馬鈴薯卷葉病毒與S病毒重組雙CP多克隆抗體的制備

吉 祥，宋志成，韋曉玲，楊 煜，隋炯明，郭寶太

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東省旱作農(nóng)業(yè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所，山東 濟(jì)南 250100)

馬鈴薯是重要的糧菜兼用的作物，病毒侵染可導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量與品質(zhì)的明顯下降，病毒病危害的防治是馬鈴薯生產(chǎn)的基本要求。通過(guò)莖尖培養(yǎng)結(jié)合嚴(yán)格的病毒檢測(cè)可獲得高質(zhì)量脫毒種薯，而脫毒種薯的利用是防治馬鈴薯病毒危害的有效手段。莖尖培養(yǎng)脫毒的具體方法有多種，病毒檢測(cè)的主要方法是血清學(xué)方法與分子生物學(xué)方法[1]。

馬鈴薯卷葉病毒(Potatoleafrollvirus，PLRV)與S病毒(PotatovirusS，PVS)是2種危害馬鈴薯的主要病毒。PLRV是馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)的代表成員，病毒粒體為球狀等軸對(duì)稱結(jié)構(gòu)，其侵染可導(dǎo)致馬鈴薯嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至達(dá)到80%，但通過(guò)莖尖培養(yǎng)脫除PLRV比較容易。PVS是香石竹潛隱病毒屬 (Calavirus)的成員，病毒粒體為線條狀，PVS單獨(dú)侵染造成的產(chǎn)量損失為10%～20%，但與馬鈴薯X病毒(PVX)混合侵染可造成更嚴(yán)重的危害[2]。PVS是世界馬鈴薯產(chǎn)區(qū)廣泛分布的病毒，脫除非常困難，脫毒種薯種植后容易再次感染病毒。脫毒種薯生產(chǎn)、利用中針對(duì)PLRV與PVS的檢測(cè)都非常必要。

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-linked immuosorbent assay，ELISA)是植物病毒檢測(cè)的基本方法，1977年Casper首先將該法用于馬鈴薯病毒檢測(cè)，雙抗體夾心(DAS)ELISA具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)及靈敏度高的特點(diǎn)，可以有效地用于馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)與利用中的病毒檢測(cè)[3]。

利用馬鈴薯病毒外殼蛋白(Coat protein，CP)基因原核表達(dá)的重組CP作抗原可以制備馬鈴薯病毒特異性抗血清(抗體)，陸續(xù)有成功的報(bào)道。由于PLRV-CP基因原核表達(dá)困難，Plchova等[4]采用有利于精氨酸稀有密碼子表達(dá)的特殊受體菌才實(shí)現(xiàn)了該基因的有效表達(dá)并將重組CP抗血清(抗體)用于PLRV的間接ELISA檢測(cè)。王韜遠(yuǎn)等[5]通過(guò)改造PLRV-CP基因的密碼子，實(shí)現(xiàn)了該基因的原核表達(dá)并利用重組CP制備出了高效價(jià)PLRV特異性抗血清(抗體)。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳研究室采用刪除PLRV-CP基因中抑制表達(dá)序列的策略實(shí)現(xiàn)了該基因的高效原核表達(dá)[6]，并將制備的重組CP多克隆抗體與酶標(biāo)抗體用于PLRV的DAS-ELISA檢測(cè)[7]。2004年李廣存等[8]克隆了PVS-CP基因，利用重組CP制備出了PVS特異性抗血清(抗體)并應(yīng)用于ELISA檢測(cè)，但針對(duì)PVS只見(jiàn)到這一例研究結(jié)果。利用重組CP制備馬鈴薯病毒特異性抗血清(抗體)將為我國(guó)包括PLRV與PVS在內(nèi)的馬鈴薯病毒抗血清(抗體的)大量制備及ELISA試劑盒的國(guó)產(chǎn)化提供有力的技術(shù)支撐。用一種重組CP制備的抗體只能檢測(cè)一種病毒，這是其局限性。

本研究的目的是通過(guò)原核表達(dá)PLRV-CP基因與PVS-CP基因序列形成的融合基因，獲得高純度PLRV與PVS重組雙CP，并將重組雙CP多克隆抗體用于PLRV與PVS這2種病毒的間接ELISA檢測(cè)與DAS-ELISA檢測(cè)，旨在為提高脫毒種薯病毒ELISA檢測(cè)效率、降低檢測(cè)成本奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

本研究于2016—2020年在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳研究室完成。

1.1 質(zhì)粒與菌種

馬鈴薯卷葉病毒CP基因原核表達(dá)載體pET22b-LRCP及PVS-CP基因克隆載體pMD18-SCP由本研究室構(gòu)建，大腸桿菌DH5α與BL21菌株由本研究室保存。

1.2 主要試劑與試劑盒

限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、XhoⅠ、T4DNA連接酶及DNA Marker購(gòu)自大連寶生物公司。質(zhì)粒DNA小量提取及DNA膠回收試劑盒、氨芐青霉素、IPTG、細(xì)菌總蛋白提取試劑、SDS-PAGE試劑、蛋白Marker、羊抗兔HRP酶標(biāo)二抗、ELISA酶標(biāo)板、透析膜等購(gòu)自上海生工公司。金屬離子親和層析柱(HiTrap Chelating HP)、抗體純化柱(HiTrap Protein G HP)購(gòu)自GE Healthcare公司。馬鈴薯Y病毒(PVY)、A病毒(PVA)、M病毒(PVM)及PLRV、PVS、PVX等6種主要病毒的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物與陰性標(biāo)準(zhǔn)物購(gòu)自美國(guó)Agdia公司。

1.3 PLRV與PVS融合雙CP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用Hind Ⅲ與XhoⅠ酶切質(zhì)粒pMD18-SCP，回收含有PVS-CP基因序列的DNA片段，并將該片段定向插入到pET22b-LRCP中PLRV-CP基因下游，構(gòu)建出了PLRV與PVS融合雙CP基因的原核表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定與DNA測(cè)序確認(rèn)表達(dá)載體的正確性，該表達(dá)載體命名為pET22b-LRCP/SCP。

1.4 融合雙CP基因原核表達(dá)的誘導(dǎo)

將重組菌BL21(pET22b-LRCP/SCP)單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，取200 μL活化的菌液接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，至菌液OD600值達(dá)到0.5～0.8。固體與液體LB培養(yǎng)基中氨芐青霉素含量均為100 μg/mL。取出1 mL菌液加入EP管中繼續(xù)培養(yǎng)作為未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照，向剩余的菌液中加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h后，SDS-PAGE電泳檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果。

1.5 菌體蛋白的提取與重組雙CP的純化

菌體蛋白的提取采用了2種方法：溶菌酶法與超聲破碎法。溶菌酶法中，用裂解液(150 mmol/L Tris-HCl，1.5 mol/L NaCl)懸浮菌體，用溶菌酶裂解菌體，加PMSF至終濃度為1 mmol/L抑制蛋白酶活性，加DNase Ⅰ降解細(xì)菌DNA，最后獲得包涵體，具體方法見(jiàn)隋炯明等[6]的描述。超聲破碎法中，每50 mL菌液離心獲得的菌體用4 mL預(yù)冷的0.1 mmol/L的PBS緩沖液懸浮，冰上用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(新芝JY92-ⅡN)超聲破碎18個(gè)循環(huán)后，放置3 min，再繼續(xù)超聲破碎。超聲破碎參數(shù)：100%振幅，3 s運(yùn)行，6 s停止，35個(gè)循環(huán)。4 ℃ 10 000 r/min 離心45 min獲得包涵體蛋白。

2種方法獲得的包涵體都用含8 mol/L尿素的結(jié)合緩沖液(20 mmol/L NaH2PO4，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，30 mmol/L咪唑，pH值7.5)溶解。溶解液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后采用1 mL的鎳離子親和層析柱純化，上樣與洗滌后利用洗脫液(20 mmol/L NaH2PO4，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，500 mmol/L咪唑，pH值7.5)洗脫并收集目的蛋白。

重組雙CP蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、提取與純化的結(jié)果通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)確認(rèn)。蛋白樣品的制備方法是：取未經(jīng)誘導(dǎo)與誘導(dǎo)過(guò)的菌液各1 mL，12 000 r/min離心2 min，棄上清，菌體沉淀用40 μL 1×上樣緩沖液懸浮；分別取包涵體懸浮液、目的蛋白純化溶液20 μL，加入5 μL 5×上樣緩沖液并混勻。上述混合液均煮沸處理10 min，冷卻后4 ℃靜置5 min，取10 μL上清點(diǎn)樣。經(jīng)洗脫獲得的高純度重組雙CP溶液先用不同濃度尿素的PBS透析，再用PEG 6000粉末處理濃縮，最后采用Bradford法進(jìn)行定量。

1.6 抗血清的制備及抗體的分離與純化

用高純度重組雙CP作抗原免疫新西蘭大白兔制備抗血清，效價(jià)測(cè)定采用間接ELISA法，抗血清制備由上海生工公司完成。采用飽和硫酸銨沉淀法從抗血清中分離多克隆抗體(IgG)，抗體粗分離物用1 mL Protein G親和層析柱純化。用10 mL磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L Na3PO4，pH值7.0)洗滌，最后用1.5 mL洗脫液(0.1 mol/L Glycine-HCl，pH值2.7)洗脫收集抗體，并用緩沖液(1 mol/L Tris-HCl，pH值8.8)中和，中和后的抗體可直接用于間接ELISA測(cè)定，經(jīng)過(guò)透析后才可以進(jìn)行酶標(biāo)記。

1.7 重組雙CP抗體活性與特異性的測(cè)定

重組雙CP多克隆抗體與PLRV、PVS反應(yīng)活性的測(cè)定采用間接ELISA法。具體步驟是：用抗原提取緩沖液(0.01 mmol/L Na2SO3，2% PVP-4000，0.2% BSA，2% Tween-20的PBS，pH值7.4)溶解病毒陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物制成抗原包被工作液，以病毒陰性標(biāo)準(zhǔn)物包被反應(yīng)孔作為陰性對(duì)照，以抗原提取緩沖液為空白對(duì)照，每反應(yīng)孔加100 μL包被酶標(biāo)板，37 ℃培育2 h。甩去抗原包被工作液，用PBST洗板，每孔加200 μL，靜置3 min后甩去，洗板3次。在濾紙上甩干反應(yīng)孔，用3% BSA封閉，每孔加200 μL，37 ℃孵育1.5 h。甩去封閉液，洗板方法同上。用抗體包被緩沖液稀釋純化的多克隆抗體，每孔加100 μL，37 ℃孵育2 h，甩去抗體稀釋液后洗板。用酶標(biāo)抗體緩沖液按照1∶2 000稀釋酶標(biāo)二抗(羊抗兔IgG-AP)制成酶標(biāo)抗體工作液，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h，甩去酶標(biāo)抗體工作液后洗板。配制TMB顯色工作液，每孔加100 μL，靜置3～5 min，最后加入100 μL硫酸終止反應(yīng)。目測(cè)顯色結(jié)果，并用BioTek公司Elx800型酶標(biāo)儀測(cè)定OD450吸收值，用樣品孔OD450≥2.5倍陰性孔OD450作為陽(yáng)性判斷的標(biāo)準(zhǔn)。

同樣用上述間接ELISA方法測(cè)定重組雙CP多克隆抗體與6種馬鈴薯主要病毒陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物的反應(yīng)特異性，為了增強(qiáng)反應(yīng)信號(hào)，重組CP多克隆抗體按照1∶500比例稀釋，酶標(biāo)二抗(羊抗兔IgG-AP)按照1∶1 000的比列稀釋。

1.8 抗體的酶標(biāo)記

重組雙CP多克隆抗體(IgG)的堿性磷酸酶標(biāo)記采用戊二醛一步反應(yīng)法，酶標(biāo)抗體活性的測(cè)定采用直接ELISA法?？寡逯苽洹⒖贵w的分離與酶標(biāo)記以及酶標(biāo)抗體活性測(cè)定的具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7，9]。

1.9 PLRV與PVS的DAS-ELISA檢測(cè)

以免疫前抗血清為陰性對(duì)照(陰性對(duì)照1)，以抗原提取緩沖液為空白對(duì)照，重組CP(1 μg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照，病毒陰性物作為抗原的陰性對(duì)照(陰性對(duì)照2)。多克隆抗體按照1∶100、1∶200與1∶300的比例用抗體包液稀釋，每反應(yīng)孔加100 μL，37 ℃孵育2 h。洗板后用BSA進(jìn)行封閉處理，37 ℃培育2 h。PLRV、PVS陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物用抗原提取液稀釋后，每孔加100 μL，37 ℃孵育2 h。最后用酶標(biāo)抗體緩沖溶液按1∶100的比例稀釋酶標(biāo)抗體(IgG-AP)，每個(gè)樣品孔內(nèi)加100 μL，37 ℃孵育2 h?？贵w包被、封閉、抗原結(jié)合以及酶標(biāo)抗體結(jié)合后都進(jìn)行甩去液體、洗滌與甩干反應(yīng)孔的處理，方法同1.6。配制pNPP底物顯色工作液，每孔加100 μL，室溫避光靜置10～20 min，然后每孔加入100 μL 的1 mmol/L的NaOH終止反應(yīng)，觀察顯色結(jié)果，并測(cè)定OD405吸收值。

2 結(jié)果與分析

2.1 PLRV與PVS重組雙CP的原核表達(dá)及提取與純化

將含有PVS-CP基因序列的雙酶切片段定向插入pET22b-LRCP，構(gòu)建出了PLRV與PVS雙CP融合基因的原核表達(dá)載體，命名為pET22b-LRCP/SCP。Hind Ⅲ單酶切該表達(dá)載體的產(chǎn)物是一條DNA帶(圖1，泳道2)，Hind Ⅲ+XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物是2條DNA帶，其中小片段為PVS-CP基因(圖1，泳道3—4)，單、雙酶切片段數(shù)與大小都符合預(yù)期。測(cè)序結(jié)果表明，PLRV與PVS雙CP融合基因序列正確，大小為1 401 bp，其中PLRV-CP基因的序列(498 bp)在5′端、PVS-CP基因的序列(882 bp)在中間、3′端為載體的部分序列，載體構(gòu)建符合要求，上述498 bp的序列是缺失突變的PLRV-CP基因[6]。

M.DNA Marker 15000；1.表達(dá)載體pET22b-LRCP/SCP；2.質(zhì)粒pET22b-LRCP/SCP+HindⅢ(+)；3—4.質(zhì)粒pET22b-LRCP/SCP+Hind Ⅲ+Xho Ⅰ。

用溶菌酶裂解重組菌BL21(pET22b-LRCP/SCP)，菌體蛋白及提取的包涵體蛋白中都有一條分子質(zhì)量約為51.2 ku的特異性蛋白條帶(圖2，泳道2—3)。采用試劑盒推薦的結(jié)合緩沖液與洗脫緩沖液，用鎳離子親和層析法純化包涵體蛋白溶解液，洗脫產(chǎn)物中有明顯的目的蛋白條帶(重組雙CP)，但也有明顯的雜蛋白條帶(圖2，泳道4)。

改用超聲波破碎菌體，提取的包涵體蛋白經(jīng)過(guò)溶解后，溶解液中目的蛋白條帶明顯，菌體蛋白相對(duì)含量很低(圖3，泳道3)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化產(chǎn)物只有清晰的目的條帶(圖3，泳道4—5)，也就是獲得了高純度的PLRV與PVS的重組雙CP。超聲波破碎菌體的同時(shí)也作用于包涵體，增加了它的可溶性，在結(jié)合緩沖液與洗脫液成分及洗滌、洗脫條件不變的情況下，提高了包涵體蛋白的得率與目的蛋白的相對(duì)含量，從而降低了目的蛋白純化難度、獲得了高純度重組雙CP。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)的菌體；2.誘導(dǎo)后的菌體； 3.包涵體蛋白溶解液；4—5.純化的重組雙CP。 M.Protein Marker；1.Uninduced bacterial cell；2.Bacterial cell induced with IPTG；3.Dissolved inclusion body protein； 4—5.Purified recombinant double CP.

2.2 重組雙CP抗體的分離、純化及其活性與特異性的測(cè)定

間接ELISA測(cè)定表明，獲得了PLRV與PVS重組雙CP的高效價(jià)(1∶128 k)抗血清，抗血清中含有大量雜蛋白(圖4，泳道1)，飽和硫酸銨沉淀獲得的抗體粗分離物中雜蛋白去除非常明顯(圖4，泳道2)，經(jīng)Protein G純化獲得的抗體的重鏈與輕鏈帶型清晰，雜蛋白已很少(圖4，泳道3)，表明已獲得了高純度的重組雙CP多克隆抗體(IgG)。

用PLRV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物包被反應(yīng)孔、病毒陰性物作為陰性對(duì)照，間接ELISA測(cè)定顯示，陰性及空白對(duì)照不顯色，抗原包被孔顯色，且隨著抗體稀釋度的增加顏色變淺，結(jié)果表明，重組雙CP多克隆抗體與PLRV呈特異性反應(yīng)。根據(jù)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)判斷，純化抗體的稀釋度為1∶3 200時(shí)，純化抗體與PLRV仍呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)(表1)。用PVS陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物包被反應(yīng)孔，間接ELISA測(cè)定顯示，重組雙CP多克隆抗體與PVS也呈現(xiàn)特異性反應(yīng)，純化抗體稀釋度為1∶3 200時(shí)，純化的抗體與PVS也呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)(表2)。結(jié)果表明，重組雙CP多克隆抗體與PLRV、PVS結(jié)合的特異性強(qiáng)、反應(yīng)活性高。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組雙CP抗血清； 2.分離的抗體；3. 純化的抗體。 M.Protein Marker；1.Antiserum against recombinant double CP； 2.Isolated IgG；3.Purified IgG.

在降低抗體稀釋度(1∶500)與酶標(biāo)二抗稀釋度(1∶1 000)的情況下，用6種馬鈴薯主要病毒陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物為抗原，間接ELISA反應(yīng)顯示，包被PVS或PLRV的反應(yīng)孔呈顏色反應(yīng)，包被其他4種病毒的反應(yīng)孔無(wú)顏色反應(yīng)(圖5)，并且OD值測(cè)定結(jié)果與目測(cè)結(jié)果一致。結(jié)果表明，本研究制備的重組雙CP多克隆抗體只與PLRV、PVS有特異性反應(yīng)，與其他4種病毒無(wú)交叉反應(yīng)，能夠滿足ELISA檢測(cè)的基本要求。

表1 PLRV與PVS重組雙CP多克隆抗體(IgG)活性的間接ELISA測(cè)定(PLRV陽(yáng)性物，Tab.1 Activity determination of IgG against double CP of PLRV and PVS by indirect

表2 PLRV與PVS重組雙CP多克隆抗體(IgG)活性的間接ELISA測(cè)定(PVS陽(yáng)性物，

綜合重組雙CP多克隆抗體特異性與活性測(cè)定結(jié)果，該抗體可用于PLRV的間接ELISA測(cè)定，也可用于PVS的間接ELISA測(cè)定，即同一種抗體可以用于PLRV與PVS兩種病毒的間接ELISA檢測(cè)。

2.3 PLRV與PVS的DAS-ELISA檢測(cè)

為了進(jìn)行DAS-ELISA反應(yīng)，先用堿性磷酸酶標(biāo)記純化后的重組雙CP多克隆抗體，直接ELISA測(cè)定表明，當(dāng)用PLRV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物包被反應(yīng)孔且酶標(biāo)抗體的稀釋度為1∶800，呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)(表3)；當(dāng)PVS病毒標(biāo)準(zhǔn)物包被反應(yīng)孔，酶標(biāo)抗體的稀釋度為1∶800，二者也呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)(表4)。結(jié)果表明，酶標(biāo)抗體與PLRV或PVS的結(jié)合特異性強(qiáng)、反應(yīng)活性高。

表3 PLRV與PVS重組雙CP抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物活性的直接ELISA測(cè)定(PLRV陽(yáng)性物，

表4 PLRV與PVS重組雙CP抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物活性的直接ELISA測(cè)定(PVS陽(yáng)性物，

將制備的重組雙CP多克隆抗體及其酶標(biāo)抗體用于DAS-ELISA檢測(cè)，其中重組CP多克隆抗體采用1∶100、1∶200與1∶300 3個(gè)稀釋度，酶標(biāo)抗體稀釋度按照1∶100。結(jié)果表明，陰性對(duì)照及空白對(duì)照孔無(wú)顏色反應(yīng)，加入PLRV或PVS的反應(yīng)孔及陽(yáng)性對(duì)照孔有顏色反應(yīng)。OD測(cè)定結(jié)果表明，重組雙CP多克隆抗體在3個(gè)稀釋度下，以重組雙CP為抗原的陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)孔中都呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)(表5)；當(dāng)雙CP多克隆抗體及其酶標(biāo)抗體稀釋度都為1∶100，PLRV反應(yīng)孔呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，PVS反應(yīng)孔也呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)(表5)。結(jié)果表明，來(lái)自本研究制備的同一種抗血清的重組雙CP多克隆抗體及其酶標(biāo)抗體可用于PLRV的DAS-ELISA法的檢測(cè)，也可用于PVS的DAS-ELISA檢驗(yàn)，即一種抗體可檢測(cè)2種病毒，這為提高馬鈴薯脫毒試管苗及種薯中病毒ELISA檢測(cè)的效率及降低檢測(cè)成本奠定了基礎(chǔ)。

表5 PLRV與PVS陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物的DAS-ELISA檢測(cè)Tab.5 DAS-ELISA detection of PLRV and PVS positive

3 討論

馬鈴薯病毒粒體分離純化困難導(dǎo)致了馬鈴薯病毒特異性抗血清制備的困難，這限制了我國(guó)馬鈴薯病毒抗血清的大量制備及其在ELISA檢測(cè)中的應(yīng)用。利用重組CP作抗原便成為馬鈴薯病毒特異性抗血清(抗體)制備的一條重要的技術(shù)途徑。除了上述PLRV與PVS外，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)針對(duì)PVX、PVY重組CP多克隆抗體的制備研究很多，可有效地用于間接ELISA測(cè)定，只有Balogun 等[10]發(fā)表了PVX重組CP多克隆抗體順利地用于DAS-ELISA測(cè)定的結(jié)果及Jeevalatha等[11]發(fā)表了PVY重組CP多克隆抗體可用于PVY的DAS-ELISA檢測(cè)的結(jié)果。目前，針對(duì)PVA及PVM的研究在逐漸增多[11-14]，但PVA與PVM重組CP多克隆抗體制備的研究也局限于間接ELISA檢測(cè)[15-17]。達(dá)到DAS-ELISA檢測(cè)的要求，對(duì)于重組CP多克隆抗體在馬鈴薯病毒的ELISA檢測(cè)中的應(yīng)用至關(guān)重要。

本研究室進(jìn)行馬鈴薯重組CP多克隆抗體制備研究與應(yīng)用已經(jīng)多年，針對(duì)6種馬鈴薯主要病毒，利用單CP制備的抗體都能達(dá)到DAS-ELISA檢測(cè)的要求，目前只發(fā)表了PLRV與PVA[9]多抗的制備與應(yīng)用結(jié)果。本研究涉及重組雙CP抗體的制備及其應(yīng)用，是在PLRV與PVS單CP多抗及其酶標(biāo)抗體都達(dá)到DAS-ELISA測(cè)定要求的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。前期研究中用溶菌酶裂解菌體，利用試劑盒推薦的蛋白純化條件，都可以順利地獲得高純度重組CP，本研究采用了融合基因，表達(dá)的蛋白產(chǎn)物分子量變大，純化難度明顯增大，主要表現(xiàn)為包涵體蛋白溶解困難，純化產(chǎn)物含有雜蛋白，重組雙CP溶解性降低很可能是肽鏈折疊方式不正確導(dǎo)致的。改用超聲破碎法裂解菌體，得到的包涵體可溶性明顯增加，溶解包涵體獲得的蛋白溶解液中目的蛋白濃度及其相對(duì)含量都有明顯提高，用同樣的純化條件就可獲得高純度重組雙CP；此法中提取影響到純化，實(shí)際上建立了獲得高純度重組雙CP的提取與純化一體化技術(shù)。同時(shí)制備的重組CP多克隆抗體可用PLRV及PVS為2種病毒的間接ELISA檢測(cè)，也可用于DAS-ELISA檢測(cè)，為進(jìn)一步提高脫毒種薯病毒ELISA檢測(cè)效率及降低檢測(cè)成本奠定了基礎(chǔ)。目前，用重組雙CP制備植物病毒多抗的報(bào)道還很少，2014年，Kapoor等[18]制備出了黃瓜花葉病毒(CMV)與番木瓜環(huán)斑病毒(PRV)重組雙CP多克隆抗體，可用于上述2種病毒的間接ELISA測(cè)定。同年，Kapoor等[18]還把截短的PVX與PVY融合雙CP基因進(jìn)行原核表達(dá)獲得了重組雙CP，制備的抗血清(抗體)可用于大田采集材料的間接ELISA檢測(cè)[19]。

將單克隆抗體用于植物病毒ELISA檢測(cè)是該檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體已經(jīng)成功地用于PVS與PVM的ELISA檢測(cè)[20-21]，這是一個(gè)重要的發(fā)展方向。同時(shí)針對(duì)ELISA測(cè)定，特別是DAS-ELISA測(cè)定方法的改進(jìn)一直不斷，Rettcher等[22]用磁珠標(biāo)記抗體，將DAS-ELISA原理用于PVX快速的磁側(cè)向免疫層析檢測(cè)，Panferova等[23]利用酪胺擴(kuò)增酶反應(yīng)信號(hào)，提高了ELISA反應(yīng)的靈敏度，PVX的檢出量從100 ng/mL降低到3 ng/mL。梁雨欣等[24]將酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合后再加入包被抗體的反應(yīng)孔中，建立了檢測(cè)PVY的快速DAS-ELISA方法。作為植物病毒檢測(cè)方法，ELISA檢測(cè)仍呈現(xiàn)著巨大的應(yīng)用活力。