吸入CDDO?NO對野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓的作用

伍雪橙，李 南，黃 文，周淑蘭，周 宏，黃張建，孔 輝，解衛(wèi)平*

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，江蘇 南京 210029；2中國藥科大學新藥研究中心天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一種以肺血管重構和肺血管負荷進行性增加為特征的病理生理狀態(tài)，可致右心室肥厚和重構，最終導致患者右心衰竭和死亡［1］。與PAH 相關的經典信號通路包括內皮素途徑，一氧化氮（nitric oxide，NO）途徑和前列環(huán)素途徑［2］。PAH 病理生理機制復雜，目前指南推薦大多數PAH患者初治聯合用藥［3］。然而，這些靶向藥物費用較高，存在一定不良反應，且隨療程延長療效逐漸減弱。因此，探索治療PAH的新策略，延長患者生存期、改善預后，已成為目前亟待解決的重要問題。

NO是一種重要的血管內皮源性舒張因子。NO進入細胞后通過激活鳥苷酸環(huán)化酶?環(huán)磷酸鳥苷?蛋白激酶G途徑，使胞內Ca2+濃度降低，引起肺動脈平滑肌舒張，從而降低肺動脈壓力［4-5］。然而，外源性吸入NO在治療PAH中應用受限，其半衰期短，治療窗窄，可導致高鐵血紅蛋白血癥等不良反應［6］。NO供體，包括硝酸甘油、單硝酸異山梨酯（isosorbide 5?mononitrate，ISMN）和硝普鈉等，由于其對體循環(huán)降壓作用明顯，也不適用于PAH 的治療［7］。但研究發(fā)現，以吸入方式使用NO供體，則可選擇性舒張肺血管，可能具有治療PAH的潛力［8］。

齊墩果酸是一種從油橄欖葉子中提取的具有抗炎、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤作用的三萜類化合物，可用于治療肝損傷、肝纖維化等疾?。?］。2?氰基?3，12?二氧齊墩果烷?1，9（11）?二烯?28?酸甲酯（bardoxolone methyl，CDDO?Me），即甲基巴多索隆，是一種半合成齊墩果酸衍生物。CDDO?Me 具有抗氧化應激及抗炎性損傷的作用。一方面，CDDO?Me 促進核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2?related factor 2，Nrf2）向核內轉位，后者結合抗氧化反應元件（anti?oxidant response element，ARE），誘導多個抗氧化基因轉錄，翻譯出醌氧化還原酶（NADPH dehydroge?nase quinone 1，NQO?1）、血紅素加氧酶1（heme?oxy?genase?1，HO?1）等蛋白，發(fā)揮抗氧化應激效應；另一方面，CDDO?Me減少核因子?κB（nuclear factor kappa?B，NF?κB）向核內移位，降低下游炎癥因子表達，發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用［10-11］。因此，CDDO?Me 通過活化Nrf2 及抑制NF?κB，減輕氧化應激及炎癥對肺血管的損傷，可能具有抑制肺血管重構的作用。

本課題組與中國藥科大學合作，基于CDDO?Me及ISMN 化學結構特點合成一種新型NO 供體型CDDO?Me 衍生物CDDO?NO（a novel hybrid from CDDO?Me and NO donor isosorbide 5?mononitrate）。在肺內CDDO?NO 可經酯酶水解緩慢釋放NO 分子和CDDO?Me，理論上具有同時舒張肺血管、抑制血管重構的雙重效應。本研究通過建立野百合堿（monocrotaline，MCT）誘導的大鼠PAH模型，研究吸入CDDO?NO 對PAH 大鼠肺血管重構的作用，并比較其與母體化合物CDDO?Me 的效應，為治療PAH開發(fā)針對多靶點的新型化合物。

1 材料和方法

1.1 材料

清潔級雄性SD 大鼠36 只，體重（270±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，本實驗所有操作經南京醫(yī)科大學實驗動物福利倫理審查委員會許可（倫理編號：IACUC?2106004）。CDDO?NO和CDDO?Me 由中國藥科大學天然藥物國家重點實驗室提供。MCT（Sigma 公司，美國），蘇木素伊紅（hematoxylin?eosin，HE）染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），抗α?平滑肌肌動蛋白（α?smooth muscle actin，α?SMA）抗體（Abcam公司，英國），馬松三色染色（Masson trichrome staining，MTS）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），口鼻暴露式霧化吸入裝置（Scireq公司，加拿大）。

1.2 方法

1.2.1 建立MCT誘導的大鼠PAH模型和給藥方案

SD 大鼠36 只，自適應1 周后隨機分為6 組（每組6 只）：①對照組（Con 組）；②MCT 組；③MCT+10 μg/kg CDDO?NO 組（MCT+10NO 組）；④MCT+30 μ g/kg CDDO?NO 組（MCT+30NO 組）；⑤MCT+7 μg/kg CDDO?Me組（MCT+7Me組）；⑥MCT+21 μg/kg CDDO?Me 組（MCT+21Me 組）。其中③和⑤組屬低劑量藥物組，④和⑥組屬高劑量藥物組。Con 組腹腔注射生理鹽水1 mL，其余各組均給予60 mg/kg MCT 腹腔注射1次造模，藥物治療各組在MCT 注射1 h 后通過口鼻暴露式霧化吸入裝置給藥。后每日霧化吸入給藥，共28 d。

1.2.2 右心導管測定大鼠右心室收縮壓（right ven?tricular systolic pressure，RVSP）

大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）充分麻醉后仰臥位固定，頸前區(qū)作一2～3 cm 切口，鈍性分離頸部皮下組織并剝離頸外及頸內靜脈，選擇頸外或頸總靜脈剪一V 型切口，微型導管連接壓力傳感器（TSD104A 壓力換能器，BIOPAC Systems 公司，美國），經靜脈切口送入上腔靜脈，根據16通道生理信號記錄分析儀（MP100，BIOPAC Systems，美國）上顯示的波形變化判斷導管位置，當導管到達右心室后記錄RVSP。

1.2.3 測定右心肥厚指數（right ventricular hypertro?phy index，RVHI）及右室/體重比（RV?to?body weight ratio，RV/BW）

RVSP 測定完畢后收集大鼠心臟組織，沿室間隔邊緣游離出右心室（right ventricle，RV）及左心室+室間隔（left ventricle+septum，LV+S）。濾紙吸干水分后分別稱量RV 和LV+S，計算RV/（LV+S）比值，即為RVHI。隔日稱量大鼠體重，計算大鼠第29 天的RV/BW。

1.2.4 HE 染色檢測肺小動脈中膜層厚度（pulmo?nary artery medial thickness，PAMT）

收集大鼠肺組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h后石蠟包埋，制成5 μm切片后進行HE染色，于光學顯微鏡下（×400）觀察肺小動脈形態(tài)學改變。每個樣本拍攝20個直徑30～100 μm的小動脈，選取血管長軸和短軸并用Image Pro Plus 6.0軟件分別測量其內徑和外徑，計算PAMT=［（外徑-內徑）/外徑］×100%。

1.2.5 HE 染色檢測心肌細胞橫截面積（cross?sec?tional area，CSA）

收集右心組織后置于4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片后行HE 染色，置于光學顯微鏡下（×400）觀察右心室心肌細胞橫截面，采用Image J軟件隨機統(tǒng)計20個心肌細胞的CSA。

1.2.6 Masson 三色染色測定肺小動脈外膜膠原纖維沉積百分比

肺組織石蠟切片均按Masson 三色染色試劑盒步驟說明進行操作。光鏡下（×400）隨機選取15～20 個肺小動脈，Image Pro Plus 6.0 軟件統(tǒng)計膠原纖維沉積（藍色）面積與總面積的比值，評估肺小動脈外膜纖維化程度。

1.2.7 α?SMA 免疫組織化學染色測定肺小動脈肌化程度

石蠟切片脫蠟水化，抗原修復液微波修復，3%雙氧水浸泡15 min 滅活過氧化物酶，5%BSA 封閉30 min，滴加1∶200的α?SMA 一抗工作液于玻片上，4 ℃孵育過夜，二抗1∶2 000孵育1 h，二氨基聯苯胺顯色10 min后自來水沖洗，蘇木素快速染色10～30 s，自來水沖洗，脫水透明后中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察（×400），根據肺小動脈α?SMA陽性表達部分（棕黃色）占血管周徑的比例，將其分為非肌化（<25%）、部分肌化（25%～75%）和完全肌化（>75%）3種類型的血管，統(tǒng)計各類型血管所占百分比。

1.3 統(tǒng)計學方法

數據分析及作圖采用GraphPad Prism 6.0 軟件。所有數據以均數±標準差（）表示。單因素多個樣本均數比較采用單因素方差分析，組間比較使用LSD 法。兩因素多個樣本均數比較采用雙因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CDDO?NO 對MCT 誘導的PAH 大鼠體重增長、RVSP、RVHI和RV/BW的影響

大鼠體重監(jiān)測結果顯示：與Con組相比，MCT造?？墒勾笫篌w重增長顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖1A）。與MCT 組相比，低劑量藥物組（MCT+10NO 組和MCT+7Me 組）可改善大鼠體重增長（P<0.05，圖1A），而高劑量組（MCT+30NO 組和MCT+21Me 組）對其體重增長無顯著改善作用（P>0.05）。

RVSP 是間接反映肺動脈壓力的重要指標。右心導管測定結果顯示MCT組RVSP較Con組顯著升高（P<0.05，圖1B）。與MCT 組相比，CDDO?NO 和CDDO?Me均可顯著降低RVSP（P<0.05），其中同一給藥的高劑量組RVSP較低劑量組有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。CDDO?NO組與其同等劑量的CDDO?Me組相比，差異亦無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖1 CDDO?NO對MCT誘導的PAH大鼠體重增長、RVSP、RVHI和RV/BW的影響Figure 1 Effects of CDDO?NO on weight gain，RVSP，RVHI and RV/BW in MCT?induced PAH rats

RVHI 和RV/BW 均是反映右室肥厚程度的指標。結果表明與Con 組相比，MCT 組大鼠RVHI 和RV/BW 升高（P<0.05，圖1C、D）。與MCT 組相比，CDDO?NO和CDDO?Me可降低大鼠RVHI和RV/BW（P<0.05，圖1C、D）。同一藥物高低劑量比較發(fā)現，MCT+30NO組的RVHI和RV/BW較MCT+10NO組顯著降低（P<0.05），CDDO?Me組間右室重構指標差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。比較不同藥物同等劑量組發(fā)現，低劑量CDDO?NO 和CDDO?Me 組間效應差異無顯著統(tǒng)計學意義（P>0.05），而MCT+30NO組抑制右室重構作用顯著強于MCT+21Me組（P<0.05）。

2.2 CDDO?NO對MCT誘導的PAH大鼠PAMT的影響

因結果2.1 表明高劑量藥物組（MCT+30NO 組和MCT+21Me 組）在改善血流動力學和右室重構指標方面分別優(yōu)于其對應低劑量組（MCT+10NO 組和MCT+7Me組），故后續(xù)研究對Con組、MCT組、MCT+30NO組和MCT+21Me組進行病理學形態(tài)分析。HE染色顯示Con 組血管壁薄，厚度均勻一致（圖2A）。與Con組相比，MCT組管壁厚度不均，中膜層明顯增厚，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖2B）。與MCT組相比，MCT+30NO 組PAMT 明顯下降（P<0.05，圖2B）。與MCT+21Me 組相比，MCT+30NO 組降低PAMT效果更加明顯（P<0.05，圖2B）。

圖2 CDDO?NO對MCT誘導的PAH大鼠肺小動脈中膜層厚度的影響Figure 2 Effects of CDDO?NO on pulmonary arterial medial wall thickness in MCT?induced PAH rats

2.3 CDDO?NO 對MCT 誘導的PAH 大鼠右心室心肌肥大的影響

心肌細胞CSA 分析顯示，Con 組心肌細胞排列規(guī)則，形態(tài)一致，大小均一（圖3A）。與Con組相比，MCT組細胞排列紊亂，形態(tài)不規(guī)整，胞核增大，CSA增大，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖3B）。與MCT組相比，MCT+30NO組和MCT+21Me組心肌細胞肥大均有所改善，CSA顯著降低，但MCT+30NO組降低CSA的效果顯著優(yōu)于MCT+21Me組（P<0.05，圖3B）。

圖3 CDDO?NO對MCT誘導的PAH大鼠右心室心肌細胞肥大的影響Figure 3 Effects of CDDO?NO on right ventricular cardiomyocyte hypertrophy in MCT?induced PAH rats

2.4 CDDO?NO 對MCT 誘導的PAH 大鼠肺小動脈外膜膠原沉積的影響

如圖4A所示，光鏡下Con組肺小動脈外膜膠原（藍色）沉積少。MCT組較Con組膠原沉積面積增加（P<0.05，圖4B）。與MCT組相比，MCT+30NO組及MCT+21Me組小動脈外膜纖維化程度得到明顯改善（P<0.05，圖4B），且MCT+30NO 組改善效果較MCT+21Me組更佳（P<0.05，圖4B）。

圖4 CDDO?NO對MCT誘導PAH大鼠肺小動脈外膜膠原沉積的影響Figure 4 Effects of CDDO?NO on collagen deposition of pulmonary artery in MCT?induced PAH rats

2.5 CDDO?NO 對MCT 誘導PAH 大鼠肺小動脈肌化程度的影響

如圖5A 所示，Con 組α?SMA 陽性部分面積少，肺小動脈以非肌化血管為主。與Con 組相比，MCT組以完全肌化型血管為主，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖5B）。與MCT組相比，MCT+30NO組給藥治療可明顯降低完全肌化血管比例，增加非肌化和部分肌化血管比例（P<0.05，圖5B）。與MCT+21Me組相比，MCT+30NO 組完全肌化血管顯著減少（P<0.05，圖5B）。

圖5 CDDO?NO對MCT誘導PAH大鼠肺小動脈肌化程度的影響Figure 5 Effects of CDDO?NO on muscularization of pulmonary artery in MCT?induced PAH rats

3 討論

肺血管重構是PAH的基本病理特點，即內膜增生、中膜肥厚、外膜增厚伴膠原過度沉積和周圍炎性細胞浸潤等［12］，主要累及直徑50～500 μm 的毛細血管前血管［1］，這些病理改變引起管腔狹窄甚至血管閉塞，從而升高肺動脈壓力。同時，右心室后負荷隨之增加，隨PAH進展，出現心肌肥厚、心室擴張和心肌纖維化等病理改變。CDDO?Me 作為一種合成類齊墩果酸衍生物，可通過活化Nrf2、抑制NF?κB發(fā)揮抗氧化和抗炎作用。吸入NO供體作為局部應用手段，具有選擇性舒張肺血管、降低肺動脈壓的潛力。本課題組與中國藥科大學合作，基于ISMN和CDDO?Me 結構特點，合成一種新型NO 供體型CDDO?Me衍生物CDDO?NO。本課題組前期研究已發(fā)現，氣道滴入CDDO?NO 在肺內的總代謝時間（約12 h）是CDDO?Me 氣道給藥（約6 h）的2倍［13-14］。同時，CDDO?NO 霧化給藥后，未在大鼠血漿中檢測到CDDO?NO，而是檢測到CDDO?Me，提示CDDO?NO已在肺組織代謝，表明CDDO?NO 經霧化給藥后靶向輸送至肺組織，對肺循環(huán)選擇性較好。在MCT誘導的大鼠PAH模型中，發(fā)現吸入單一小劑量CDDO?NO（3 μg/kg）即可降低MCT誘導PAH大鼠的肺動脈壓力，抑制肺小動脈重構和心肌纖維化，且3 μg/kg CDDO?NO 治療效果優(yōu)于單用2.1 μg/kg CDDO?Me、單用0.78 μg/kg ISMN 和聯用2.1 μg/kg CDDO?Me +0.78 μg/kg ISMN［13-14］。此外，CDDO?NO 還可通過抑制NADPH氧化酶4，減少肺小動脈周圍細胞增殖和巨噬細胞浸潤，降低氧化應激水平。但本課題組前期基于小劑量CDDO?NO 的研究無法完全揭示CDDO?NO用于治療PAH的安全性和藥效劑量范圍。因此，本研究進一步提高CDDO?NO劑量，確認該化合物用于PAH大鼠的安全性及治療學效應，發(fā)現吸入10、30 μg/kg CDDO?NO和7、21 μg/kg CDDO?Me均可劑量依賴性地降低大鼠RVSP和RVHI，減輕中膜肥厚和肌化，減少外膜膠原沉積，抑制心肌肥大，且CDDO?NO（30 μg/kg）效果優(yōu)于母體化合物CDDO?Me（21 μg/kg）。4種劑量化合物均不減少MCT模型大鼠體重增長，提示10、30 μg/kg CDDO?NO 和7、21 μg/kg CDDO?Me對PAH模型大鼠總體安全。

CDDO?Me 是有效的Nrf2 激活劑和NF?κB 抑制劑。目前，已完成CDDO?Me 治療PAH 的Ⅱ期臨床試驗（NCT02036970），發(fā)現口服CDDO?Me可有效改善PAH 患者活動耐力，提高6 min 行距離［15］。氧化應激是PAH發(fā)病的關鍵因素之一，Nrf2?ARE是重要的抗氧化應激通路。Dianat等［16］研究發(fā)現MCT誘導的大鼠PAH 模型中肺組織氧化應激標志物水平升高，抗氧化基因1（oxidation resistance 1，OXR1）和Nrf2 基因表達顯著降低，連續(xù)腹腔注射藏紅花素21 d后可通過提高肺內OXR1和Nrf2表達增強肺組織抗氧化能力，抑制肺血管重構。HIV 感染患者可并發(fā)PAH，Simenauer等［17］研究發(fā)現HIV轉錄反式激活因子（HIV transactivator of transcription，Tat）與其密切相關。HIV 感染細胞分泌高水平Tat 至外周循環(huán)并被周圍細胞內化，在胞內誘發(fā)促氧化環(huán)境。在人原代肺動脈內皮細胞中即使存在強效Nrf2 激活劑PB125，Tat 仍可顯著抑制Nrf2?ARE 通路，降低下游NQO?1、HO?1等抗氧化蛋白表達，增加活性氧、硝基酪氨酸生成，表明HIV Tat 通過抑制Nrf2?ARE 通路增加細胞氧化應激負荷。以上研究均提示Nrf2通路在PAH 發(fā)病機制中具有重要作用。NF?κB 是許多炎癥因子表達的關鍵轉錄因子，參與調節(jié)免疫、炎癥反應。NF?κB 活化控制著超500 個基因的表達，而其中大部分在失調時對人體有害［18］。Hong等［19］分別對MCT 和SU5416/缺氧誘導的PAH 大鼠肺組織進行單細胞測序，發(fā)現在兩種模型中廣泛存在NF?κB、TNF?α信號上調，提示NF?κB通路在PAH發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現吸入CDDO?Me 可 降 低MCT 誘 導PAH 大 鼠的RVSP、RVHI 和RV/BW，抑制肺血管和右心室重構，Nrf2 和NF?κB通路在其中的作用有待進一步研究證實。

肺動脈內皮細胞NO調控失衡可導致平滑肌張力增加和血管重構，促進PAH 發(fā)生發(fā)展。然而NO是一把雙刃劍，它既可舒張肺血管、抑制血栓形成、抑制平滑肌細胞增殖和遷移［20］，也可與活性氧結合產生活性氮，當其產生超過機體自我調節(jié)能力時，可使蛋白質硝化、脂質過氧化、抑制細胞呼吸鏈介導細胞死亡［21］。因此，直接吸入NO 治療PAH 治療窗窄，難以應用于臨床。然而，吸入NO 供體，如霧化吸入硝酸甘油等［8］，對肺循環(huán)選擇性較好，具有治療PAH的潛力。

本課題組與中國藥科大學共同研發(fā)了NO供體型CDDO?Me衍生物CDDO?NO，在肺內CDDO?NO被分解為CDDO?Me和ISMN，CDDO?Me在局部發(fā)揮抗炎、抗氧化和抗纖維化作用而抑制肺血管重構，ISMN釋出NO 選擇性舒張肺血管。因此，CDDO?NO具有抑制血管重構和舒張肺血管的雙重效應。本研究發(fā)現，吸入CDDO?NO減輕MCT誘導的PAH大鼠肺血管重構和右心室肥厚，且CDDO?NO（30 μg/kg）治療效應優(yōu)于對應劑量的母體化合物CDDO?Me（21 μg/kg）。然而，CDDO?NO對Nrf2和NF?κB通路的具體分子生物學效應，以及是否存在其他治療學機制，仍需進一步研究。

綜上所述，本研究結果表明吸入CDDO?NO 可通過抑制肺血管重構減輕MCT誘導的大鼠PAH，效果優(yōu)于母體化合物CDDO?Me。在下一步研究中，仍需進一步探索CDDO?NO 相關作用的具體分子生物學機制，有望為治療PAH 提供既可霧化吸入給藥、又能聯合多靶點治療的新型化合物。