，最終導致了肝細胞癌的EMT［13］。Pinho等［14］發(fā)現(xiàn)，MGAT3和GnT Ⅲ介導的E?cadherin的N?糖基化丟失是EMT 的機制，在EMT 過程中，MGAT3的表達顯著降低。在宮頸癌中，MGAT3的過度表達導致上皮分化標志物E?cadherin 的表達增加，間充質標志物N?cadherin 和β?catenin 的表達降低，從而抑制了宮頸癌細胞轉移［15］。乳腺癌細胞中MGAT3的過度表達抑制了細胞遷移、增殖、集落形成、EMT標志物的表達和AKT信號通路［16］。另外，miR?199a?5p也在如卵巢癌、乳腺癌、喉癌、口腔鱗癌、甲狀腺癌、結直腸癌、侵襲性膀胱癌等多種惡性腫瘤中表現(xiàn)出了抑制EMT 的作用［17-23］。但在另外一些如肝細胞癌、胃癌、宮頸癌及前列腺癌等腫瘤中卻也可促進腫瘤細胞EMT的過程［24-27］。

雖然目前已有許多研究證實miR?199a?5p 和MGAT3 這兩種生物標志物在腫瘤細胞EMT 過程中發(fā)揮了不可或缺的作用，但其是否參與CARAS 的EMT 過程，從而影響患者氣道重塑過程尚未明確。而且對于circ_0070934 的研究較少，目前只知它參與了皮膚鱗狀細胞癌的侵襲和增殖［28］，但具體機制尚不清楚。探索circ_0070934/miR?199a?5p/MGAT3在CARAS EMT 中的作用和機制將成為下一步研究的目標，這對于發(fā)現(xiàn)CARAS新的治療靶點有著重要意義。

慢性鼻竇炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）常與支氣管哮喘和鼻炎共存［29］。研究表明，哮喘使鼻息肉的風險增加了3.5倍，過敏性鼻炎則使患鼻息肉的風險增加2.5 倍［30］。輕度和中度哮喘患者的鼻息肉患病率分別為4.8%和9.6%，而重癥哮喘患者達到44.6%［31］。鼻息肉和哮喘共?。╪asal polyps and comorbid asthma，NPCA）的患者有兩種不同的炎癥表型：嗜酸性和非嗜酸性，并且上下氣道的炎癥類型一致。與非嗜酸性NPCA 患者相比，嗜酸性NPCA 患者哮喘表型更嚴重，F(xiàn)eNO和IgE水平更高，血EOS增多，藥物治療后鼻息肉復發(fā)率也增加［32］。伴有CRSwNP的重癥哮喘通常是一種高EOS 類型，其特征是2 型固有淋巴細胞（innate lymphoid cells，ILC2）激活，釋放IL?5和IL?13，以及相對少量的IL?4［33］。這些細胞因子通過趨化EOS，促進氣道炎癥細胞浸潤［34-36］。另一項研究也發(fā)現(xiàn)，EOS計數(shù)和FeNO水平低的重癥哮喘患者鼻息肉的發(fā)生率顯著低于數(shù)值較高者，EOS 計數(shù)大于420 個/μL 和FeNO 水平≥39 ppb 是重癥哮喘伴隨鼻息肉的最佳預測因子［37］。鼻息肉的存在與哮喘患者的肺功能FEV1的加速下降顯著相關［38］。因此，鼻息肉的存在對哮喘患者的癥狀、表型、類型、嚴重度及預后都有著顯著影響，呼吸道過敏性疾病與鼻息肉同時存在無疑會加重炎癥過程，使治療受阻并復雜化，增加復發(fā)率。本研究并沒有納入鼻息肉，鑒于鼻息肉的存在與EOS 和FeNO 有正相關性，而本研究發(fā)現(xiàn)circ_0070934/miR?199a?5p/MGAT3 與EOS和FeNO 有相關性，因此合理猜測circ_0070934/miR?199a?5p/MGAT3與鼻息肉也存在某種聯(lián)系，其具體作用機制值得進一步研究探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)circ_0070934/miR?199a?5p/MGAT3 可以作為CARAS 診斷的生物標志物。CARAS的發(fā)生發(fā)展機制仍有許多未明晰的地方，本研究僅挑選circ_0070934/miR?199a?5p/MGAT3作為切入點探索這些指標在CARAS 患者外周血中的表達水平及其意義，其具體作用機制需進一步深入研究，為CARAS的早期診斷和治療提供更多思路和理論支持。