牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒基因組學(xué)研究進(jìn)展

翟 頎，黃敏霞,.2，呂殿紅,3，賈春玲，周秀蓉，溫肖會(huì),3，羅勝軍,3

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站廣東 廣州 510640；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室肇慶分中心，廣東 肇慶 526238）

牛結(jié)節(jié)性皮膚病（Lumpy Skin Disease,LSD）是一種由牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（Lumpy Skin Disease Virus，LSDV）引起的高度傳染性疫病。臨床上，發(fā)病牛通常發(fā)熱（40～41.5 ℃）并持續(xù)1～3 d，體重減輕，產(chǎn)奶量減少或停止產(chǎn)奶，流涎、流淚和流膿性或粘膿性鼻涕，全身淋巴結(jié)體積增大，單個(gè)或多個(gè)圓形皮膚結(jié)節(jié)局部性或廣泛性出現(xiàn)，多出現(xiàn)在頭部、頸部、背部、乳房、會(huì)陰、生殖器、四肢和尾巴等毛發(fā)稀疏區(qū)域［1］。皮膚結(jié)節(jié)潰爛會(huì)招引蠅蛆而繼發(fā)細(xì)菌感染，傷口數(shù)月無法愈合，最后留下可深入到肌肉組織的永久性痘疤，嚴(yán)重降低皮革制品的質(zhì)量［2］。LSD 發(fā)病率差異很大（5%～90%），死亡率通常較低（10%以下），但在個(gè)別疫情中可達(dá)到85%，偶發(fā)巨大差異的死亡率可能與牛品種、毒株毒力、動(dòng)物健康狀態(tài)以及傳播媒介類型等密切相關(guān)［3-4］。LSD 給疫情國家的養(yǎng)牛業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失［5-7］。該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須報(bào)告的牛疫病之一，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也將其列為二類動(dòng)物疫病。

1929 年LSD 首次發(fā)現(xiàn)于非洲的贊比亞，之后幾十年主要在撒哈拉以南的非洲地區(qū)和國家呈地方性流行［8-10］。20 世紀(jì)80 年代后期LSD 開始侵入中東國家，科威特是非洲以外首個(gè)發(fā)現(xiàn)LSD 的國家，之后LSD 迅速擴(kuò)散［11-12］。2013 年土耳其首次報(bào)告LSD 疫情，由此LSD 抵達(dá)歐洲東南部，持續(xù)影響10 多個(gè)歐洲國家［13］。2015 年俄羅斯首次暴發(fā)LSD 疫情，2016 年哈薩克斯坦在距離俄羅斯邊境80 km 的地方第一次報(bào)告LSD 疫情［14］。2019 年LSD 首次擴(kuò)散到亞洲東部和南部，中國、印度和孟加拉國均有報(bào)告。自2020 年以來LSD先后暴發(fā)于 尼泊爾、不丹、越南、緬甸、斯里蘭卡、泰國、馬來西亞、柬埔寨、老撾和蒙古［15］。我國首次確診的LSD 病例發(fā)生在2019 年8 月新疆維吾爾自治區(qū)伊犁州［16］，此后LSD 疫情迅速擴(kuò)散，據(jù)中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心公布，目前國內(nèi)LSD 疫情已波及安徽、福建、江西、廣東、浙江、臺(tái)灣、四川、重慶、香港、內(nèi)蒙古、山東、廣西、寧夏、海南、陜西和云南。本文著重就近年來LSD 的病原學(xué)及病原基因組的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期對(duì)LSD 的防控和深入研究提供借鑒。

1 LSD 病原學(xué)研究進(jìn)展

1.1 LSDV 的分類及形態(tài)結(jié)構(gòu)

LSDV 是LSD 的病原體，屬于痘病毒科（Poxviridae）脊索痘病毒亞科（Chordopoxvirinae,ChPV）［17］，與山羊痘病毒（Goatpox virus,GTPV）和綿羊痘病毒（Sheeppox virus,SPPV）均為山羊痘病毒屬（Capripoxvirus，CaPV）。目前在血清學(xué)上無法區(qū)分LSDV、SPPV 和GTPV，三者還可以發(fā)生交叉反應(yīng)。從一種CaPV 感染恢復(fù)后，可對(duì)其他CaPV 產(chǎn)生免疫力。

痘病毒是最大的動(dòng)物病毒，病毒粒子呈磚形或卵圓形，LSDV 大小約為290 nm×270 nm［18］。宿主細(xì)胞質(zhì)是LSDV 的復(fù)制場(chǎng)所，LSDV 感染細(xì)胞時(shí)主要以細(xì)胞外包膜病毒（Extracellular Enveloped Virus，EEV）和細(xì)胞內(nèi)成熟病毒（Intracellular Mature Virus，IMV）形式存在，但主要以穩(wěn)定性更好的IMV 形式存在于細(xì)胞內(nèi)，直至細(xì)胞裂解后感染另一個(gè)宿主。EEV 由IMV 發(fā)展而來，其包被來源于高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的囊膜［19］，與IMV可通過形態(tài)結(jié)構(gòu)上是否有包膜包被而進(jìn)行區(qū)別。IMV 或EEV 最里面部分是一個(gè)中間內(nèi)凹、形似啞鈴狀的核心，核心由線性雙鏈DNA 和多種酶組成（圖1）；靠近核心的是柵欄狀核心膜；核心凹陷的中心是性質(zhì)尚未清楚的側(cè)體；核心和側(cè)體一起被2 層脂溶性外膜包圍，厚度為50～55 nm；病毒外膜上還有很多不規(guī)則分布的管狀結(jié)構(gòu)蛋白，使裸露的病毒粒子表面呈現(xiàn)紋理結(jié)構(gòu)［20-21］。

圖1 LSDV 病毒粒子形態(tài)結(jié)構(gòu)［21］Fig.1 Morphological structure of LSDV virus particles

1.2 LSDV 的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性

LSDV 不耐熱，一般55 ℃ 加熱2 h，或65 ℃加熱30 min，均可使其滅活［22］。LSDV 也不能被陽光直射，不耐酸或堿，對(duì)大多數(shù)常用消毒藥敏感。在pH 6.6～8.6 條件下，LSDV 非常穩(wěn)定，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)5 d 沒有明顯降低病毒滴度。LSDV耐凍融，用細(xì)胞培養(yǎng)液4 ℃保存6 個(gè)月，或用皮膚結(jié)節(jié)組織-80 ℃保存10 年，LSDV 均可以恢復(fù)毒力。

LSDV 可用敏感細(xì)胞培養(yǎng)，但是細(xì)胞可供選擇的范圍很窄，傳統(tǒng)上使用牛、山羊和綿羊等反芻動(dòng)物來源的原代細(xì)胞培養(yǎng)，如羔羊睪丸細(xì)胞（LT）、羔羊腎細(xì)胞（LK）、胎牛肌肉細(xì)胞（FBM）和胎牛皮膚細(xì)胞（FBS）。這些原代細(xì)胞系容易被污染，生產(chǎn)過程耗時(shí)耗力且有違動(dòng)物福利。綿羊睪丸細(xì)胞（OA3.Ts）也可以支持LSDV 的增殖，但是該細(xì)胞和原代細(xì)胞一樣，生長(zhǎng)緩慢，傳代次數(shù)有限［23］。因此，越來越多研究工作者使用牛腎細(xì)胞（MDBK）進(jìn)行病毒分離，這是目前增殖LSDV 較優(yōu)的細(xì)胞選擇。由病牛的皮膚結(jié)節(jié)和痂皮都含有高濃度LSDV 可知，LSDV 對(duì)上皮細(xì)胞具有嗜性［24］，而MDBK 細(xì)胞是一種源于LSDV 本體宿主牛的腎臟細(xì)胞，可貼壁生長(zhǎng)，具有上皮特性，而且MDBK 細(xì)胞較原代細(xì)胞和O A3.Ts 細(xì)胞具有生長(zhǎng)速度快、不易污染、成本低等優(yōu)越性。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)MDBK 細(xì)胞不但適用于從臨床樣本分離LSDV，還適用于生產(chǎn)LSDV 減毒活疫苗［25］，有利于解決目前使用原代細(xì)胞生產(chǎn)疫苗時(shí)難以保證不被外源因子污染的質(zhì)量問題。也有科學(xué)家使用非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）培養(yǎng)改造后的LSDV分離株，在培養(yǎng)細(xì)胞中也能產(chǎn)生較高的病毒滴度［26］。此外，LSDV 可以通過雞胚接種分離［27］。在LSDV 的動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)中，采用靜脈注射接種較皮內(nèi)接種的臨床癥狀更明顯。

2 LSDV 基因組學(xué)研究進(jìn)展

2.1 LSDV 基因組結(jié)構(gòu)

CaPV 的3 種病毒均高度保守，相似性高達(dá)96%，LSDV 基因組幾乎包含了SPPV 和GTPV 的所有基因［28］。LSDV 基因組有約151 kb，G+C 含量很低，有1 個(gè)保守的中央編碼區(qū)，兩端是變異程度較高的反向末端重復(fù)序列（Inverted Terminal Repetitions，ITRs），大小約為2.4 kb［29］。LSDV基因組最多有156 個(gè)開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），中間保守基因編碼的蛋白質(zhì)涉及DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、mRNA 合成、核苷酸代謝、結(jié)構(gòu)形成和穩(wěn)定、毒力和宿主范圍，基因組兩端則是基因家族與毒力和宿主范圍功能密切相關(guān)的基因，如LSDV132 作為L(zhǎng)SDV 獨(dú)特的基因，可能行使毒力和宿主范圍功能，而在SPPV 和GTPV 基因組中受破壞而限制了宿主范圍［30-31］。

2.2 LSDV 基因組測(cè)序研究

2.2.1 對(duì)非洲地區(qū)LSDV 毒株全基因組的研究 LSDV 起源于非洲，2001 年科學(xué)家對(duì)1958 年在肯尼亞首次分離的Neethling 2490 毒株進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定分析，該病毒株在分離后接種于LT 細(xì)胞培養(yǎng)16 代，并在1987 年回歸奶牛接種傳代［28］。提取的病毒DNA 被Tsp509 Ⅰ外切酶剪切成1.0～6.0 kb 大小的片段，在Applied Biosystems PRISM 3700 自動(dòng)DNA 測(cè)序儀上完成雙脫氧測(cè)序反應(yīng)。該病毒株的基因組全長(zhǎng)150 773 bp，A+T 含量為73%，ITR 有2 418 bp，有156 個(gè)ORF，最小讀取的ORF 為162 bp，LSDV 的 結(jié)構(gòu)和功能與ChPV 其他屬病毒關(guān)系密切，尤其牙塔痘病毒屬（Yatapoxviruses）和兔痘病毒屬（Leporipoxviruses）［28］。

KSGP 0240 株最初從綿羊中分離出來，由于該毒株感染綿羊和山羊只引起輕微的臨床疾病，因此被廣泛應(yīng)用于針對(duì)GTPV 和SPPV 的免疫，疫苗接種效果很好，但對(duì)LSDV 的免疫保護(hù)不完全［32］。KSGP 0240 株長(zhǎng)期被認(rèn)為是SPPV，直到有學(xué)者測(cè)出KS-1 毒株（來源于KSGP 0240 減毒疫苗）全基因組序列才開始被認(rèn)為是LSDV，ORF002、ORF155 和ORF013 在LSDV 毒株（包括KS-1 株）中均完整，而這些區(qū)域在SPPV 中均被破壞［33］。后來也有學(xué)者從肯尼亞Kenyavac疫苗（JOVAC）中測(cè)出KSGP 0240 株基因組序列（KX683219），測(cè)序結(jié)果與LSDV Neethling NI-2490 具有99.9%的同源性，不同之處僅在于單個(gè)氨基酸取代（LSDV049 中的P/Q）和單核苷酸缺失導(dǎo)致LSDV134 被截?cái)啵?4］。

LSDV 南非Neethling vaccine LW 1959 疫苗株是野外分離株在LK 細(xì)胞中連續(xù)傳代61 次，然后在雞胚絨毛尿囊膜（Chorioallantoic Membrane，CAM）中傳代20 次，再在LK 細(xì)胞中傳代3次，最后病毒在MDBK 細(xì)胞中再傳代10 次，在LT 傳代5 次后收獲以測(cè)全基因組序列，與南非Neethling Warmbaths LW 田間分離株比較發(fā)現(xiàn)，在基因組末端可變區(qū)共有438 處氨基酸替換，包含很多移碼突變（造成截短ORF）、缺失和插入，這些突變的編碼蛋白主要涉及宿主免疫應(yīng)答調(diào)控、基因表達(dá)、DNA 修復(fù)和宿主范圍特異性以及其他未知功能［35］。2016 年對(duì)從納米比亞分離到的2 株LSDV 進(jìn)行全基因組測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Neethling Warmbaths LW 株相比有12 處相同的單核苷酸突變和2 處相同的氨基酸缺失；此外，Namibia/9/2016 有5 nt 突變，Namibia/10/2016 有27 nt 突變［36］。

2.2.2 對(duì)歐洲地區(qū)LSDV 毒株全基因組的研究 歐洲大陸第1 株LSDV 分離株是2015 年從希臘分離到的E vros/GR/15 株，該株病毒基因組有150 554 bp，A+T 含量為74.11%，ITR 有2 190 bp，與Neethling Warmbaths LW 株相比同源性為99.8%，存在9 個(gè)非同義SNP 突變（LD005、LD006、LD017、LD042、LD054、LD094、LD126和LD128），LD096 有1 個(gè)氨基酸缺失，3 個(gè)基因（LD013a、LD026a 和LD144）中存在移碼突變［37］。同年，俄羅斯從其北高加索地區(qū)分離到LSDV/Russia/Dagestan/2015 株，全長(zhǎng)150 751 bp，與Evros/GR/15 株、Neethling Warmbaths LW 株相比同源性分別為99.9%、99.8%，該株病毒共有4個(gè)SNP 位點(diǎn)突變，1 個(gè)在LD145 和LD146 基因間隔區(qū)發(fā)生T/A 突變，1 個(gè)在LD076 中發(fā)生C/T 突變，2 個(gè)在LD128 中發(fā)生G/A 和T/A 突變并引發(fā)編碼氨基酸變化；此外，LD141 缺失1 個(gè)氨基酸，LD022 中有6 個(gè)堿基插入造成編碼氨基酸變化［38］。

2016 年對(duì)從塞爾維亞分離到的SERBIA/Bujanovac/2016 株進(jìn)行全基因組測(cè)序，全長(zhǎng)150 661 bp，ITR 有2 367 bp，與Neethling Warmbaths LW 株的同源性為99.95%，有12 個(gè)基因發(fā)生氨基酸突變，其中LD005 發(fā)生D/N 突變，LD006 發(fā)生E/K 突變，LD017 發(fā)生H/R 突變，LD059 發(fā)生C/F 突變，LD087 發(fā)生K/E 突變，LD094 發(fā)生S/L突變，LD126 發(fā)生E/K 和M/I 突變，LD128 發(fā)生S/F 突變，LD139 發(fā)生M/I 突變，LD148 發(fā)生R/K突變，LD096 缺失1 個(gè)賴氨酸，并且在ITR 區(qū)缺失15 nt；此外，編碼區(qū)有11 nt 變化，有8 nt 變化發(fā)生在基因間隔區(qū)［39］。

值得注意的是，多個(gè)LSDV 分離株在ITR 區(qū)發(fā)生了15 nt（TAAGTGGAAGCCAAT）的缺失，并且這種缺失穩(wěn)定存在于2012—2017 年的部分流行株，如來自以色列（2012 年）、希臘（2015年）、塞爾維亞（2016 年）、俄羅斯（2015 年和2017 年）以及納米比亞（2016 年）的分離株［36］。

2.2.3 對(duì)LSDV 疫苗毒與野毒重組型毒株的研究 LSDV 基因組具有高度保守性和遺傳穩(wěn)定性，田間分離株基因組間存在極小的遺傳變異，疫苗株基因組間也是如此。對(duì)LSDV 疫苗株Lumpyvax、Herbivac LS 和Vaccine-OBP 全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，3 種疫苗株與 Neethling vaccine LW 1959 株基因組之間具有99.9%核苷酸同源性，比較發(fā)現(xiàn)，3 株疫苗株均在LW056 發(fā)生T/M 突變，LW116 發(fā)生V/A 突變；此外，Lumpyvax 和Herbivac LS 疫苗株在LW037 發(fā)生G/V 突變，Herbivac LS 疫苗株在LW134 缺失2 nt 造成移碼突變而產(chǎn)生截短ORF，Vaccine-OBP 疫苗株在末端非編碼區(qū)缺失18 nt 且有3 個(gè)不影響編碼序列的單核苷酸插入或缺失［33］。

2016 年從克羅地亞接種了SIS-Lumpyvax 疫苗后發(fā)生不良反應(yīng)的活牛上采集皮膚結(jié)節(jié)樣本（遠(yuǎn)離注射部位），分離得到病毒Cro2016 株。在MDBK 細(xì)胞傳代8 次后測(cè)序得到Cro2016 株全基因組序列，該序列與SIS-Lumpyvax 疫苗核苷酸序列100%相似，證明疫苗接種的病毒序列保持穩(wěn)定［40］。

哈薩克斯坦的弱毒疫苗株Neethling-RIBSP是基于2016 年該國第1 株野毒分離株Kubash/KAZ/16［41］改造，將該毒株在LT 細(xì)胞中傳代49次、在雞胚CAM 中傳代5 次、再在MDBK 細(xì)胞傳代33 次后獲得。對(duì)該疫苗株進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與Kubash/KAZ/16 株的核苷酸同源性為99.96%，存在5處核苷酸突變（4處氨基酸被替換）、4 處基因間隔區(qū)的核苷酸插入和3 處大片段核苷酸缺失，其中編碼ankyrin 重復(fù)蛋白的LD007 缺失16 nt 造成移碼突變產(chǎn)生截短蛋白，LD016 缺失18 nt 造成編碼OX-2 樣蛋白缺失6 個(gè)氨基酸［42］。

痘病毒作為大型的雙鏈DNA 病毒，一般情況下相對(duì)穩(wěn)定，在自然環(huán)境中不容易發(fā)生大的變異或重組。但在人們對(duì)痘苗病毒（Vaccinia Virus,VACV）起源的追溯過程中發(fā)現(xiàn)不尋常的情況。VACV 是不同痘病毒的復(fù)雜混合物［43］，共培養(yǎng)的天花疫苗與其他病毒，包括天花病毒（Variola Virus,VARV）和牛痘病毒（Cowpox Virus,CPXV）等，可能產(chǎn)生重組病毒。在VACV Lister 毒株里存在兩個(gè) CPXV 樣基因［44］，此外在DPP17 天花疫苗亞克隆的一個(gè)區(qū)域也發(fā)現(xiàn)含有可編碼馬痘病毒（Horsepox Virus，HSPV）樣的SNP 序列［45］。這提示痘病毒也具有重組變異的可能。

2017 年從距離哈薩克斯坦邊境60 km 的俄羅斯地區(qū)1 頭有明顯臨床癥狀的奶牛中分離出LSDV/Russia/Saratov/2017 株，其基因組既包含減毒活疫苗的骨架，也包含田間分離株DNA 片段，確定其為第1 株自然發(fā)生的重組型毒株［46］。LSDV/Russia/Udmurtiya/2019 株也是從俄羅斯分離出來的重組毒株，可能由減毒Neethling 型疫苗株和肯尼亞KSGP/NI-2490 樣田間分離株重組而成，已識(shí)別出27 起與LSDV/Russia/Saratov/2017毒株不同的重組事件，發(fā)現(xiàn)幾種同樣的蛋白被反復(fù)恢復(fù)為野生型的全長(zhǎng)蛋白，推測(cè)對(duì)毒力影響重要，包括含mutT 基序的蛋白（LW086 和LW087）、B 22R 同源物（LW134）和Kelch 樣蛋白（LW144）［29］。Biswas 等［31］比較CaPV 疫苗株與分離株，發(fā)現(xiàn)了一些編碼ankyrin 重復(fù)蛋白、Kelch 樣蛋白、B22R 同源物、mutT 和超氧化物歧化酶的基因，可能與調(diào)節(jié)毒力和宿主范圍相關(guān)。2020 年在我國廣東發(fā)現(xiàn)了第3 株能引起典型LSD暴發(fā)的重組毒株（China/GD01/2020），與2017年和2019 年在俄羅斯發(fā)現(xiàn)的2 種重組毒株存在不同的重組模式［47］。

雖然新型重組LSDV 已被證實(shí)流行，但LSDV基因組序列的遺傳穩(wěn)定性仍毋庸置疑，因?yàn)橹亟M毒株的基因片段都能在LSDV 疫苗毒株或田間毒株中找到近乎100%相似的區(qū)域。LSDV 基因組非常龐大，多達(dá)156個(gè)開放閱讀框，假想基因也較多，很多基因編碼產(chǎn)物的功能還不確定，尤其是存在于疫苗毒株和野毒株基因組之間的堿基突變、缺失和插入造成的變異基因功能尚無法確定。

3 展望

LSD 是一種對(duì)國際貿(mào)易有重大影響意義的牛傳染病。目前防控LSD 仍依賴減毒活疫苗接種，但減毒活疫苗并非完全安全、穩(wěn)定和有效。近年來通過對(duì)LSDV 全基因組測(cè)序分析，在亞洲部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)了疫苗毒株和田間毒株的重組毒株，而且重組毒株可以流行并致病。在我國南方地區(qū)，尤其是廣東的肉牛養(yǎng)殖主要以小規(guī)模散養(yǎng)為主［48］，牛只感染LSDV 的風(fēng)險(xiǎn)較高。目前我國官方推薦使用異源山羊痘AV41 株減毒疫苗來預(yù)防LSD。我們對(duì)廣東地區(qū)和廣西地區(qū)的LSDV 毒株進(jìn)行全基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，2020 年兩廣地區(qū)暴發(fā)的LSD 疫情均由重組病毒株引發(fā)；對(duì)該重組毒株進(jìn)行病毒重組事件分析，其一個(gè)可能的次要親本正是我國目前在使用的GTPV-AV41 減毒活疫苗（課題組未發(fā)表數(shù)據(jù)）。雖然目前還沒有更多LSDV 和GTPV 發(fā)生重組的證據(jù)，但是為了生物安全，未來需要重新評(píng)估部分減毒活疫苗的安全性和有效性，并加緊研發(fā)其替代品，如滅活疫苗或亞單位疫苗。

此外，為了控制LSDV 在我國進(jìn)一步傳播擴(kuò)散，迫切需要在全國更大范圍內(nèi)調(diào)查L(zhǎng)SDV 的真實(shí)流行情況。鑒于LSDV 基因組具有高度保守性和遺傳穩(wěn)定性的特點(diǎn)，需要利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)國內(nèi)更多的LSDV 分離株開展全基因組水平測(cè)序、序列比較、遺傳進(jìn)化和重組事件分析，以便監(jiān)測(cè)分析國內(nèi)LSDV 流行毒株的遺傳演化過程和重組變異情況，進(jìn)一步對(duì)LSD 疫情溯源提供線索，并為該病防控策略的制定提供科學(xué)依據(jù)。