馮麗婷,張劍峰,遲勝起
(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山東 青島 266109)
甘薯,別名地瓜、紅薯等,一種旋花科的纏繞草質(zhì)藤本植物,主要以塊根及莖蔓繁殖,易遭受甘薯病毒的侵害[1]。全世界已報(bào)道的甘薯病毒有30余種,其中我國報(bào)道的甘薯病毒約有20多種[2],且復(fù)合侵染嚴(yán)重,如甘薯病毒病害(Sweet potato virus diseases,SPVD)是由甘薯羽狀斑駁病毒(Sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV)和甘薯褪綠矮化病毒(Sweetpotatochloroticstuntvirus,SPCSV)協(xié)生共同侵染甘薯引起的病毒病害,可引起葉片扭曲、畸形、葉片褪綠以及植株嚴(yán)重矮化等癥狀,對(duì)甘薯產(chǎn)量影響極大,一般可使甘薯減產(chǎn)50%~90%,甚至絕收,是甘薯生產(chǎn)上的毀滅性病害[3-6]。甘薯屬于無性繁殖作物,病毒可通過塊根及秧苗等進(jìn)行傳播、積累,目前對(duì)于病毒病的防治并沒有有效的防治藥劑,生產(chǎn)上主要依靠莖尖脫毒,通過培育無毒薯苗,減少病毒病的發(fā)生,提高甘薯的產(chǎn)量[7]。脫毒苗的繁育,離不開便捷快速的病毒檢測(cè)方法,建立高效、快捷的甘薯病毒檢測(cè)方法刻不容緩[8]。
本試驗(yàn)以甘薯生產(chǎn)上發(fā)生嚴(yán)重的4種甘薯RNA病毒(SPFMV、SPCSV、SweetpotatovirusG(SPVG)、SweetpotatovirusC(SPVC))為研究對(duì)象,開展了上述4種甘薯RNA病毒的多重RT-PCR的檢測(cè)方法研究,建立了4種甘薯RNA病毒的多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù),旨在為甘薯脫毒苗培育和甘薯病毒的田間檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。
帶有SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC的甘薯組培苗和無毒的甘薯組培苗均為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)院植物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。
試劑:RNA提取試劑購自艾科瑞生物科技有限公司;cDNA合成試劑盒購自山東思科捷生物技術(shù)有限公司;PCR相關(guān)試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。
儀器:全自動(dòng)樣品快速研磨儀JXFSTPRP-24(上海凈信科技)、PCR擴(kuò)增儀(BioRad T-100)、凝膠成像系統(tǒng)(UVP)。
根據(jù)GenBank中收錄的SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC 4種甘薯病毒外殼蛋白(Coat protein ,CP)序列,應(yīng)用DNAMAN 8.0進(jìn)行序列比對(duì)分析,應(yīng)用Premier 5.0 軟件分別設(shè)計(jì)了上述4種甘薯病毒的特異性引物(表1),相關(guān)引物由上海生工生物股份有限公司合成。
表1 所用甘薯病毒的特異性引物Tab.1 Specific primers of sweet potato virus used
利用TRIzol法對(duì)甘薯病毒樣品進(jìn)行植物總RNA提取。
參照cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA,以cDNA為模板,分別利用SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC的特異性引物,PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL:10×PCR Buffer 2.5 μL,rTaq 0.25 μL,dNTPs 2.5 μL,F(xiàn)/R引物各0.5 μL,模板2.5 μL,ddH2O 16.25 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min;12 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后,1%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并拍照。
在同一個(gè)反應(yīng)體系中加入4對(duì)上述甘薯RNA病毒引物同時(shí)進(jìn)行RT-PCR,對(duì)多重反應(yīng)體系中的退火溫度(54,55,56,57,58,59 ℃)、模板量(1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5 μL)、dNTPs量(2.0,2.5,3.0 μL)、引物濃度(2,5,10 μmol/L)、引物量(1∶1∶1∶1∶1、1∶1∶1∶2∶2、2∶2∶2∶1∶1)、循環(huán)次數(shù)(30×、35×、40×)、延伸時(shí)間(20,30,60 s)等因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。
將cDNA按照10倍濃度梯度稀釋(100,10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6),以稀釋后的cDNA分別為模板進(jìn)行單對(duì)引物RT-PCR擴(kuò)增和多重RT-PCR擴(kuò)增,電泳、紫外檢測(cè)并進(jìn)行分析。
分別對(duì)4種病毒的特異性引物進(jìn)行單對(duì)引物的RT-PCR驗(yàn)證,由圖1可見,目的條帶與設(shè)計(jì)片段大小相符,通過進(jìn)一步的測(cè)序分析,均為所檢測(cè)的目的片段,說明4個(gè)引物對(duì)的特異性較好。
M.DL2000 DNA Marker;1.SPFMV; 2.SPCSV;3.SPVG;4.SPVC; 5.陰性對(duì)照。 M.DL2000 DNA Marker;1.SPFMV;2.SPCSV;3.SPVG; 4.SPVC; 5.Negative control.
以混合cDNA樣品為模板,分別對(duì)4種引物組合兩兩組合(圖2),三三組合(圖3)和四重組合(圖4),由圖2—4可見,任何2種引物對(duì)所擴(kuò)增的目的條帶都與所設(shè)計(jì)片段大小相符,且任意非配對(duì)引物均不能產(chǎn)生額外雜帶,說明任意2種引物對(duì)之間都不能產(chǎn)生非特異性片段。
M.DL2000 DNA Marker;1.SPFMV/SPCSV;2.SPFMV/SPVG; 3.SPFMV/SPVC;4.SPCSV/SPVG;5.SPVG/SPVC;6.SPCSV/SPVC。
M.DL2000 DNA Marker;1—2.SPFMV/SPCSV/ SPVG/SPVC。圖5同。 M.DL2000 DNA Marker; 1—2.SPFMV/SPCSV/ SPVG/SPVC.The same as Fig.5.
通過對(duì)這4對(duì)引物的dNTPs量(2.0,2.5,3.0 μL)、退火溫度(54~59 ℃)、模板量(1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5 μL)、循環(huán)次數(shù)(30×、35×、40×)、延伸時(shí)間(20,30,60 s)等試驗(yàn),確定了優(yōu)化組合(圖5),其最佳的反應(yīng)組合及反應(yīng)條件見表2—4。
將加好的樣品管42 ℃孵育5 min后,立即加入10 μL Mix進(jìn)行30 min 50 ℃孵育,85 ℃失活5 min,12 ℃保存合成20 μL cDNA。
圖5 優(yōu)化的四重RT-PCRFig.5 Reaction system of multiplex RT-PCR optimized
表2 cDNA合成的最佳反應(yīng)體系(10 μL)Tab.2 The best reaction system for cDNA synthesis (10 μL)
表3 最佳的PCR反應(yīng)組合Tab.3 The best combination of PCR reactions
表4 四重PCR的最佳反應(yīng)條件Tab.4 Optimal reaction conditions for multiplex PCR
將cDNA模板按照10倍梯度依次稀釋,再分別作為測(cè)試模板,在相同反應(yīng)體系及反應(yīng)條件下進(jìn)行多重RT-PCR,結(jié)果表明,多重RT-PCR的cDNA稀釋10倍后仍能檢測(cè)到(圖6)。
M.DL2000 DNA Marker; 1—7.100~10-6.
應(yīng)用分別含有馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)的樣品1、含有甘薯?xiàng)U狀病毒(SweetpotatobadnavirusB,SPBV-B)的樣品2和甘薯RNA病毒與甘薯DNA病毒復(fù)合侵染的樣品3(含有RNA病毒:SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC、甘薯潛隱病毒(Sweetpotatolatentvirus,SPLV)、DNA病毒(SPBV-B),對(duì)該多重RT-PCR體系進(jìn)行特異性檢測(cè),由圖7,8可見,該多重RT-PCR系統(tǒng)沒有擴(kuò)增出其他非特異性條帶,說明其具有較強(qiáng)的特異性。
M.DL2000 DNA Marker;1.樣品1陽性對(duì)照;2.樣品1的多重 RT-PCR檢測(cè)體系;3. 樣品2陽性對(duì)照;4.樣品2的多重檢測(cè)體系。 M.DL2000 DNA Marker;1.Positive control of sample 1; 2.Multiple detection of sample 1;3.Positive control of sample 2;4.Multiple detection of sample 2.
M.DL2000 DNA Marker;1. SPFMV-F/SPFMV-R;2.SPCSV-F/SPCSV-R;3.SPVG-F/SPVG-R;4.SPVC-F/SPVC-R;5.SPBV-F/SPBV-R;6.SPLV-F/SPLV-R;7.多重RT-PCR檢測(cè)體系。
應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室前期檢測(cè)含有混合病毒的甘薯樣品對(duì)該多重RT-PCR系統(tǒng)進(jìn)行挑戰(zhàn)測(cè)試,其中樣品1帶有甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)、甘薯G病毒(SPVG);樣品2為甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)、甘薯C病毒(SPVC)復(fù)合侵染;樣品3為甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)、甘薯褪綠矮化病毒(SPCSV)、甘薯G病毒(SPVG)、甘薯C病毒(SPVC)復(fù)合侵染;樣品4同時(shí)被甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)、甘薯G病毒(SPVG)、甘薯C病毒(SPVC)侵染。由圖9,10可見,該多重RT-PCR系統(tǒng)與單對(duì)引物檢測(cè)的結(jié)果一致,說明該系統(tǒng)用于這4種甘薯RNA病毒的檢測(cè)是可行的。本研究建立了可用于甘薯RNA病毒(SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC)的多重RT-PCR檢測(cè)體系。
M.DL2000 DNA Marker;1—4.分別為樣品1的SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC單對(duì)引物檢測(cè);5.樣品1的多重RT-PCR檢測(cè);6—9.分別為樣品2的SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC單對(duì)引物檢測(cè); 10.樣品2的多重RT-PCR檢測(cè)。
M.DL2000 DNA Marker;1—4.分別為樣品3的SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC單對(duì)引物檢測(cè);5.樣品3的多重RT-PCR檢測(cè) ; 6—9.分別為樣品4的SPFMV、SPVG、SPCSV、SPVC單對(duì)引物檢測(cè); 10.樣品4的多重RT-PCR檢測(cè)。
甘薯是我國重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物,具有重要的糧食、經(jīng)濟(jì)地位。近年來,各種甘薯病毒病頻繁暴發(fā),使甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)下降,目前,甘薯病毒病的防治只有依靠脫毒苗的單一方法[8],建立靈敏高效的病毒檢測(cè)技術(shù)在脫毒甘薯苗培育和檢測(cè)中起著至關(guān)重要的作用[9]。常用的病毒檢測(cè)方法有目測(cè)法、指示植物法、電鏡觀察法、血清學(xué)檢測(cè)法及分子生物學(xué)等方法,其中以PCR/RT-PCR的分子生物學(xué)方法進(jìn)行病毒檢測(cè)已成為目前甘薯病毒檢測(cè)最常用和最主要的方法[10-14]。傳統(tǒng)的單一RT-PCR方法每次只能檢測(cè)一種病毒或一類病毒,對(duì)于復(fù)合侵染的甘薯病毒病,需要進(jìn)行多次檢測(cè),多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)可對(duì)多種病毒同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),具有同樣具有特異性強(qiáng)、靈敏性高的特點(diǎn),且能在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)完成多種病毒的檢測(cè)[15-17],大大提高了工作效率,其中引物設(shè)計(jì)是多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)中最重要的一環(huán)[18],引物既要具有特異性,又要避免引物之間相互影響[19],研究認(rèn)為在多重RT-PCR反應(yīng)體系中,增加引物對(duì)的濃度可以得到理想的擴(kuò)增效果[13],提高長(zhǎng)片段引物的濃度、增加延伸時(shí)間也有利于多重RT-PCR擴(kuò)增[20-24]。
基于此,本研究針對(duì)甘薯生產(chǎn)上為害嚴(yán)重的甘薯RNA病毒:引起甘薯病毒病(SPVD)的2種病毒甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)和甘薯褪綠矮化病毒(SPCSV),以及經(jīng)常能夠復(fù)合侵染的甘薯病毒G(SPVG)和甘薯病毒C(SPVC),成功建立了可以同時(shí)檢測(cè)4種甘薯病毒的多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù),并對(duì)影響多重PCR體系的因素進(jìn)行了優(yōu)化,獲得了快速、準(zhǔn)確、高效的多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù),為脫毒甘薯種苗及田間甘薯RNA病毒的快速檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。