基于SSR標記的萵苣品種鑒定體系的建立及應用

凌 晨，趙 洪，顏 軍，馬瑩雪，馮艷芳， 張靖立，李 波，鄧 超，徐振江

(1.華南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，廣東 廣州 510642；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100122； 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測試(上海)分中心，上海 201415；4.上海市農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準 與檢測技術研究所，上海 201403；5.衡陽市蔬菜研究所，湖南 衡陽 421001；6.北京市農(nóng)林科學院，北京 100097)

萵苣(LactucasativaL.)是菊科萵苣屬植物，染色體數(shù)為2n=18。栽培萵苣按產(chǎn)品器官分為葉用萵苣和莖用萵苣。葉用萵苣在世界范圍內(nèi)廣泛種植，按葉的生長形態(tài)可分為散葉萵苣、半結球萵苣和結球萵苣[1]。莖用萵苣是葉用萵苣傳入我國后經(jīng)過多年選擇培育逐漸演變而來的特色萵苣類型[2]，主要在我國種植。我國是萵苣主產(chǎn)國之一，近10 a萵苣產(chǎn)量占全球產(chǎn)量1/2以上[3]。我國莖用萵苣種質(zhì)資源較豐富，多為地方品種，葉用萵苣種質(zhì)資源多從國外引進，早期育種家多以表型特征對萵苣命名，不同科研單位或公司可能重復從國外引種并加以不同命名，加上國內(nèi)各地區(qū)頻繁引種，導致萵苣種質(zhì)資源混雜和親緣關系混亂[4]，存在“一品多名”和“同名異種”情況，給萵苣種質(zhì)資源收集鑒定、品種選育和市場監(jiān)管等帶來困難，有必要建立萵苣品種快速精準的鑒定技術體系。

目前，常用的品種鑒定方法包括形態(tài)學標記法(表型)和DNA分子標記法[5]。相比形態(tài)學標記，分子標記耗時短、成本低，不受環(huán)境、地域和季節(jié)影響，是品種快速鑒定常用方法之一。SSR標記具有多態(tài)性好、共顯性遺傳、平臺通用性好、數(shù)據(jù)統(tǒng)計較簡單、易于標準化等優(yōu)點，是我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《植物品種鑒定 DNA分子標記法 總則》(NY/T 2594—2016)品種分子鑒定的主要推薦標記之一[6]。

SSR分子標記技術在萵苣種質(zhì)資源評價和品種鑒定中已有廣泛應用。梁照文等[7]開發(fā)出了9個SSR標記，用于對野生萵苣及其近似種的分類鑒定及遺傳多樣性分析；Hong等[8]利用58個SSR標記對葉用萵苣品種和野生萵苣進行鑒定和分類；魏仕偉等[5]利用22個SSR標記對27個葉用萵苣進行品種鑒定。此外，SSR標記在親緣關系分析和起源探究[9]、遺傳圖譜構建[10]、基因定位和分子標記輔助選擇[11]等也有應用。前人研究報道大多針對葉用萵苣，將SSR分子標記同時應用于葉用萵苣和莖用萵苣的研究鮮有報道，亦未見建立基于SSR標記的萵苣品種鑒定體系的報道。基于高通量檢測平臺的品種鑒定體系要求核心引物具有多態(tài)性高，等位變異易于區(qū)分，數(shù)據(jù)易于統(tǒng)計，重復性好，染色體分布情況清楚，在基因組上均勻分布等特點[6]；為大批量樣品檢測，提高檢測效率，最好具有多重擴增或多重電泳的潛力。

本試驗在前人研究基礎上，利用熒光毛細管電泳平臺篩選出一套符合品種鑒定體系要求，可通用于葉用萵苣和莖用萵苣的SSR引物，并以此構建萵苣品種的指紋數(shù)據(jù)庫，旨在為萵苣品種的快速鑒定、遺傳多樣性分析及萵苣品種DUS測試輔助篩選近似品種提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

233個供試萵苣品種詳見表1，其中1～85號由北京市農(nóng)林科學院提供，86～149號由國家園藝種質(zhì)資源庫-北京蔬菜分庫(國家蔬菜種質(zhì)資源中期庫)提供，150～186號由上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心提供，187～219號由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種保藏中心提供，220～233號由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測試(上海)分中心提供。233個供試品種中同名品種共24個(8組)，均為莖用萵苣。

表1 233個供試萵苣品種信息Tab.1 Information of 233 lettuce varieties used in this study

表1(續(xù))

1.2 SSR引物

從相關文獻[5，7-8，12-19]中挑選出245對SSR引物，用于高多態(tài)性引物的初步篩選，在初篩出的引物上游5′端按擴增產(chǎn)物片段大小標記熒光染料(6-FAM、HEX、ROX或TAMRA)。普通引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，熒光引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 DNA提取

每個品種取15～20株幼苗嫩葉片，用改良CTAB法[20]提取DNA，用微量分光光度計和1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和質(zhì)量，原液-80 ℃保存，工作液-20 ℃保存。

1.4 PCR擴增

PCR反應體系20 μL，其中DNA(濃度50 ng/μL)2 μL，上下游引物(濃度0.25 μmol/L)各0.5 μL，2×Taq Plus Master Mix 10 μL，超純水7 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.5 擴增產(chǎn)物檢測

聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測：PCR產(chǎn)物用8% PAGE，80 W電泳1.0～1.5 h，銀染、拍照保存。熒光毛細管電泳檢測：PCR產(chǎn)物視不同熒光染料稀釋50～100倍，毛細管電泳體系為10 μL，其中稀釋過的PCR擴增產(chǎn)物1 μL，分子內(nèi)標(LIZ 500)0.1 μL，去離子甲酰胺8.9 μL，振蕩混勻、離心，95 ℃變性5 min，冷卻后瞬時離心，DNA分析儀(ABI3730)分型，依據(jù)分子內(nèi)標在SSR指紋分析器中校準，讀取數(shù)據(jù)。

1.6 田間種植對比鑒定

在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測試(上海)分中心測試基地對分子上未能區(qū)分的品種進行1個生長周期的田間種植對比鑒定。試驗設計：2020年11月初發(fā)芽箱恒溫恒濕催芽，穴盆育苗，大棚栽培，栽培地前茬種植辣椒。每個品種種植小區(qū)面積12 m2，小區(qū)寬畦高壟平行種植，畦面帶溝寬1.45 m，每個畦面種植3行，株行距35 cm×40 cm，設2個重復，每個品種種植不少于60株。視植株生長情況定時定量滴灌澆水，田間管理參照大田生產(chǎn)。萵苣生長過程中底肥施復合肥，追肥施尿素和復合肥。定期施藥，包括聯(lián)苯肼酯、苯醚甲環(huán)唑、綠妃、吡蟲啉、噻菌銅、嘧霉異菌脲、嘧菌脂、烯酰晴霜唑、銀法利、滅蠅胺等防治蚜蟲、霜霉病、灰霉病、軟腐病、白粉病、枯萎病等病蟲害，不同時期視植株生長情況及病蟲害發(fā)生情況混合不同藥液對植株進行葉面噴施。測試性狀和測試方法：參照《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 萵苣》(NY/T 2559—2014)(以下簡稱萵苣測試指南)[21]，根據(jù)不同性狀觀測要求，選取具有代表性的植株進行測量記錄，按照分級范圍轉換成代碼進行性狀分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用Powermarker v3.25軟件[22]分析品種的遺傳多樣性，計算各引物的PIC值、等位基因數(shù)；用MEGA 4.0軟件[23]構建基于品種間Nei′s遺傳距離的UPGMA聚類圖。

2 結果與分析

2.1 引物初篩

從233個萵苣品中選出掛絲紅萵筍(No.87)、紫皮萵苣(No.90)、尖葉萵筍(No.89)、碧玉生菜(No.86)、庫斯托(No.216)、KNV000226(No.150)、綠珊瑚(No.224)和伊賽斯(No.193)等8個形態(tài)差異大、不同類型的萵苣品種用于引物初篩。245對引物通過PCR擴增以及8% PAGE分析，初篩出81對擴增穩(wěn)定、多態(tài)性較高、帶型較清晰的引物。圖1為引物a～c的電泳結果，引物c擴增不穩(wěn)定；引物b多態(tài)性較低；引物a多態(tài)性較高，擴增穩(wěn)定，帶型較清晰，選為初篩引物。按照此標準，從245對引物中選出81對初篩引物，進入復篩。

M.DNA分子量標準；1—8.掛絲紅萵筍、紫皮萵苣、尖葉萵筍、 碧玉生菜、庫斯托、KNV000226、綠珊瑚、伊賽斯。 M.DNA Marker；1—8.Guasihongwosun，Zipiwoju，Jianyewosun， Biyushengcai，Kusituo，KNV000226，Lüshanhu，Yisaisi.

2.2 引物復篩

對81對初篩引物添加熒光標記，對90個萵苣品種進行PCR擴增，毛細管電泳檢測，復篩出41對多態(tài)性高、擴增穩(wěn)定、峰形信息易讀取、重復性好的熒光引物。圖2為引物SML-015(No. WJS2)[21]和引物LSSB48[6]在耐寒二白皮中檢測到的等位基因，前者檢測到的峰形信息容易讀取，后者檢測到的峰形信息較難讀取。依據(jù)峰型讀取難易程度，二者比較優(yōu)先選擇引物SML-015。根據(jù)各引物在染色體上分布情況、區(qū)分率等，從41對復篩引物中進一步篩選出22對核心引物，22對核心引物較為均勻地分布在9條染色體上(表2)。22對核心引物為最優(yōu)核心引物數(shù)量，從剩余19對復篩引物中選擇增加引物，不能進一步提高區(qū)分率。

圖2 引物SML-015(A)和LSSB48(B)在耐寒二白皮中檢測到的等位基因Fig.2 Alleles detected in Naihanerbaipi using primer SML-015(A)and LSSB48(B)

2.3 萵苣品種鑒定體系的建立

利用22對核心引物采集233個萵苣品種的指紋數(shù)據(jù)，22對核心引物在233個萵苣品種中共檢測到269個等位基因，每對引物檢測到等位基因為4～22個，平均為12.23個，其中引物LSE-79(No.WJS16)[17]、LSE-83(No.WJS17)[17]、LSSA28-1(No.WJS21)[19]檢測到等位基因數(shù)最多(均為22個)。22對核心引物PIC值為0.37～0.89，平均為0.73，其中引物WSULs153(No.WJS4)[13]、LSE-79(No.WJS16)[17]、LSSA28-1(No.WJS21)[19]的PIC值最高(均為0.89)。統(tǒng)計22對核心引物等位基因，為不同引物的不同等位基因命名并選擇相應的參照樣品(表2)，用于矯正或消除系統(tǒng)誤差，保證指紋數(shù)據(jù)的準確性。

表2 22對核心引物及其等位基因的參照樣品Tab.2 22 core primers and reference samples for each allelic variation

表2(續(xù))

2.4 萵苣品種遺傳多樣性分析

利用Powermarker軟件分析品種的遺傳多樣性，各品種間遺傳相似系數(shù)在0～1.000，平均為0.746。聚類分析結果如圖3所示，233個供試萵苣品種分為兩大類群：G1類群包含96個品種，主要為莖用萵苣(90個)，少部分為葉用萵苣(散葉萵苣5個，半結球萵苣1個)；G2類群包含137個品種，葉用萵苣132個(散葉萵苣47個，半結球萵苣57個，結球萵苣28個)，少部分為莖用萵苣(5個)。G2類群的葉用萵苣中，結球萵苣趨于聚成一類，半結球萵苣趨于聚成一類，但相比結球萵苣較分散，散葉萵苣難以聚成一類。

2.5 分子標記無差異品種的田間鑒定

田間表型鑒定是植物品種身份鑒定最直接的鑒定方式，也是品種身份的最終鑒定方式。22對核心引物未能區(qū)分的品種共6組15個品種(圖3)，第1組：紅運當頭(No.187)、紅劍(No.209)、紅脆(No.211)、飛橋萵苣(No.223)；第2組：翡翠香萵(No.191)、武青一號(No.220)、澳立青(No.227)；第3組：KNV000246(No.162)、KNV000247(No.176)；第4組：布萊克柔絲(No.203)、KAY010(No.214)；第5組：紅葉筍(No.101)、紫葉筍(No.104)；第6組：伊賽斯(No.193)、四季白尖葉(No.217)。其中紅葉筍和紫葉筍在株高(50 cm/40 cm)、葉面褶皺(微皺/多皺)2個性狀上有明顯差異，伊賽斯和四季白尖葉為不同類型萵苣，均不需安排田間表型鑒定。將其他4組品種進行田間種植對比試驗，按照萵苣測試指南對30個基本性狀進行觀測。結果表明，第1組品種中，飛橋萵苣和紅脆在數(shù)量性狀肉質(zhì)莖長度和假質(zhì)量性狀肉質(zhì)莖肉色中存在代碼差異，但均未達到明顯差異水平，判定為相同品種；二者與紅劍在數(shù)量性狀肉質(zhì)莖長度上有明顯差異，與紅運當頭在數(shù)量性狀肉質(zhì)莖長度和抽薹始期、假質(zhì)量性狀肉質(zhì)莖形狀上有明顯差異；紅運當頭和紅劍在假質(zhì)量性狀肉質(zhì)莖形狀上有明顯差異。第2組品種武青一號和澳立青在30個性狀中均無明顯差異，判定為相同品種；二者與翡翠香萵在數(shù)量性狀植株株幅和抽薹始期上有明顯差異。第3組品種KNV000246和KNV000247在30個性狀中均無明顯差異，判定為相同品種。第4組品種布萊克柔絲和KAY010在質(zhì)量性狀葉片葉脈和葉姿態(tài)(10～12片期)、葉姿態(tài)(商品收獲期)、葉片泡狀程度、葉片邊緣波狀程度等4個數(shù)量性狀、葉形狀和葉先端形狀等2個假質(zhì)量性狀上有明顯差異。田間鑒定結果表明，有3組品種表型田間鑒定無明顯差異，判定為相同品種，有3組品種表型田間鑒定無明顯差異，判定為相同品種，大部分分子標記無差異品種在30個測試性狀中無明顯差異(表型相同)，或僅有2～3個數(shù)量性狀/假質(zhì)量性狀有明顯差異(表型近似)。本試驗供試萵苣實際品種數(shù)量為230個，22對核心引物能將230個品種中的220個區(qū)分開，實際區(qū)分率為 95.7%。表3為第1組4個品種的表型性狀。

紅色.莖用萵苣；綠色.散葉萵苣；黃色.半結球萵苣；藍色.結球萵苣；●.遺傳相似系數(shù)為1的品種。 Red.Stem lettuce；Green.Looseleaf lettuce；Yellow.Half-hitch lettuce；Blue.Crisphead lettuce；●.Varieties with genetic similarity coefficient of 1.

表3 4個高遺傳相似度萵苣品種表型性狀對比Tab.3 Morphological characteristics of 4 lettuce varieties with high genetic similarity

表3(續(xù))

2.6 同名品種鑒定分析

22對核心引物可以將233個供試萵苣品種中的8組、24個同名品種(表1)區(qū)分開，品種間遺傳距離為0.046～0.922，平均為0.616。聚類結果顯示(圖4)，8組同名萵苣品種可分為4個類群，第Ⅰ類群僅有1個源于新疆的品種(圓葉筍)；第Ⅱ類群有9個品種，包括所有來源于湖南和河北的4個品種，4個華東地區(qū)的品種及1個陜西的品種，圓葉紫萵筍(No.88)和圓葉紫萵苣(No.110)這組同名品種在此類群；第Ⅲ類群有5個品種，來源于四川的4個品種均在此類群，包括紅萵筍(No.91)、紅萵筍(No.95)和紅萵筍(No.135)這組同名品種；第Ⅳ類群有9個品種，包括5個西北地區(qū)的品種和2個山西的品種。結果表明，這8組同名品種為具有相同名字的不同品種，遺傳多樣性較高；聚類結果與地理來源有一定相關性，來源于同一省份或地區(qū)的品種大多被劃分到同一類群。

標注相同顏色的品種為同名品種。 Varieties marked with the same color are the varieties of the same name.

3 結論與討論

3.1 SSR引物多態(tài)性和品種區(qū)分能力評價

本研究篩選的22對SSR核心引物較均勻地分布于萵苣的9條染色體，在233個萵苣品種中均能有效擴增。每對引物平均檢測到的等位基因數(shù)量高于Hong等[8](3個等位基因)、魏仕偉等[5](8.31個等位基因)的研究結果。PIC值高于Hong等[8]的0.425，略低于魏仕偉等[5]的0.75。魏仕偉等[5]研究的供試材料為葉用萵苣，本研究的供試材料包括葉用萵苣和莖用萵苣，莖用萵苣遺傳多態(tài)性相比葉用萵苣低，這可能是導致本研究引物PIC值較之略低的原因。本研究篩選的22對核心引物滿足《植物品種鑒定 DNA 分子標記法 總則》(NY/T 2549—2016)[6]中 95% 區(qū)分率的要求，引物對品種區(qū)分能力較強，可有效用于萵苣品種快速鑒定。

3.2 萵苣品種遺傳多樣性評價

本研究利用22對SSR核心引物對233個萵苣品種進行遺傳多樣性分析，劃分為莖用萵苣和葉用萵苣兩大類群，基于Nei′s遺傳距離的萵苣品種聚類結果與基于形態(tài)學性狀的品種歸類基本一致。與前人[12，24]研究結果相似，都未能通過分子標記完全劃分莖用萵苣和葉用萵苣兩大類，但劃分效果相比Simko[12]更好。葉用萵苣遺傳多樣性高于莖用萵苣，散葉萵苣難以聚成一類，散葉萵苣遺傳多樣性高于其他葉用萵苣類型，結球萵苣遺傳多樣性低于其他葉用萵苣類型，此結果與前人研究結果一致[5，12，19，24-25]。

3.3 綜合利用分子標記和表型進行種質(zhì)資源和品種鑒定

本研究利用22對SSR核心引物能將潛在的“同種異名”(遺傳相似系數(shù)為1)品種聚到一起，也能將8組“同名異種”萵苣有效區(qū)分，將此套引物應用到萵苣種質(zhì)資源收集鑒定中，一方面可以避免資源的重復收集，另一方面可以避免優(yōu)異種質(zhì)資源特別是同名地方品種的漏選，提高資源收集保藏和鑒定的效率和效果。本研究基于熒光毛細管電泳平臺建立，并且根據(jù)各引物擴增產(chǎn)物片段大小和熒光標記將22對引物分為5組，能大幅提高檢測效率，降低檢測成本，適用于種質(zhì)資源和品種的批量鑒定和分子指紋庫構建。

品種是根據(jù)實際表達出的表型性狀進行定義的，SSR標記通常位于基因組的非轉錄區(qū)，被認為是“中性”標記，不具備明顯的生物學功能[26]，因此，通過分子標記并不能鑒定所有品種，特別是對于突變體和遺傳背景狹窄的品種，有時難以通過分子標記進行區(qū)分[27]。本研究的233個品種中，有6組、15個品種不能通過分子標記區(qū)分，但其中有9個品種可以通過品種描述或田間種植對比加以區(qū)分，說明在品種鑒定中，應該采取分子標記結合表型的方式，達到提高效率和確?？茖W的統(tǒng)一。SSR分子標記雖然與表型(生物學功能)沒有直接聯(lián)系，但總體上分子遺傳距離較近的品種，其表型性狀也較為相近。本研究6組、15個分子距離為0的品種中，有3組共6個品種表型無明顯差異，同組表型無明顯差異的品種被判定為相同品種；表型有明顯差異的品種間，存在差異性狀的數(shù)量較少，性狀表達差異的程度也總體較小，說明此套分子標記可作為DUS測試輔助篩選近似品種的一種手段。

本研究篩選出22對多態(tài)性高、可通用于葉用萵苣和莖用萵苣，適用于我國萵苣品種鑒定等優(yōu)點的萵苣核心引物。依據(jù)擴增片段大小為各引物選擇了相應的參照樣品，并建立了萵苣品種鑒定體系，依據(jù)萵苣品種鑒定體系構建233個萵苣品種的指紋數(shù)據(jù)庫?？蓱糜谌n苣品種的快速鑒定及輔助DUS測試篩選近似品種。