岷江百合多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因及其啟動子的克隆與分析

鄧 婕，王瀚林，李有玉，王自娥，陳曉華，劉迪秋

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

植物生存在特定的空間中，在生長的過程中常會面臨低溫、干旱、真菌、病毒等多種生物及非生物脅迫。病原真菌嚴重影響著植物的生長發(fā)育，它們會分泌果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等多種酶類，降解植物的細胞壁，以達到侵入植物體內(nèi)的目的[1]。多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PGs)可切割多聚半乳糖醛酸(果膠的主要成分)中的D-半乳糖醛酸殘基之間的α-(1-4)鍵，是病原真菌為消化植物細胞壁而分泌的重要酶類之一[2]。植物體內(nèi)常合成多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase-inhibiting proteins，PGIPs)識別結(jié)合PGs形成寡聚半乳糖醛酸，從而抑制PGs解聚果膠的活性[3]。PGIPs屬于富含亮氨酸重復(fù)(Leucine-rich repeat，LRR)蛋白超家族，具有多個LRR結(jié)構(gòu)域，在肽鏈的N端有引導(dǎo)PGIPs進行胞外分泌的疏水性信號肽以及N-糖基化位點[4]。貫葉連翹(Hypericumperforatum)PGIP具有4個LRR結(jié)構(gòu)域，分別位于第100—125位，49—169位，149—173位和200—218位氨基酸[5]。甜菜(Betavulgaris)PGIP1具有11個LRR結(jié)構(gòu)域，在N端有由25個氨基酸序列組成的信號肽，具有4個潛在的N-糖基化位點[6]。

PGIPs是植物重要的抗真菌蛋白，其在植物抵抗真菌侵害的過程中發(fā)揮著重要作用。水稻(Oryzasativa)接種細菌性條斑病菌(Xanthomonasoryzae)后，OsPGIP4的表達量顯著上升，且過表達OsPGIP4的轉(zhuǎn)基因水稻對細菌性條斑病菌的抗性顯著增強。相反地，對OsPGIP4進行RNAi后的轉(zhuǎn)基因水稻對細菌性條斑病菌的抗性減弱[7]。三七(Panaxnotoginseng)PGIP原核重組蛋白對根腐病菌茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)、輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)等病原真菌的菌絲生長均具有抑制作用，且過表達PnPGIP轉(zhuǎn)基因煙草對茄腐鐮刀菌的抗性增強[8]。此外，PGIPs的表達可受多種植物激素、生物及非生物脅迫的誘導(dǎo)，如病原真菌、干旱、傷害脅迫、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)、水楊酸(Salicylic acid，SA)等。玉米(Zeamays)PGIP3的表達量在受到傷害脅迫、SA、MeJA誘導(dǎo)后明顯上升[9]。煙草疫霉(Phytophthoranicotianae)、鹽、傷害、SA、MeJA可顯著誘導(dǎo)劍麻(Agavesisalana)PGIP1和PGIP2的表達[10]。立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)侵染水稻后誘導(dǎo)PGIP1/2/3/4的表達，這4個PGIP基因的表達水平分別在侵染48，6，48，96 h后到達最大值[11]。

百合(Lilium)是鮮切花市場的高端花卉，是具有較高經(jīng)濟價值的觀賞植物。然而，百合屬植物容易感染由尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)等鐮刀屬真菌引起的枯萎病?？菸乐赜绊懼俸系漠a(chǎn)量和質(zhì)量[12]。岷江百合(LiliumregaleWilson)是百合屬植物中抗枯萎病性較強的野生種[13]，研究岷江百合的抗病分子機理，對于改良百合屬植物的抗病性具有重要意義。

本研究從岷江百合感染尖孢鐮刀菌后的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中挖掘了一個可響應(yīng)尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)的PGIP，并將其命名為LrPGIP[14]，對LrPGIP的基因序列及其啟動子序列(PLrPGIP)進行了克隆與分析，利用qRT-PCR對LrPGIP進行表達特性分析，構(gòu)建PLrPGIP-GUS(β-葡萄糖苷酸酶)植物表達載體并轉(zhuǎn)入煙草(Nicotianatabacum)中以分析啟動子活性。

1 材料和方法

1.1 植物及真菌材料

岷江百合采自四川省汶川縣，并栽種于昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院的溫室中。將野生型(Wild type，WT)煙草種子消毒后種于1/2 MS培養(yǎng)基，獲得無菌苗用于遺傳轉(zhuǎn)化。尖孢鐮刀菌由生物資源開發(fā)課題組從感病西伯利亞百合中分離、鑒定并保存。尖孢鐮刀菌在使用前接種于土豆培養(yǎng)基(Potato dextrose agar，PDA)中，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d以活化菌種。

1.2 LrPGIP基因的克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)前期研究中岷江百合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到的LrPGIPUnigene序列，設(shè)計基因特異性引物擴增LrPGIPcDNA序列(表 1)。使用TRIGene總RNA提取試劑(GenStar，中國)提取尖孢鐮刀菌接種后的岷江百合根部總RNA，并通過GoTaq qPCR Master Mix(Promega，美國)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，通過PCR擴增LrPGIP的cDNA序列，PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體(TaKaRa，日本)連接后，將重組載體pGEM-T-LrPGIP轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。通過菌液PCR篩選陽性克隆，并送北京擎科生物科技有限公司進行測序。

將測序結(jié)果與LrPGIPUnigene序列進行比對。使用NCBI ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)、NCBI CD-research(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分別尋找開放閱讀框及保守結(jié)構(gòu)域。用NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/)網(wǎng)頁查詢蛋白質(zhì)序列中潛在的N-糖基化位點。采用SignalP 5.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽及亞細胞定位。在NCBI BlastP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中查找與LrPGIP序列相似性較高的植物PGIP蛋白質(zhì)序列，利用ClustalX 1.83進行多重序列比對，并采用MEGA 8.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(最大似然法)。

1.3 qRT-PCR

研究LrPGIP在岷江百合各器官中的表達特性，分別從岷江百合的根、莖、葉、花和鱗片中提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA第1鏈。LrPGIP的qRT-PCR的特異性引物見表 1，以cDNA為模板進行qRT-PCR。選用岷江百合三磷酸甘油醛脫氫酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene，GAPDH，基因登錄號：JZ391059)作為內(nèi)參基因。此外，還分析了尖孢鐮刀菌侵染及信號分子乙烯利(Ethephon，ETH)、過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)、SA、MeJA處理對LrPGIP轉(zhuǎn)錄水平的影響。用無菌剪刀在岷江百合根部產(chǎn)生傷口后，將根部浸泡到尖孢鐮刀菌孢子懸浮液(1.0×106spores/mL)、ETH(1 mmol/L)、H2O2(1 mmol/L)、SA(5 mmol/L)、MeJA(0.1 mmol/L)及無菌水(對照)中接種或處理30 min。然后用無菌水洗凈根部，并將植株種植于裝有無菌細沙的塑料盆中。分別在接種或處理后12，24，48，72 h收集根部，并提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR參考Zhao等[15]的方法進行，并用2-ΔΔCt的方法計算相對表達水平。qRT-PCR試驗包含3個生物學(xué)重復(fù)，利用t測驗對數(shù)據(jù)進行多重比較，分析統(tǒng)計學(xué)差異。

1.4 LrPGIP啟動子的克隆及順式作用元件分析

使用染色體步移技術(shù)克隆LrPGIP的啟動子(PLrPGIP)。根據(jù)Genome Walking kit(TaKaRa，日本)試劑盒說明書，設(shè)計2條巢氏PCR引物(表 1)。使用CTAB法提取岷江百合的基因組DNA，分別用DraⅠ、EcoR V、PvuⅡ、StuⅠ限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進行消化，隨后與接頭相連構(gòu)建4種DNA文庫。以構(gòu)建的DNA文庫為模板進行巢式PCR擴增，并回收第2次PCR產(chǎn)物。通過T-A克隆將第2次PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體相連，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。采用PCR篩選pGEM-T-PLrPGIP陽性大腸桿菌DH5α單克隆，并外送北京擎科生物科技有限公司測序。運用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)及NEW PLACE(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace)預(yù)測PLrPGIP的順式作用元件。

1.5 LrPGIP啟動子轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及啟動子活性分析

設(shè)計帶有Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切位點的PLrPGIP特異性引物(表 1)，從pGEM-T-PLrPGIP重組質(zhì)粒中擴增出帶有Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切位點的PLrPGIP片段，經(jīng)過Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切后與pBI121-GUS載體相連。將pBI121-PLrPGIP-GUS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞中。通過PCR挑選出陽性農(nóng)桿菌克隆，接著采用葉盤轉(zhuǎn)化法[16]將pBI121-PLrPGIP-GUS轉(zhuǎn)入煙草中。提取再生煙草幼苗的基因組DNA，使用擴增PLrPGIP的特異性引物，通過PCR篩選陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株。

用幾種激素及生物與非生物脅迫處理轉(zhuǎn)基因煙草并測定GUS活性，以分析LrPGIP啟動子活性。將陽性轉(zhuǎn)基因煙草的葉盤分別浸泡于尖孢鐮刀菌和交鏈格孢(Alternariaalternata)的孢子懸浮液(1.0×106spores/mL)、NaCl(100 mmol/L)、HgCl2(10 mmol/L)、SA(100 mmol/L)、MeJA(100 mmol/L)、ETH(100 mmol/L)溶液中處理2 h，并設(shè)置超純水處理葉盤2 h為對照組。每個試驗組和對照組分別設(shè)置3個重復(fù)。GUS活性的測定方法參照Chen等[17]的方法進行。其中，GUS的酶活力單位定義為1 min內(nèi)每μg總蛋白催化產(chǎn)生4-MU的量(pmol/(min·μg))。采用最小顯著性差異法進行統(tǒng)計學(xué)差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 岷江百合PGIP編碼蛋白質(zhì)序列的分析

從岷江百合中克隆的LrPGIPcDNA長度為1 186 bp，包含一個長度為1 008 bp的ORF，編碼一個含有335個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。LrPGIP編碼的蛋白質(zhì)具有7個LRR結(jié)構(gòu)域，且具有4個潛在的N-糖基化位點，分別位于第23—26個，69—72個，204—207個，295—298個氨基酸處。在LrPGIP的N端有一段約為29個氨基酸殘基的信號肽，亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，LrPGIP可能定位于細胞壁，是胞外分泌蛋白。

2.2 LrPGIP多重序列比對以及聚類分析

BlastP分析表明，LrPGIP與油棕(Elaeisguineensis)、椰子(Cocosnucifera)、林煙草(N.sylvestris)的PGIP蛋白同源性分別為91%，94%，86%。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析及多重序列比對結(jié)果顯示，LrPGIP與油棕、椰子、林煙草均具有多個保守的LRR結(jié)構(gòu)域(圖 1)。選擇19個植物PGIPs與LrPGIP進行聚類分析，結(jié)果如圖 2所示，該系統(tǒng)進化樹可分為2個大的分支(Ⅰ、Ⅱ)，分支Ⅰ又可細分為2個小的分支(Ⅰa、Ⅰb)，分別由雙子葉植物的11個PGIPs以及單子葉植物的5個PGIPs組成。LrPGIP位于分支Ⅰb中，與單子葉植物海棗(Phoenixdactylifera)、粗柄象腿蕉(Enseteventricosum)、油棕、椰子PGIP聚集在小分支Ⅰb中，該節(jié)點置信度為88%，可信度較高。

A.LrPGIP蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析；B.LrPGIP與油棕、椰子、林煙草的多重序列比對。 A.The protein structure analysis of LrPGIP；B.The multiple alignment of LrPGIP，EgPGIP，CnPGIP and NsPGIP.

圖2 LrPGIP的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of LrPGIP

2.3 LrPGIP響應(yīng)尖孢鐮刀菌侵染以及4種信號分子處理

通過qRT-PCR分析LrPGIP的表達特性，結(jié)果見圖 3，LrPGIP在岷江百合根中的表達量最高，相對而言在鱗片中的表達量最低，在根中的表達量是在鱗片中的表達量的10倍(圖 3-A)。接種尖孢鐮刀菌48 h后LrPGIP的表達量開始上升，至接種后72 h表達水平達到最高，是對照的5.3倍(圖3-B)。ETH、H2O2、SA及MeJA 4種信號分子處理岷江百合均影響了LrPGIP在根中的表達量(圖3-C)。其中，在ETH處理后12 hLrPGIP的表達量下降，隨后表達量上升并在72 h達到較高的水平，約是對照的3倍。另外，H2O2、SA及MeJA處理后24 hLrPGIP的表達量先下降后上升，并在48 h表達量達到最大值，

A.LrPGIP在岷江百合根、莖、葉、花、鱗片中的表達特性分析；B.LrPGIP在岷江百合接種尖孢鐮刀菌后的表達特性分析；C.LrPGIP在岷江百合ETH、H2O2、SA、MeJA處理后的表達特性分析。圖3-A、B中，不同的小寫字母表示不同的樣品之間差異顯著(P<0.05)，圖4同。圖3-C中，不同的小寫字母表示在每種植物信號分子處理后不同時間段的樣品之間差異顯著(P<0.05)。

分別為對照的2.0，1.7，2.7倍。這些結(jié)果表明，尖孢鐮刀菌侵染及4種信號分子(ETH、H2O2、SA、MeJA)處理能明顯誘導(dǎo)LrPGIP的表達水平。

2.4 LrPGIP啟動子區(qū)具有多個順式作用元件

通過染色體步移技術(shù)，從岷江百合的基因組DNA中克隆出了706 bp的LrPGIP啟動子片段(PLrPGIP)。生物信息學(xué)分析表明，PLrPGIP序列中存在多種順式作用元件(表2)，如MRE(光調(diào)控元件)、TCA-element(水楊酸響應(yīng)元件)、TGACG-motif(茉莉酸甲酯響應(yīng)元件)、MYC binding site(MYC結(jié)合位點、冷脅迫響應(yīng)元件)等。

表2 LrPGIP啟動子序列中的順式作用元件預(yù)測結(jié)果Tab.2 Prediction results of cis-acting elements in LrPGIP promoter sequence

2.5 LrPGIP啟動子活性受幾種植物激素、生物及非生物脅迫誘導(dǎo)

為了進一步分析PLrPGIP的活性，構(gòu)建了pBI121-PLrPGIP-GUS融合表達載體，并轉(zhuǎn)入煙草中表達。在HgCl2脅迫處理后，3株pBI121-PLrPGIP-GUS(pPT1/2/3)轉(zhuǎn)基因煙草葉盤中的GUS活性上調(diào)的幅度最大(圖4-A)，是對照的2.1倍。在NaCl處理后，平均GUS活性上升為對照的1.7倍。另外，在接種尖孢鐮刀菌和交鏈格孢后，GUS活性也明顯上升(圖 4-B)，與對照相比，平均值分別增加了0.60，0.86倍。在SA、MeJA及ETH處理后，GUS的活性亦顯著上升(圖4-C)。其中，在ETH處理后，與對照相比，GUS的活性上升最為顯著，平均值為對照的1.67倍。在SA、MeJA處理后，GUS活性分別

pPT1、pPT2、pPT3.3株陽性轉(zhuǎn)基因煙草單株。 pPT1，pPT2，pPT3.Three individuals of positive transgenic tobacco seedlings.

提高為對照的1.4，1.6倍。上述結(jié)果表明，LrPGIP啟動子驅(qū)動的GUS基因響應(yīng)幾種植物激素、生物及非生物脅迫的處理，顯然PLrPGIP的活性受上述幾種激素、生物及非生物脅迫調(diào)控。

3 討論

PGIPs在植物抵御真菌侵染的過程中具有重要的作用，其蛋白質(zhì)序列最主要的特征在于有多個LRR結(jié)構(gòu)域以及N端有信號肽和潛在的N-糖基化位點[4]。水稻的7個PGIPs均具有典型的PGIP特征，但系統(tǒng)進化樹分析表明，除OsPGIP2/4/6/7相似度較高被歸于同一分支外，其余OsPGIPs被聚類到不同的分支中[18]。LrPGIP的蛋白質(zhì)序列也具有典型的PGIPs結(jié)構(gòu)特征，且聚類分析中LrPGIP與粗柄象腿蕉、油棕、椰子聚集到同一個小的分支上，親緣關(guān)系更近，表明這幾個PGIPs在進化過程中可能來源于同一個基因。

PGIPs在植物的各個部位中均有表達，但表達量有所區(qū)別。四季豆(Phaseolusvulgaris)PvPGIP1在幼葉、根中不表達，但PvPGIP3和PvPGIP4在根中有微量的表達，而PvPGIP2在所有的組織中均有表達[19-20]。LrPGIP在岷江百合的根、莖、葉、花和鱗片中均有表達，在根中的表達量最高，在鱗片中的表達量最低。根部作為植物吸收水分及無機鹽的主要器官，其生理狀態(tài)直接影響植物的生長發(fā)育[21]。尖孢鐮刀菌主要從肉質(zhì)根部或鱗莖基部的傷口侵入百合體內(nèi)，導(dǎo)致枯萎病的發(fā)生[22]。PGIPs的表達有利于抑制病原真菌PGs降解果膠的活性，從而抵御病原真菌的入侵[2]。LrPGIP在岷江百合根部的表達量最高，可能是岷江百合為抵抗尖孢鐮刀菌侵染的抗性機制之一。

一些PGIPs的表達受多種植物激素、生物及非生物脅迫的誘導(dǎo)。玉米ZmPGIP3的表達量在立枯絲核菌的侵染后顯著上調(diào)；在SA、MeJA處理后，ZmPGIP3的表達量也明顯上升[9]。相似地，陸地棉(Gossypiumhirsutum)GhPGIP1在接種大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)后，表達水平明顯增加，同時，MeJA、SA、H2O2處理也誘導(dǎo)了GhPGIP3的表達量[23]。SA和JA信號途徑是植物防衛(wèi)反應(yīng)的重要信號途徑[24]。植物在受到病原菌侵染后，SA和JA的合成上調(diào)，SA的積累會引發(fā)病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis-related proteins，PRs)的表達，如PR-1、PR-2、PR-4等[25]。PR蛋白在體外具有直接的抑菌活性，在植物抗病原真菌侵染的過程中具有重要作用[26]。JA可通過激活轉(zhuǎn)錄因子的表達，調(diào)節(jié)下游抗性相關(guān)基因的表達，從而增強對病原真菌的抗性[27]。岷江百合的2個抗病防衛(wèi)反應(yīng)正調(diào)控因子WRKY1、WRKY2，不僅響應(yīng)JA信號，二者還能激活抗病基因LrPR10-5和LrCHI2的表達[14，28]。本研究中，岷江百合LrPGIP在尖孢鐮刀菌接種以及SA、MeJA處理后，表達量均發(fā)生了一定程度的上調(diào)。此外，LrPGIP啟動子的活性可被SA、MeJA、尖孢鐮刀菌所誘導(dǎo)。這些結(jié)果表明，LrPGIP通過SA和JA信號途徑參與岷江百合抗尖孢鐮刀菌侵染的防衛(wèi)反應(yīng)。

綜上所述，LrPGIP作為典型的LRR蛋白，在岷江百合的根、鱗片、葉、莖和花中均有表達，且在根中的表達量最高。LrPGIP的表達受枯萎病菌尖孢鐮刀菌及幾種脅迫反應(yīng)相關(guān)信號分子的誘導(dǎo)，LrPGIP啟動子的活性也受尖孢鐮刀菌、交鏈格孢、NaCl、HgCl2、SA、MeJA、ETH的調(diào)控。LrPGIP在岷江百合在抗尖孢鐮刀菌侵染的防衛(wèi)反應(yīng)中的功能值得進一步研究，同時JA和SA信號途徑對LrPGIP的調(diào)控機制也有待深入分析。