紅麻WRKY基因家族鑒定及其鹽脅迫下的表達(dá)分析

李 輝，康澤培，邱財生，戴志剛，邱化蛟

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 麻類研究所，湖南 長沙 410205；2.湖南文理學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000)

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與植物生物/非生物逆境脅迫響應(yīng)、生長發(fā)育等過程，是植物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)重要的組成部分[1-2]。紅麻是重要的天然纖維作物之一，主要用于紡織、紙漿、生物質(zhì)能源等方面[3-4]。紅麻種植以鹽堿地、沿海灘涂、干旱坡地等非糧食耕地為主。因此，篩選和鑒定參與紅麻響應(yīng)非生物脅迫過程的WRKY基因家族成員，對闡明紅麻耐逆機理、培育耐逆品種、維持紅麻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員都具有一段保守的氨基酸序列，N-端具有標(biāo)志性的高度保守序列WRKYGQK，C-端具有C2H2或C2HC這2種鋅指結(jié)構(gòu)。自從第一個WRKY轉(zhuǎn)錄因子SPF1[5]從甘薯中克隆獲得后，人們陸續(xù)從擬南芥[6]、水稻[7]、小麥[8]、棉花[9]、紅麻[10]等不同作物獲得WRKY家族成員。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族參與植物的生長發(fā)育、生物、非生物逆境脅迫等多種過程，有的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員在植物響應(yīng)鹽脅迫過程中具有重要作用。魏曉愛等[11]通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，72個擬南芥WRKY基因家族成員中有30個鹽脅迫響應(yīng)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因23個，下調(diào)表達(dá)基因7個。在250 mmol/L的NaCl脅迫下，高粱SbWRKY71基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出先上升后下降的表達(dá)趨勢，且在脅迫9 h表達(dá)量達(dá)到最高[12]。鹽脅迫下，與野生型煙草相比，在過表達(dá)小麥TaWRKY46基因的煙草植株中可溶性糖和可溶性蛋白含量顯著上升，植株的鮮質(zhì)量明顯增加，可見，小麥TaWRKY46基因增強了轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐鹽性[13]。郭玉敏等[14]研究表明，鹽脅迫下，玉米ZmWRKY101基因的表達(dá)量顯著提高，通過提高轉(zhuǎn)ZmWRKY101基因擬南芥植株抗氧化酶的活性，增強轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。綜上所述，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員在植物響應(yīng)鹽脅迫過程中具有正向/負(fù)向的調(diào)控作用。目前，關(guān)于紅麻WRKY基因家族的系統(tǒng)分析及其鹽脅迫下的表達(dá)分析尚未見報道。

本研究擬用生物信息學(xué)篩選、鑒定出紅麻WRKY基因家族成員，并通過實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)分析鹽脅迫下WRKY基因家族成員的表達(dá)情況，旨在為進(jìn)一步研究紅麻WRKY基因家族成員的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料的種植

試驗材料中紅麻16號的種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所提供。挑選籽粒飽滿的種子播種于湖南文理學(xué)院溫室，待紅麻幼苗長到四葉一心時移栽到水培室進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后選取健壯的紅麻幼苗45株，進(jìn)行NaCl脅迫處理，NaCl的濃度梯度為0，50，100，200，400 mmol/L，每個處理3株，3個生物學(xué)重復(fù)，脅迫處理7 d后，分別選取每個濃度梯度紅麻幼苗的根、莖、葉，液氮速凍后放入超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 紅麻WRKY家族成員的鑒定 從國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心(National Genomics Data Center)下載紅麻全基因組的核苷酸序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列[15]，利用Blast軟件構(gòu)建本地蛋白數(shù)據(jù)庫，以紅麻HcWRKY71[10]蛋白的氨基酸序列為比對序列，利用Blast本地比對功能，在本地建立的蛋白庫中進(jìn)行比對，獲取紅麻WRKY候選蛋白，同時從Pfam數(shù)據(jù)庫(http：//pfam.xfam.org/)下載WRKY基因家族保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型文件，利用HMMER 3.1軟件在紅麻本地蛋白數(shù)據(jù)中進(jìn)行BlastP搜索，獲取紅麻WRKY候選蛋白，去掉重復(fù)序列后將二者獲得序列全部作為WRKY基因家族的候選序列。然后利用在線軟件SMART(http：//smart.embl.de/)和NCBI網(wǎng)站的CD-Search Tool 對基因家族候選序列的WRKY結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，去掉不具有WRKY結(jié)構(gòu)域的候選序列，最后獲得紅麻WRKY基因家族序列，將獲得的WRKY基因家族序列逐條在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行 BlastP序列比對并命名。

1.2.2 紅麻WRKY家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 從網(wǎng)站(https：//www.arabidopsis.org/)下載擬南芥WRKY家族成員核苷酸序列并翻譯成蛋白質(zhì)氨基酸序列，利用MEGA 11.0軟件，采用鄰近法構(gòu)建擬南芥和紅麻2個物種WRKY基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.3 紅麻WRKY家族基因保守基序和蛋白理化性質(zhì)分析 利用在線網(wǎng)站MEME(https://meme-suite.org/)對紅麻WRKY家族基因進(jìn)行保守基序分析，同時利用在線網(wǎng)站ExPASy(https：//www.expasy.org/)檢測WRKY家族成員氨基酸序列的等電點(PI)、蛋白質(zhì)分子量(MW)和氨基酸數(shù)目(aa)。

1.2.4 鹽脅迫下紅麻 WRKY家族的實時熒光定量PCR分析 利用植物總RNA提取試劑盒分別提取不同NaCl濃度脅迫下紅麻植株根、莖、葉的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為實時熒光定量PCR的模板。根據(jù)WRKY家族基因的核苷酸序列，利用Primer Premier 6.0設(shè)計引物(表1)。以Hcβaction基因為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR技術(shù)對在不同NaCl濃度脅迫下WRKY家族成員的表達(dá)特征進(jìn)行分析，每個反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)。qRT-PCR的反應(yīng)體系：上下游引物各0.5 μL，qPCRmix 10 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O補至20 μL。qRT-PCR的2步法擴增程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，45個循環(huán);溶解曲線標(biāo)準(zhǔn)程序：95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 紅麻WRKY家族基因成員鑒定及其理化性質(zhì)分析

通過Blast和HMMER序列比對，結(jié)合WRKY保守結(jié)構(gòu)域分析，最后獲得33個WRKY家族成員。將33個WRKY家族成員逐條在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對分析，根據(jù)最小E值對其進(jìn)行系統(tǒng)命名。由表2可知，33個WRKY家族成員不均勻地分布在12條染色體上。其中，7，6號染色體分布的WRKY家族成員最多，各5個成員;5，8號染色體分布的WRKY家族成員最少，各1個成員；3，6，7號染色體分別存在同一基因的2個拷貝，分別是HcWRKY71-1、HcWRKY71-2；HcWRKY72-1、HcWRKY72-2；HcWRKY40-1、HcWRKY40-2。而HcWRKY75基因的2個拷貝分別位于18，4號染色體上。這可能是由基因組復(fù)制事件導(dǎo)致的結(jié)果。

WRKY家族成員理化性質(zhì)鑒定分析結(jié)果如表2所示，該基因家族多肽鏈氨基酸數(shù)目為87～1 142個；等電點為5.26～10.18；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為10.2～132.7。

2.2 紅麻WRKY家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA 11.0對72個擬南芥WRKY家族成員和33個紅麻WRKY家族成員的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，2個物種的WRKY家族成員分成了3個類群Group Ⅰ、Group Ⅱ、Group Ⅲ，其中Group Ⅲ包含了5個亞組。紅麻WRKY家族成員在每個分支都有分布，其中，Group Ⅰ和GroupⅢ-a全部為紅麻WRKY家族成員。紅麻WRKY家族成員中的HcWRKY13、HcWRKY31、HcWRKY33、HcWRKY40-2分布在Group Ⅱ，與其相對應(yīng)的擬南芥的WRKY家族成員則分布在Group Ⅲ。這可能是由于紅麻屬于錦葵科木槿屬，而擬南芥屬于十字花科鼠耳芥屬的緣故。

表2 WRKY家族成員及其理化性質(zhì)分析Tab.2 WRKY family members and analysis of their physicochemical properties

2.3 WRKY家族成員保守基序分析

由圖2可知，33個WRKY家族成員都含有WRKY保守基序，其中有5個WRKY家族成員含有2個WRKY保守基序。這一結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果相似，具有2個WRKY保守基序的WRKY家族成員(HcWRKY2、HcWRKY3、HcWRKY4、HcWRKY58)都位于Group Ⅱ；其余28個WRKY家族成員都含有1個WRKY保守基序，分布在系統(tǒng)進(jìn)化樹的不同分支上。

2.4 WRKY家族成員在不同器官的表達(dá)分析

采用熒光定量PCR技術(shù)，對33個紅麻WRKY家族成員在不同器官的表達(dá)特征進(jìn)行分析，成功檢測到26個WRKY家族成員基因在不同器官的表達(dá)變化，分別是HcWRKY2、HcWRKY3、HcWRKY4、HcWRKY7、HcWRKY9、HcWRKY11、HcWRKY13、HcWRKY17、HcWRKY24、HcWRKY31、HcWRKY32、HcWRKY33、HcWRKY39、HcWRKY40-1、HcWRKY40-2、HcWRKY43、HcWRKY44、HcWRKY47、HcWRKY53、HcWRKY57、HcWRKY58、HcWRKY65、HcWRKY71-1、HcWRKY72-1、HcWRKY72-2、HcWRKY74。未能檢測到的WRKY家族成員有7個，分別是HcWRKY23、HcWRKY26、HcWRKY46、HcWRKY51、HcWRKY71-2、HcWRKY75-1、HcWRKY75-2。其中在根、莖、葉表達(dá)量沒有顯著差異的WRKY家族成員有8個，分別是HcWRKY4、HcWRKY7、HcWRKY39、HcWRKY43、HcWRKY44、HcWRKY53、HcWRKY71-1、HcWRKY72-1(圖3)；在根和莖的表達(dá)量低于葉片的WRKY家族成員有5個，分別是HcWRKY2、HcWRKY32、HcWRKY33、HcWRKY47、HcWRKY74，其中在根中表達(dá)量極顯著低于葉片的是HcWRKY2、HcWRKY32、HcWRKY33、HcWRKY74。在莖中表達(dá)量極顯著低于葉片的是基因HcWRKY33，顯著低于葉片的基因是HcWRKY47、HcWRKY32。在根中表達(dá)量顯著低于葉片的基因是HcWRKY72-2(圖4)。在莖中表達(dá)量高于葉片的WRKY家族成員有12個，其中極顯著高于葉片的是HcWRKY9、HcWRKY13、HcWRKY31、HcWRKY40-1、HcWRKY40-2、HcWRKY57、HcWRKY65基因，顯著高于葉片的基因是HcWRKY3、HcWRKY17(圖5)。綜上所述，紅麻WRKY家族成員在根、莖、葉都有表達(dá)，都屬于組成型表達(dá)基因。

HcWRKY.紅麻WRKY基因家族；AtWRKY.擬南芥WRKY基因家族。 HcWRKY.WRKY family members in kenaf；AtWRKY.WRKY family members in Arabidopsis thaliana.

圖2 紅麻WRKY家族成員保守基序分布Fig.2 Distribution of conserved motifs of WRKY family members in kenaf

圖3 在不同器官表達(dá)量無顯著差異的WRKY家族成員Fig.3 WRKY family members with no significant difference in expression in different organs

以基因在葉片的表達(dá)量為對照進(jìn)行方差分析，小寫字母表示P<0.05；大寫字母表示P<0.01。圖5同。 The expression of genes in leaves was used as the control for analysis of variance，lowercase letters indicated P<0.05； capital letters indicate P <0.01.The same as Fig.5.

圖5 在莖表達(dá)量上調(diào)的WRKY家族成員Fig.5 WRKY family members with up-regulated expression in stems

2.5 鹽脅迫下WRKY家族成員的表達(dá)分析

以葉片cDNA為PCR模板，采用熒光定量PCR技術(shù)，對成功檢測到的26個WRKY家族成員在鹽脅迫下的表達(dá)特征進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的WRKY家族成員具有不同的表達(dá)特征。

2.5.1 鹽脅迫下基因表達(dá)量一直上升的WRKY家族成員 鹽脅迫下，隨著NaCl濃度的升高，基因表達(dá)量一直上升的WRKY家族成員有5個，分別是HcWRKY17、HcWRKY24、HcWRKY40-1、HcWRKY53、HcWRKY71-1。由圖6可知，當(dāng)NaCl濃度為400 mmol/L時，HcWRKY71-1基因表達(dá)量上調(diào)幅度最大，為對照的42倍，其次是HcWRKY53、HcWRKY40-1、HcWRKY24、HcWRKY17。與對照相比，這5個WRKY家族成員表達(dá)量上調(diào)幅度都具有極顯著差異水平(P<0.01)。由此推測，這5個WRKY家族成員在紅麻響應(yīng)鹽脅迫的過程中具有正向調(diào)控作用。

2.5.2 鹽脅迫下基因表達(dá)量先上升后下降再上升的WRKY家族成員 鹽脅迫下，隨著NaCl濃度的升高，基因表達(dá)量先上升后下降然后再上升的WRKY家族成員有5個，分別是HcWRKY39、HcWRKY40-2、HcWRKY47、HcWRKY58、HcWRKY72-1。由圖7可知，在低濃度NaCl脅迫下(50 mmol/L)，這5個WRKY家族成員基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)，隨著NaCl濃度的升高，基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)下降的趨勢。當(dāng)NaCl濃度為400 mmol/L時，HcWRKY47、HcWRKY58、HcWRKY72-1基因的表達(dá)量則進(jìn)一步上升，其中HcWRKY72-1基因的表達(dá)量是對照表達(dá)量的9倍多，其次依次是HcWRKY47、HcWRKY58。由此推測，這5個WRKY家族成員在紅麻響應(yīng)鹽脅迫過程中具有正向調(diào)控作用。

以0 mol/L NaCl脅迫時基因的表達(dá)量為對照進(jìn)行方差分析，小寫字母表示P<0.05；大寫字母表示P<0.01。圖7—10同。 The gene expression under 0 mol/L NaCl stress was used as the control for analysis of variance，lowercase letters indicated P<0.05； capital letters indicate P <0.01.The same as Fig.7—10.

圖7 鹽脅迫下基因表達(dá)量先上升后下降再上升的WRKY家族成員Fig.7 WRKY family members whose gene expression first increased，then decreased and then increased under salt stress

2.5.3 鹽脅迫下基因表達(dá)量先上升后下降的WRKY家族成員 隨著NaCl濃度的升高，基因表達(dá)量先上升然后下降的WRKY家族成員有12個，分別是HcWRKY2、HcWRKY4、HcWRKY7、HcWRKY13、HcWRKY31、HcWRKY32、HcWRKY33、HcWRKY43、HcWRKY44、HcWRKY65、HcWRKY72-2、HcWRKY74(圖8)。在NaCl濃度為50 mmol/L時，基因表達(dá)量達(dá)到最高值的有HcWRKY4、HcWRKY13、HcWRKY31、HcWRKY33、HcWRKY43、HcWRKY72-2、HcWRKY74；在NaCl濃度為100 mmol/L時，基因表達(dá)量達(dá)到最高值的有HcWRKY4、HcWRKY44、HcWRKY65；在NaCl濃度為200 mmol/L時，基因表達(dá)量達(dá)到最高值有HcWRKY2、HcWRKY7、HcWRKY32。與對照相比，基因表達(dá)量的最高值均具有極顯著差異(除HcWRKY4外)。由此可知，這12個WRKY家族成員表達(dá)量上調(diào)達(dá)各自峰值時對應(yīng)不同的NaCl濃度，且在紅麻響應(yīng)鹽脅迫過程中均具有正向調(diào)控作用。

圖8 鹽脅迫下表達(dá)量先上升后下降的WRKY家族成員Fig.8 WRKY family members whose expression first increased and then decreased under salt stress

2.5.4 鹽脅迫下表達(dá)量先下降后上升的WRKY家族成員 隨著NaCl濃度的升高，基因表達(dá)量先下降然后上升的WRKY家族成員有1個，即HcWRKY3。由圖9可知，在濃度NaCl脅迫時(50，100 mmol/L)該基因表達(dá)量下降，與對照相比沒有顯著差異，當(dāng)NaCl濃度升高時(200，400 mmol/L)該基因表達(dá)量上升，與對照相比具有極顯著差異。推測該基因在紅麻響應(yīng)鹽脅迫過程中具有正向調(diào)控作用。

2.5.5 鹽脅迫下基因表達(dá)量一直下降的WRKY家族成員 隨著NaCl濃度的升高，基因表達(dá)量一直下降的WRKY家族成員有3個，分別是HcWRKY9、HcWRKY11、HcWRKY57。由圖10可知，當(dāng)NaCl濃度為400 mmol/L，HcWRKY11基因表達(dá)量下調(diào)幅度最大，為對照的1/16倍，其次是依次HcWRKY57、HcWRKY9。與對照相比，這3個WRKY家族成員表達(dá)量下調(diào)幅度具有極顯著差異水平。由此推測，這3個WRKY家族成員在紅麻響應(yīng)鹽脅迫的過程中具有負(fù)向調(diào)控作用。

圖9 鹽脅迫下表達(dá)量先下降后上升的WRKY家族成員Fig.9 WRKY family members whose expression first decreased and then increased under salt stress

圖10 鹽脅迫下表達(dá)量一直下降的WRKY家族成員Fig.10 WRKY family members with decreased expression under salt stress

綜上所述，鹽脅迫下，WRKY基因表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)的家族成員有23個，表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)的家族成員有3個，表達(dá)量上調(diào)的WRKY基因可能具有正向調(diào)控作用，表達(dá)量下調(diào)表達(dá)的WRKY基因可能具有負(fù)向調(diào)控作用。

3 結(jié)論與討論

3.1 紅麻WRKY家族成員分子特征

WRKY家族成員參與植物的不同逆境調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，目前很多植物已經(jīng)完成了WRKY家族成員的系統(tǒng)分析，如擬南芥[16-18]、水稻[19]、小麥[20]、楊樹[21]、石榴[22]。然而對紅麻WRKY家族的系統(tǒng)研究還未見報道。本研究通過紅麻基因組Blast和HMMER序列比對，結(jié)合WRKY保守結(jié)構(gòu)域分析，最后獲得了33個WRKY家族成員，遠(yuǎn)少于棉花[23]的109個WRKY家族成員。這表明，與棉花相比，紅麻WRKY基因家族在進(jìn)化過程中基因丟失現(xiàn)象嚴(yán)重，在西瓜[24]和黃瓜[25]WRKY家族成員研究者也有相似的結(jié)果。不同的WRKY家族成員之間在蛋白質(zhì)理化性質(zhì)方面存在一定的差異，比如氨基酸數(shù)目、蛋白質(zhì)分子量、理論等電點。這些理化性質(zhì)的差異是每個WRKY家族成員具有不同生物學(xué)功能的分子基礎(chǔ)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，3個紅麻WRKY家族成員HcWRKY11、HcWRKY32、HcWRKY46沒有與擬南芥的WRKY家族成員聚類到一起。同時分別來源于紅麻和擬南芥的WRKY家族成員在同一進(jìn)化樹的分支中存在散在的分布情況，說明大多數(shù)同源基因在這2個物種適應(yīng)各自環(huán)境的進(jìn)化過程中發(fā)生了一定程度的變異。

3.2 紅麻WRKY家族成員的鹽脅迫響應(yīng)

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在植物響應(yīng)鹽脅迫過程中具有重要的調(diào)控作用。如在擬南芥中過表達(dá)棉花GmWRKY34基因能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性[26]，在煙草中過表達(dá)棉花GmWRKY41基因能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，33個WRKY家族成員中有26個被成功檢測到，且全部是鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因，其中23個WRKY家族成員具有正向調(diào)控作用，3個WRKY家族成員具有負(fù)向調(diào)控作用。這就是紅麻耐鹽性強的一個重要因素。

鹽脅迫下，紅麻HcWRKY71-1基因的表達(dá)量隨著NaCl濃度的增加而逐漸上調(diào)，這與鹽脅迫下棉花GhWRKY71[28]基因的表達(dá)相似；HcWRKY4基因的表達(dá)量隨著NaCl濃度的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的表達(dá)趨勢，同樣甘蔗ScWRKY4[29]基因的表達(dá)受到鹽脅迫的誘導(dǎo)；紅麻HcWRKY33基因和擬南芥AtWRKY33[30]基因都是鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因?？梢?，同源基因在不同的物種中具有相似的生物學(xué)功能，這將為紅麻WRKY家族成員的功能研究提供理論參考。

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)鑒定出了33個WRKY家族成員，不均勻地分布在12條染色體上。鹽脅迫下，通過實時熒光定量PCR技術(shù)成功檢測到26個WRKY家族成員，其中23個具有正向調(diào)控作用，3個具有負(fù)向調(diào)控作用。這將為進(jìn)一步研究紅麻WRKY家族成員的生物學(xué)功能奠定堅實的基礎(chǔ)。