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    谷子SiPRR73基因的光溫調(diào)控模式 及非生物脅迫響應(yīng)特性

    2022-09-14 04:22:16閆留延李劍峰張世文王永芳張小梅祖超凡王振山桑璐曼何占祥賈小平董志平
    華北農(nóng)學(xué)報 2022年4期

    閆留延,李劍峰,張世文,張 博,王永芳,張小梅,祖超凡,王振山, 桑璐曼,何占祥,賈小平,董志平

    (1.河南科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,河南 洛陽 471023;2.河北省農(nóng)林科學(xué)院 谷子研究所,國家谷子改良中心,河北 石家莊 050035)

    PRRs(Pseudo-response regulators)家族基因廣泛參與植物花期調(diào)控、生物量積累及對逆境脅迫的抵御作用[1-4]。作為PRR家族的重要成員,PRR73是擬南芥(Arabidopsisthaliana)PRR7的直系同源基因,目前在C4作物中報道較少,只在玉米(Zeamays)中利用圖位克隆法獲得了該基因[5]。作為我國重要的雜糧作物,谷子(Setariaitalica)遺傳資源豐富,地理分布廣泛,存在較多的光溫敏感自然變異類型,是C4禾谷類作物光溫敏感調(diào)控機制研究的理想模型[6-9]。研究谷子PRR73基因?qū)鉁丶胺巧锩{迫的響應(yīng)特點,可以了解光周期和溫度如何共同調(diào)控PRR73基因表達(dá)來實現(xiàn)谷子對不同光溫環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié),揭示PRR73基因參與非生物脅迫調(diào)節(jié)的可能機制,具有重要意義。

    PRRs家族蛋白質(zhì)包含3個區(qū)域:PRR結(jié)構(gòu)域、CCT結(jié)構(gòu)域和可變域,分別位于蛋白質(zhì)的N端、C端和中部[10-13]。被子植物PRRs基因的PRR、CCT結(jié)構(gòu)域高度保守,但PRR結(jié)構(gòu)域中個別氨基酸變化可以導(dǎo)致基因功能改變[14-15]。對玉米ZmPRR73的研究表明,在不保守的可變域中氨基酸的變化可能也影響光周期敏感性[5]。擬南芥PRR7通過CONSTANS依賴途徑控制開花時間,可以阻遏CCA1和LHY啟動子的活性,調(diào)節(jié)CCA1和LHY響應(yīng)環(huán)境溫度和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平[12-13,16-20]。此外,PRR7能夠負(fù)調(diào)控抗冷基因CBF和調(diào)節(jié)ABA來響應(yīng)冷脅迫和干旱脅迫,參與植物對鐵過量的適應(yīng)性反應(yīng)[20-24]。谷子和其他禾本科作物一樣,光周期調(diào)控開花研究已經(jīng)有所報道,但光周期和溫度如何共同調(diào)控生長發(fā)育的研究則極少涉及[25-33]。事實上光周期和溫度通過復(fù)雜的互作效應(yīng)影響谷子生長發(fā)育,一些光周期途徑的關(guān)鍵基因如SiCCT參與了谷子光溫互作調(diào)控[34]。

    作為光周期調(diào)控途徑的另一個關(guān)鍵基因,PRR73在C4作物光溫互作調(diào)節(jié)以及應(yīng)對非生物脅迫中是否起到一定作用是值得研究的一個問題。本研究從谷子中克隆SiPRR73基因,系統(tǒng)分析其對光周期、光溫組合以及5種非生物脅迫的響應(yīng)特性,以揭示光周期和溫度對SiPRR73基因的調(diào)控模式以及這種調(diào)控對谷子適應(yīng)不同光溫環(huán)境的潛在意義,并揭示SiPRR73基因參與抵抗非生物脅迫的調(diào)節(jié)機制。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    所用的谷子品種延谷11號來自陜西,是對光溫較敏感的春谷品種。

    1.2 材料種植及樣品采集

    采用盆栽種植,所用塑料盆規(guī)格為10 cm×10 cm,盆內(nèi)裝有營養(yǎng)土,種植120盆,每盆播種5~8粒種子,置于25 ℃、14 h光/10 h暗的培養(yǎng)室長至三葉期定苗,其中部分植株在五葉期采集嫩葉用于克隆SiPRR73基因;另有部分植株繼續(xù)培養(yǎng),抽穗后采集根、莖稈、次頂葉、頂葉、穗頸、幼穗于液氮中保存。設(shè)置長日照(25 ℃、15 h光/9 h暗,LD)、短日照(25 ℃、9 h光/15 h暗,SD)2個不同光周期處理,每個處理24盆,其中,長日照設(shè)定21:00—6:00為黑暗, 6:00—21:00為光照;短日照設(shè)定15:00—6:00為黑暗, 6:00—15:00為光照(下同)。在六葉期時于6:00開始取樣,取頂端嫩葉,每隔2 h取樣一次,連續(xù)48 h取樣,此外從三葉期開始于9:00取樣,每隔3 d取樣一次,短日照取至八葉期(抽穗),長日照取至十二葉期,所有樣品于液氮保存。設(shè)置4種光溫組合處理:低溫長日照(溫度22 ℃、光周期15 h光/9 h暗,LTLD)、低溫短日照(溫度22 ℃、光周期9 h光/15 h暗,LTSD)、高溫長日照(溫度27 ℃、光周期15 h光/9 h暗,HTLD)、高溫短日照(溫度27 ℃、光周期9 h光/15 h暗,HTSD);每個處理16盆,培養(yǎng)至六葉期從6:00開始取樣,每隔3 h取樣一次,連續(xù)24 h取樣,所采頂端嫩葉于液氮中保存。

    用于非生物脅迫處理的谷苗種植條件同上,每個脅迫處理和對照處理均8盆谷苗,在培養(yǎng)室(溫度為25 ℃,光照條件為14 h光/10 h暗)培養(yǎng)21 d,隨后進(jìn)行脅迫處理,NaCl、ABA、EDTA-Fe、PEG6000的處理濃度分別為200 mmol/L、100 μmol/L、600 μmol/L、20%,低溫處理溫度為15 ℃。對照組(溫度為25 ℃,光照條件為14 h光/10 h暗,CK)和每個處理組取樣時間均為處理前(0 h),脅迫處理后0.5,1,2,4,8,16,24 h,所取的頂端嫩葉于液氮中保存。

    1.3 SiPRR73的克隆及生物信息學(xué)分析

    葉片總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄分別用康為世紀(jì)RNA提取試劑盒及寶生物公司第一鏈cDNA合成試劑盒完成,基因特異引物信息見表1?;驍U增體系為20 μL,包括cDNA模板1 μL,2×Es Taq MasterMix(Dye)10 μL,引物(正向與反向混合)0.5 μL,剩余體積用ddH2O補足。擴增循環(huán)程序: 94 ℃預(yù)變性4 min;變性(94 ℃/30 s)、退火(58 ℃/30 s)、延伸(72 ℃/90 s),循環(huán)35次;最后72 ℃延伸 8 min。PCR產(chǎn)物用全式金的膠回收試劑盒純化回收,回收產(chǎn)物連入pBM16A載體,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑選陽性克隆進(jìn)行測序。

    利用NCBI的BlastP程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)搜索保守結(jié)構(gòu)域;從公共數(shù)據(jù)庫下載其他物種的43個PRR73蛋白序列,利用 ClustalW 1.8軟件對包含谷子SiPRR73蛋白的44條PRR73蛋白序列進(jìn)行多序列比對,系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建采用MEGA 6.05軟件。

    1.4 谷子SiPRR73基因的表達(dá)分析

    按照1.3步驟完成樣品RNA的提取及第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成,谷子內(nèi)參基因SiActin和SiPRR73基因分別用表1中對應(yīng)的特異引物(SiActin-FQ、SiPRR73-FQ)進(jìn)行擴增。擴增體系按照TB GreenTM 試劑盒(寶生物公司)說明書準(zhǔn)備,使用羅氏熒光定量PCR儀擴增,兩步法擴增程序:預(yù)變性(95 ℃/30 s);40個循環(huán)包括變性(95 ℃/30 s)、退火(58 ℃/30 s)?;蛳鄬Ρ磉_(dá)量的計算用2-ΔΔCt方法。

    表1 基因擴增及熒光定量PCR引物Tab.1 Primers used for gene amplification and fluorescence quantitative PCR

    2 結(jié)果與分析

    2.1 SiPRR73基因結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化關(guān)系分析

    從谷子葉片提取高質(zhì)量總RNA(圖1-A),反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,利用RT-PCR技術(shù)分2段擴增SiPRR73基因,擴增產(chǎn)物SiPRR73-G1、SiPRR73-G2經(jīng)電泳檢測與目標(biāo)片段相符(圖1-B)?;厥掌谓?jīng)測序后拼接得到2 928 bp的cDNA序列,其中CDS長度為2 283 bp,推定的蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)量為760個。SiPRR73 蛋白含有REC、CCT等2個結(jié)構(gòu)域(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,C4作物家族的谷子、高粱(Sorghumbicolor)、糜子(Panicummiliaceum)、玉米(Zeamays)、哈氏黍(Panicumhallii)PRR73蛋白具有較近的進(jìn)化關(guān)系(圖3)。

    A.谷子總RNA電泳:1,2.兩管RNA。B.SiPRR73基因的RT-PCR產(chǎn)物電泳:1.DL2000 Marker;2,3.分段擴增產(chǎn)物SiPRR73-G1、SiPRR73-G2。

    圖2 SiPRR73蛋白所包含的結(jié)構(gòu)域Fig.2 The domains contained in SiPRR73 protein

    圖3 PRR73蛋白的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Molecular phylogenetic tree of PRR73 proteins

    2.2 谷子不同組織部位SiPRR73基因的表達(dá)特性

    SiPRR73基因具有明顯的組織表達(dá)特異性,在次頂葉表達(dá)水平最高,其次為頂葉,隨后依次為穗頸、幼穗、莖稈、根(圖4)。

    2.3 SiPRR73基因?qū)庵芷诘捻憫?yīng)特點

    兩晝夜基因表達(dá)模式一致,因此,圖5-A中只展示24 h表達(dá)模式。短日照條件下,SiPRR73基因在光照8 h后(14:00)表達(dá)量達(dá)到峰值,隨后開始下降,在整個晝夜中呈節(jié)律性表達(dá),只出現(xiàn)一個表達(dá)峰。長日照條件下,SiPRR73基因在8:00表達(dá)量迅速升高,在10:00和14:00出現(xiàn)表達(dá)峰值,14:00后表達(dá)量緩慢下降。總之,SiPRR73基因呈現(xiàn)出光依賴性晝夜節(jié)律表達(dá)模式,短日照下只有一個表達(dá)峰,長日照下有2個表達(dá)峰,且無論長日照還是短日照光照期表達(dá)水平總體高于黑暗期。從圖5-B可以看出,總體上短日照條件下從三葉期到八葉期(抽穗)SiPRR73基因的表達(dá)水平要低于長日照,長日照條件下八到十二葉期仍維持營養(yǎng)生長,SiPRR73在十一、十二葉期表達(dá)量升至較高水平。

    不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖5—7同。 Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at P<0.05. The same as Fig.5—7.

    A.晝夜表達(dá)規(guī)律;B.不同葉期表達(dá)規(guī)律。 A. Diurnal expression pattern;B. Expression pattern at different leaf stages.

    2.4 光周期和溫度對SiPRR73基因表達(dá)的調(diào)控作用

    溫度對SiPRR73基因表達(dá)峰的數(shù)目有明顯影響,在高溫(27 ℃)條件下的光照期SiPRR73出現(xiàn)2個表達(dá)峰,而在低溫(22 ℃)條件下的光照期只出現(xiàn)1個表達(dá)峰,光周期的改變并不影響高、低溫間表達(dá)峰數(shù)目的差異;光周期控制SiPRR73表達(dá)峰出現(xiàn)的早晚,溫度的改變并不影響SiPRR73在短日照條件下的表達(dá)峰比長日照下提前的特點。此外,SiPRR73表現(xiàn)出一定光誘導(dǎo)表達(dá)特性,黑暗期表達(dá)水平相對較低(圖6)。

    2.5 非生物脅迫條件下SiPRR73基因的表達(dá)模式

    NaCl處理1 h內(nèi)SiPRR73基因受誘導(dǎo)表達(dá),隨后的時間除了8 h誘導(dǎo)表達(dá),其余時間點基因表達(dá)均處于抑制狀態(tài)(圖7-A)。SiPRR73基因在ABA處理1,8 h受誘導(dǎo)表達(dá),其余時間點表達(dá)基本處于抑制狀態(tài)(圖7-B)。PEG模擬干旱脅迫除了脅迫0.5,24 hSiPRR73表達(dá)受到抑制,其余時間點均處于誘導(dǎo)表達(dá)狀態(tài),特別是處理8,12 h,基因表達(dá)最強(圖7-C)。SiPRR73在低溫(15 ℃)處理24 h內(nèi)均受誘導(dǎo)表達(dá),4,8 h表達(dá)最強,說明SiPRR73在應(yīng)對低溫脅迫中可能發(fā)揮功能(圖7-D)。在EDTA-Fe 處理下,SiPRR73在早期(2 h內(nèi))表達(dá)受到抑制,4~18 h均處于誘導(dǎo)表達(dá)狀態(tài),24 h表達(dá)再次受到抑制,推測其在鐵脅迫過程中發(fā)揮特定作用(圖7-E)。5種非生物脅迫中,PEG和低溫總體上誘導(dǎo)SiPRR73表達(dá),而NaCl在脅迫早期誘導(dǎo)基因表達(dá),后期總體表現(xiàn)為抑制狀態(tài),F(xiàn)e脅迫則早期抑制基因表達(dá),后期總體誘導(dǎo)基因表達(dá)。SiPRR73對ABA脅迫的響應(yīng)特點接近NaCl,主要差異在于脅迫0.5 h NaCl誘導(dǎo)基因表達(dá)而ABA抑制基因表達(dá)。

    圖6 光溫互作對SiPRR73基因晝夜表達(dá)模式的影響Fig.6 The effect of photo-thermal interaction on diurnal expression pattern of SiPRR73

    圖7 非生物脅迫條件下SiPRR73基因的表達(dá)模式Fig.7 Expression pattern of SiPRR73 under abiotic stress conditions

    3 結(jié)論與討論

    通過對擬南芥、水稻、高粱、玉米4種植物CCT結(jié)構(gòu)域基因進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)水稻OsPRR73基因劃分到第4組,該組包括擬南芥2號、5號染色體上的一些CCT結(jié)構(gòu)域基因[35]。本研究發(fā)現(xiàn),谷子SiPRR73與水稻、玉米、小麥、高粱等禾本科家族PRR73基因聚為1組,但在組內(nèi)又分為3個亞組,谷子與玉米、糜子、高粱等C4作物PRR73基因聚為1個亞組,水稻、小麥PRR73基因分別聚為另外2個亞組。組織特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),谷子SiPRR73和玉米ZmPRR73、水稻OsPRR73一樣,均在葉片中的表達(dá)量最高,受光調(diào)控,而小麥TaPRR73基因則在根部表達(dá)量較高,說明PRR73基因在禾本科家族內(nèi)部進(jìn)化過程中功能發(fā)生了分化[4-5,36]。谷子SiPRR73在長、短日照條件下的晝夜表達(dá)模式與水稻OsPRR73、小麥TaPRR73相似,即在溫度不變的情況下,長日照有2個表達(dá)峰,短日照有1個表達(dá)峰,與玉米ZmPRR73長短日照下均只有1個表達(dá)峰存在差異[4-5,37],說明盡管同為C4作物,谷子和玉米PRR73基因?qū)庵芷诘捻憫?yīng)模式存在一定差異。溫度是光周期外影響植物生長的另一個重要環(huán)境因子,二者存在復(fù)雜的互作效應(yīng)。對擬南芥的研究發(fā)現(xiàn),提高溫度能抵消短日照對開花的抑制作用[38];而大麥和大豆都是在誘導(dǎo)開花的光周期條件下高溫促進(jìn)開花,抑制開花的光周期條件下高溫抑制開花[39-42]。谷子光溫互作模式與大豆相似,短日照和高溫對抽穗具有正向作用,長日照和高溫對抽穗具有負(fù)向效應(yīng)[34]。本研究發(fā)現(xiàn),光周期和溫度均對SiPRR73的表達(dá)模式產(chǎn)生了影響,但影響方式不同,光周期主要影響了基因表達(dá)峰出現(xiàn)時間的早晚,溫度主要影響了表達(dá)峰的數(shù)目,而這種影響會導(dǎo)致基因功能發(fā)生改變,從而影響谷子抽穗開花,這表明SiPRR73可能參與谷子對不同光周期和溫度環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié)過程。

    PRRs家族基因與植物對非生物脅迫的抵御也有密切關(guān)系[43]。CBF與擬南芥對低溫脅迫的抵御能力有關(guān),PRR9通過調(diào)節(jié)CBF的表達(dá)參與抵御低溫脅迫[44-45]。本研究發(fā)現(xiàn),低溫(15 ℃)脅迫的整個過程SiPRR73基因呈現(xiàn)強誘導(dǎo)表達(dá)模式,說明該基因可能參與谷子對低溫脅迫的抵抗作用。PRRs家族基因與ABA調(diào)控基因有部分重疊,ABAR、ABI3通過ABA調(diào)控表達(dá)參與植物抗逆性,這些基因也受PRRs家族基因TOC1的負(fù)向調(diào)節(jié),同時對TOC1有反向調(diào)節(jié)作用,通過這種調(diào)節(jié)環(huán)的方式參與ABA信號傳導(dǎo)[46]。SiPRR73基因表達(dá)明顯受到ABA調(diào)節(jié),且在ABA處理不同時間表達(dá)模式不同,表明SiPRR73可能參與ABA介導(dǎo)的信號傳遞途徑。擬南芥PRR5基因參與鹽脅迫調(diào)節(jié)[47],本研究發(fā)現(xiàn),SiPRR73對NaCl脅迫的響應(yīng)特點接近ABA,因此可能與鹽脅迫應(yīng)答有關(guān)。水稻OsPRR73的表達(dá)受到干旱抑制[2],而本研究發(fā)現(xiàn),谷子SiPRR73基因明顯被PEG模擬的干旱脅迫所誘導(dǎo),說明水稻與谷子PRR73基因存在不同的干旱脅迫應(yīng)對機制。植物鐵蛋白具有儲鐵功能,可以緩解鐵過量,擬南芥PRR7抑制鐵蛋白基因的表達(dá),與鐵脅迫應(yīng)答有關(guān)[20,24]。本研究發(fā)現(xiàn),鐵脅迫初期SiPRR73基因的表達(dá)受到抑制,說明鐵脅迫需要大量鐵蛋白發(fā)揮儲鐵功能,脅迫信號傳遞給SiPRR73基因,使其表達(dá)減弱,有利于鐵蛋白基因的表達(dá),而后期SiPRR73表達(dá)增強說明隨著脅迫減弱,鐵蛋白需求減少,SiPRR73開始抑制基因表達(dá),因此,推測SiPRR73和擬南芥PRR7一樣,參與了作物抵御鐵脅迫。

    本研究首次克隆得到谷子SiPRR73基因包含完整編碼區(qū)的cDNA序列,該基因CDS長度2 283 bp,編碼760個氨基酸;SiPRR73基因在谷子次頂葉表達(dá)水平最高,受光誘導(dǎo)和光周期調(diào)控;光周期和溫度共同調(diào)節(jié)SiPRR73基因表達(dá),通過改變表達(dá)峰出現(xiàn)時間、表達(dá)峰數(shù)目影響基因表達(dá)模式,從而可能參與了谷子對不同光溫環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié);SiPRR73基因也參與了谷子對鹽脅迫、低溫脅迫、ABA脅迫、干旱脅迫和鐵脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。

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