StRab5b基因?qū)︸R鈴薯花青素合成的影響

張之為，范俊臣，康立茹，2，賈瑞芳，田再民，趙 君

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 園藝與植物保護學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.河北北方學院 農(nóng)林科技學院，河北 張家口 075000)

花青素又稱花色苷、花青苷或花色素，是一類水溶性類黃酮色素，普遍分布于植物的花瓣、果實、莖和葉等組織中，呈現(xiàn)紅、紫、藍等顏色[1]?；ㄇ嗨氐幕窘Y(jié)構(gòu)由2個芳香環(huán)和一個含氧雜環(huán)組成，根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同被劃分為六大類：天竺葵素(Pelargonidin)、矢車菊素(Cyanidin)、芍藥花素(Peonidin)、飛燕草素(Delphinidin)、矮牽牛素(Petunidin)和錦葵素(Malyidin)[2]。對于植物來說，花青素給予了植物多種鮮艷的顏色，吸引昆蟲授粉和傳播種子，同時能夠提高植物抗性，通過清除自由基、抗氧化、防御病原體等方式，幫助植物抵御多種生物與非生物脅迫[3-5]?；ㄇ嗨氐暮铣墒穷慄S酮合成通路中的一個重要分支，其過程涉及多個復雜的酶促反應，這些關(guān)鍵酶包括苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase，PAL)、肉桂酸羥化酶(Cinnamate 4-hydroxylase，C4H)、查爾酮合成酶(Chalcone synthase，CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase，CHI)、黃烷酮-3-羥化酶(Flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H)、二氫黃酮醇-4-還原酶(Dihydroflavonol 4-reductase，DFR)、花青素合成酶(Anthocyanidin synthase，ANS)和類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Flavonoid 3-O-glucosyltransferase，UFGT)等[6-8]。這些關(guān)鍵酶受到早期生物合成(EBG)和晚期生物合成(LBG)2套結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控，其中EBGs 包括CHS、CHI和F3H；LBGs 包括F3′H、F3′5′H、DFR、ANS和UFGT[9]，這些結(jié)構(gòu)基因的表達受轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH 和WD40 的調(diào)控和外界環(huán)境因素的影響[10-11]。

Rab蛋白是一類單體GTP結(jié)合蛋白，分子質(zhì)量為20～30 ku，是小G蛋白家族中最大的一個家族，廣泛存在于動物、植物和微生物中，目前已經(jīng)克隆并獲得很多Rab蛋白，其中擬南芥有57 個Rabs，水稻有52個Rabs[12]，人類有60 個Rabs，酵母有11 個Rabs[13-14]。Rab蛋白是細胞內(nèi)的“分子開關(guān)”，主要通過與GTP 或GDP結(jié)合來行使“開”或“關(guān)”功能[15]，現(xiàn)有研究已證明，Rab蛋白具有參與信號轉(zhuǎn)導[16-17]、細胞極性生長[18]、囊泡運輸[19]和骨架組裝[20]等功能。由于花青素能夠調(diào)控植物的生物脅迫和非生物脅迫反應，Rab蛋白作為細胞內(nèi)的“分子開關(guān)”，也參與了植物生物脅迫和非生物脅迫反應，因此Rab蛋白與植物花青素合成之間存在一定聯(lián)系。

本試驗以馬鈴薯為材料，超表達小G蛋白StRab5b基因后，研究其對馬鈴薯葉片、莖段和薯塊中花青素含量以及花青素合成關(guān)鍵酶PAL活性的影響，旨在為研究小G蛋白StRab5b和馬鈴薯花青素合成之間的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

組培苗選用馬鈴薯品種底西瑞(Desiree)，中間載體PLG-ROP和表達載體pBIA1300-221為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學植物病理實驗室保存的質(zhì)粒載體?；ㄇ嗨睾亢蚉AL活性測定中選用的材料為轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系StRab5b-L2、StRab5b-L3和StRab5b-L5，對照材料選用轉(zhuǎn)空載體pBIA1300-221的馬鈴薯植株。

1.2 試驗方法

1.2.1StRab5b基因的克隆利用TRIzol Reagent(Invitrogen)試劑盒提取馬鈴薯葉片組織中總RNA，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme)合成cDNA，以cDNA為模板，用分別帶有KpnⅠ和BglⅡ酶切位點的StRab5b基因特異性引物(StRab5b-F 5′-GAAGATCTTCATGGGTTGCGCATCTTCAGC-3′，StRab5b-R 5′-GGGGTACCCCATGATCAAGCAGCAGTCG-3′)進行PCR，獲得StRab5b基因片段。經(jīng)過膠回收試劑盒Easy Pure Quick Gel Extraction Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)純化后與克隆載體PCR 2.1連接，構(gòu)建T-StRab5b載體，將T-StRab5b載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，利用藍白斑篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒DNA后，用KpnⅠ和BglⅡ進行雙酶切鑒定。

1.2.2 表達載體構(gòu)建 將T-StRab5b和PLG-ROP載體分別用KpnⅠ和BglⅡ進行雙酶切，回收T-StRab5b中的小片段，與PLG-ROP載體回收的大片段進行連接，構(gòu)建中間載體PLG-StRab5b，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，在添加100 mL/L Kan的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒DNA后，用SwaⅠ和SacⅠ進行雙酶切鑒定。將PLG-StRab5b載體用SwaⅠ和SacⅠ進行雙酶切，pBIA1300-221用SmaⅠ和SacⅠ進行雙酶切，回收PLG-StRab5b載體小片段，與pBIA1300-221載體大片段連接，構(gòu)建表達載體p1300-221-StRab5b，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，在添加100 mL/L Kan的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒DNA后，用Sac Ⅰ和XbaⅠ進行雙酶切鑒定。將表達載體p1300-221-StRab5b轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LB4404中，在添加100 mL/L Kan，100 mg/L Rif的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒，用StRab5b基因特異性引物(StRab5b-F和StRab5b-R)進行PCR鑒定。

1.2.3 馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化 采用葉盤法進行馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化，摘取帶葉柄的馬鈴薯組培苗葉片，沿主脈橫切2～3次，置于帶有表達載體p1300-221-StRab5b的農(nóng)桿菌LB4404菌液(OD600=0.5)中，輕搖10 min，用無菌濾紙吸干葉片表面的菌液，移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L IAA+0.2 mg/L GA3+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 6-BA)中黑暗培養(yǎng)2～3 d。然后將葉片轉(zhuǎn)移到芽誘導分化培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L IAA+0.2 mg/L GA3+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 6-BA+25 mg/L Hyg)中，在培養(yǎng)條件為25 ℃、光照16 h/d、光照強度4 000 μmol/(m2· s)誘導生芽，每隔14 d更換一次培養(yǎng)基。當抗性芽長到2 cm時，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，待形成完整植株時，切取葉片，利用qPCR進行鑒定。qPCR反應引物信息為q-StRab5b-F 5′-ATAGCCTTGCAGGACTCAAC-3′和q-StRab5b-R 5′-CAGCACCTCGGTAGTATAATGG-3′，內(nèi)參引物信息為q-Stactin-F：5′-GATGGTGTCAGCCACAC-3′和q-Stactin-R：5′-ATTCCAGCAGCTTCCATTCC-3′。

1.2.4 馬鈴薯試管薯產(chǎn)生 將馬鈴薯無菌苗放入MS液體培養(yǎng)基(MS基本成分+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L GA3+2% 蔗糖)，在溫度25 ℃、光照16 h/d、黑暗8 h/d條件下培養(yǎng)30 d。挑選健壯幼苗，加入誘導生薯培養(yǎng)基(MS基本成分+0.5 mg/L 6-BA+8%蔗糖)，在溫度25 ℃、黑暗條件下誘導生薯。

1.2.5 花青素含量測定 將0.2 g馬鈴薯組織(葉片、莖段、薯塊)剪碎，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，加入5 mL 2%鹽酸甲醇(V/V=2∶98)溶液，黑暗條件下，室溫浸提至組織完全變白。12 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中，用2%鹽酸甲醇溶液定容至10 mL，重復3次。以2%鹽酸甲醇溶液為空白對照，用光徑1 cm的比色皿，在波長為530 nm處，用TU-1901紫外可見分光光度計測定吸光度值[21]。以吸光度值為0.1代表花青素含量的1個單位，用花青素相對含量表示。

1.2.6 PAL活性測定 將0.2 g馬鈴薯組織(葉片、莖段、薯塊)放入-20 ℃預冷的研缽中，加入1 mL 0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH值8.8)，其中含有0.5 mmol/L β-巰基乙醇和5%聚乙烯吡咯烷酮PVP，于冰浴中研磨成勻漿，用1 mL 0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH值8.8)沖洗研缽后，一同轉(zhuǎn)入2 mL離心管中。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液，重復3次。

取0.5 mL粗酶液，加入反應液(1 mL 0.02 mol/L 反應底物L-苯丙氨酸，2.5 mL 蒸餾水)中，30 ℃水浴30 min，加入0.2 mL 6 mol/L鹽酸終止反應。以不加底物的對照，在290 nm處，用TU-1901紫外可見分光光度計測定吸光度值[22]。以每分鐘在290 nm處吸光度變化0.01為1個酶活性單位，用U表示。

PAL=A290×V/(a×0.01×W×t)

式中，V為提取粗酶液體積；a為測定時所用粗酶液體積；W為樣品鮮質(zhì)量；t為反應時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 StRab5b基因的克隆

以馬鈴薯cDNA為模板，利用StRab5b基因特異性引物進行PCR擴增，獲得約600 bp的目的基因片段，與預期的片段大小一致(圖1)。與克隆載體連接后，用KpnⅠ和BglⅡ進行雙酶切鑒定，獲得約600 bp的小片段(圖2)，說明StRab5b基因與克隆載體PCR 2.1連接成功。

M.DNA Marker 2K；1.StRab5b基因。 M.DNA Marker 2K；1.StRab5b gene.

M.DNA Marker 2000；1.T-StRab5b載體。 M.DNA Marker 2000；1.T-StRab5b vector.

2.2 表達載體構(gòu)建

為了構(gòu)建與GFP融合的表達載體，先將StRab5b基因序列構(gòu)建到含有GFP的載體PLG-ROP中，經(jīng)過SwaⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定，獲得約1 200 bp的GFP-StRab5b融合片段(圖3-A)。將GFP-StRab5b融合片段構(gòu)建表達載體pBIA1300-221中，獲得重組質(zhì)粒p1300-221-StRab5b，經(jīng)過SacⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定，獲得約1 200 bp的片段(圖 3-B)，說明GFP-StRab5b已經(jīng)連接到表達載體中。將表達載體p1300-221-StRab5b轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LB4404中，利用StRab5b基因特異性引物(Rab5b-F和Rab5b-R)進行PCR鑒定，獲得了約600 bp的片段，與陽性對照相同(圖4)，說明表達載體已經(jīng)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LB4404中。

A.PLG-StRab5b載體SwaⅠ和SacⅠ酶切鑒定：M.DNA Marker 2000 Plus；1.PLG-StRab5b載體。 B.p1300-221-StRab5b載體SacⅠ和XbaⅠ酶切鑒定：M.DNA Marker 15000；1.p1300-221-StRab5b載體。 A.PLG-StRab5b/SmaⅠ-SacⅠ：M.DNA Marker 2000 Plus；1.PLG-StRab5b vector.B.p1300-221-StRab5b/SacⅠ-Xba I： M.DNA Marker 15000；1.p1300-221-StRab5b vector.

2.3 超表達StRab5b基因馬鈴薯的鑒定

利用qPCR方法對獲得的陽性植株進行StRab5b基因相對表達量的分析，結(jié)果顯示(圖5)，與對照植株相比較，陽性植株中StRab5b基因的表達量均顯著增加，其中在StRab5b-L2、StRab5b-L3和StRab5b-L5植株中，StRab5b基因的表達豐度較高。

2.4 超表達StRab5b基因后馬鈴薯的表型

選擇StRab5b基因表達量較高的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株StRab5b-L2、StRab5b-L3和StRab5b-L5，將薯塊種植到營養(yǎng)缽中，培養(yǎng)30 d后，觀察植株葉片和莖段顏色的變化。轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株StRab5b-L2、StRab5b-L3和StRab5b-L5的葉片和莖段中均出現(xiàn)紫紅色，而對照馬鈴薯葉片和莖段中未出現(xiàn)紫紅色(圖6)。利用試管生薯的方法，誘導馬鈴薯產(chǎn)生薯塊，在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株StRab5b-L2、StRab5b-L3和StRab5b-L5的薯塊中出現(xiàn)紫紅色，但是對照馬鈴薯薯塊中沒有產(chǎn)生紫紅色(圖7)。說明小G蛋白StRab5b基因在馬鈴薯超表達后，增加了馬鈴薯葉片、莖段、薯塊的顏色積累。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖8—9同。 Different letters represent significant differences(P<0.05). The same as Fig.8—9.

圖6 超表達StRab5b基因后葉片和莖段的表型Fig.6 The phenotype of leaves and stem segments after overexpression of StRab5b gene

2.5 超表達StRab5b基因?qū)︸R鈴薯花青素含量的影響

分別測定馬鈴薯葉片、莖段和薯塊中的花青素含量，結(jié)果顯示，馬鈴薯不同組織中花青素含量大小依次為葉片>莖段>薯塊，與對照相比，超表達StRab5b基因后，馬鈴薯葉片、莖段和薯塊中的花青素含量均顯著增加。葉片中，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株StRab5b-L2、StRab5b-L3和StRab5b-L5的花青素含量分別比對照增加了42%，24%，54%，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片中花青素含量與對照形成顯著差異(P<0.05)，表現(xiàn)為植株StRab5b-L5>StRab5b-L2>StRab5b-L3；莖段中，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株StRab5b-L2、StRab5b-L3和StRab5b-L5的花青素含量分別比對照增加了59%，37%，32%，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯莖段中花青素含量與對照形成顯著差異，表現(xiàn)為植株StRab5b-L2>StRab5b-L3>StRab5b-L5；薯塊中，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株StRab5b-L2、StRab5b-L3和StRab5b-L5的花青素含量分別比對照增加了118%，82%，105%，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯薯塊中花青素含量沒有顯著差異，表現(xiàn)為StRab5b-L2>StRab5b-L5>StRab5b-L3(圖8)。說明小G蛋白StRab5b基因超表達能夠增加馬鈴薯葉片、莖段和薯塊中的花青素含量。

圖8 超表達StRab5b基因后馬鈴薯中花青素相對含量Fig.8 The anthocyanin relative content in potato after overexpression of StRab5b gene

2.6 超表達StRab5b基因?qū)︸R鈴薯PAL活性的影響

由圖9可知，與對照相比，超表達StRab5b基因后，馬鈴薯葉片、莖段和薯塊中PAL活性均顯著增加(P<0.05)。葉片中，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株StRab5b-L2、StRab5b-L3和StRab5b-L5的PAL活性分別比對照增加了88%，63%，66%；莖段中，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株StRab5b-L2、StRab5b-L3和StRab5b-L5的PAL活性分別比對照增加了48%，38%，31%；薯塊中，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株StRab5b-L2、StRab5b-L3和StRab5b-L5的PAL活性分別比對照增加了98%，78%，64%，而轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片、莖段和薯塊中的PAL活性沒有差異。說明小G蛋白StRab5b基因超表達能夠增加馬鈴薯葉片、莖段和薯塊中PAL的活性。

圖9 超表達StRab5b基因后馬鈴薯中PAL活性Fig.9 The PAL activity in potato after overexpression of StRab5b gene

3 結(jié)論與討論

植物中花青素的生物合成可以劃分為3個階段，即苯丙烷途徑階段、類黃酮代謝階段和花青素催化合成階段，這些過程涉及多種關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)錄因子的參與[6，10]。在苯丙烷途徑中，花青素生物合成的直接前體是苯丙氨酸，PAL能夠?qū)⒈奖彼徂D(zhuǎn)化為肉桂酸，肉桂酸在4CL和C4H的作用下形成香豆酸輔酶A，再通過進一步代謝形成花青素，其中PAL是苯丙烷代謝途徑的重要調(diào)控位點，是花青素合成的限速酶[23]。已有研究發(fā)現(xiàn)，植物中花青素的合成與PAL呈現(xiàn)一定的相關(guān)關(guān)系，植物大量合成花青素的時候，檢測到PAL的活性增加，同時PAL基因的表達量呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢[24-26]。本研究中，馬鈴薯中超表達StRab5b基因后，與對照相比，植株葉片、莖段和薯塊中的花青素含量顯著增加，同時葉片、莖段和薯塊中PAL活性也增加，說明StRab5b基因能夠參與馬鈴薯葉片、莖段和薯塊的花青素的合成，調(diào)控花青素合成的方式主要是通過調(diào)節(jié)PAL的活性，由于增加了苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸量，進而增加了合成花青素的底物，因此，在馬鈴薯葉片、莖段和薯塊中花青素的合成量增加。

馬鈴薯不同組織中，超表達StRab5b基因后的花青素含量和PAL活性存在差異，表現(xiàn)為葉片>莖段>薯塊，揭示StRab5b基因在不同組織中的表達水平存在差異。由于在葉片中StRab5b基因表達量較多，對PAL活性產(chǎn)生較大作用，通過PAL調(diào)節(jié)合成較多的花青素，而莖段和薯塊中StRab5b基因表達量較少，對PAL活性影響作用較小，因此，在莖段和薯塊中合成了相對較少的花青素。