比利時(shí)蘭白花牛超數(shù)排卵實(shí)驗(yàn)

岳成廣，黃飛，王杰，劉書東，劉春潔，趙建清，蔣超翔，高慶華,4*

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3.巴州畜牧工作站，新疆巴音郭楞 841000；4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300）

比利時(shí)蘭白花牛（Belgian Blue Cattle）是經(jīng)過(guò)專門化家系和先進(jìn)的遺傳繁育技術(shù)嚴(yán)格選育出來(lái)的比利時(shí)第一個(gè)牛種，可適應(yīng)各種環(huán)境、氣候和土壤，是具有早熟、性格溫順、肌肉發(fā)達(dá)且有重褶，呈“雙肌”狀，肉質(zhì)細(xì)嫩、含脂率低、出肉率高等特點(diǎn)的優(yōu)秀肉牛品種。近年來(lái)國(guó)內(nèi)一些企業(yè)先后從比利時(shí)引進(jìn)純種比利時(shí)蘭白花?；钆：团咛ィ欢M(jìn)頭數(shù)有限，且牛是單胎動(dòng)物，肉牛繁殖率低，自然交配或人工授精的常規(guī)繁殖方法無(wú)法滿足生產(chǎn)者快速建立核心群的需要。

超數(shù)排卵（簡(jiǎn)稱超排）生產(chǎn)胚胎具有冷凍效果好和胚胎妊娠率高的優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)階段不可替代的手段。生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)比利時(shí)蘭白花牛胚胎是在南疆推廣比利時(shí)蘭白花牛和建立核心種群的有效方法之一。超排效果受到很多因素影響，主要分為兩類：一是供體牛自身因素，包括品種、年齡、胎次、營(yíng)養(yǎng)和遺傳等；二是外部因素，如飼養(yǎng)管理水平、超排激素種類、超排程序和操作人員的水平等。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于激素影響超排效果在奶牛、和牛、安格斯牛和西門塔爾牛的報(bào)道有很多，但對(duì)比利時(shí)蘭白花牛的報(bào)道較少，國(guó)內(nèi)僅有王居強(qiáng)等、魏成斌等在早期對(duì)比利時(shí)蘭白花牛進(jìn)行超數(shù)排卵及胚胎移植探索。鑒于上述，本實(shí)驗(yàn)比較了不同同期方法、國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口促卵泡素（FSH）對(duì)比利時(shí)蘭白花牛超排效果的影響，并對(duì)沖胚方法進(jìn)行比較研究，以期優(yōu)化比利時(shí)蘭白花牛超排流程，為比利時(shí)蘭白花牛在南疆的推廣以及核心生產(chǎn)種群的快速建立提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)管理 供體比利時(shí)蘭白花牛由新疆法布瑞卡牧業(yè)科技有限責(zé)任公司提供，年齡3～4 歲、1 胎，所有牛只系譜信息完整。直腸檢查：生殖器官正常，子宮頸無(wú)明顯彎曲，子宮角對(duì)稱，卵巢機(jī)能正常，無(wú)繁殖疾病。實(shí)驗(yàn)期間供體牛采用TMR 飼糧，粗料以秸稈為主，每日10:00 和17:00 進(jìn)行飼喂，供應(yīng)充足的清潔飲水，飼草、飼料及飼養(yǎng)程序相對(duì)穩(wěn)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2020 年12 月—2021 年1 月進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)為新疆阿拉爾八團(tuán)新疆法布瑞卡牧業(yè)科技有限責(zé)任公司。阿拉爾市位于新疆南部阿克蘇地區(qū)境內(nèi)，北起天山南麓山地，南至塔克拉瑪干沙漠北緣，東經(jīng)80°30'～81°58'，北緯40°22'～40°57'，屬于暖溫帶極端大陸性干旱荒漠氣候，極端最高氣溫35℃，極端最低氣溫-28℃。墾區(qū)年均日照2 556.3～2 991.8 h，雨量稀少，冬季少雪，地表蒸發(fā)強(qiáng)烈，年均降水量為40.1～82.5 mm，年均蒸發(fā)量1 876.6～2 558.9 mm。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品 進(jìn)口FSH（FOLLTROPIN-V，加拿大Vetoquinol 公司生產(chǎn)，700 IU/ 瓶），國(guó)產(chǎn)FSH（寧波三生生物科技有限公司，500 IU/ 瓶），孕酮陰道栓（CIDR，燕瑞生物科技有限公司公司生產(chǎn)，1.56 g 孕酮/ 支），氨基丁三醇前列腺素F注射液（寧波三生生物科技有限公司，10 mL/ 支），鹽酸普魯卡因（西鄉(xiāng)長(zhǎng)江動(dòng)物藥品有限責(zé)任公司，10 mL/ 支），沖胚液（PBS，自配），胚胎培養(yǎng)液（含20% 犢牛血清的PBS）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 體視顯微鏡，輸精槍，兩通路沖卵管（規(guī)格：16#），擴(kuò)張棒，三通硅膠管和吊瓶，過(guò)濾式集卵皿，塑料平皿（直徑90 mm），培養(yǎng)皿（直徑35 mm），5、10、20 mL 和50 mL 一次性注射器。

1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)供體牛選擇條件，挑選符合條件的健康比利時(shí)蘭白花牛20 頭，隨機(jī)分成4 組，每組5 頭。

第1 組和第2 組在比利時(shí)蘭白花牛發(fā)情周期上的任意一天上午埋植CIDR（埋植當(dāng)天計(jì)為第0 天），埋植CIDR 后的第9 天開(kāi)始超數(shù)排卵處理。第1 組按遞減法注射進(jìn)口FSH（每次間隔12 h，劑量為700 IU，用20 mL生理鹽水稀釋），連續(xù)4 d 給藥8 次。在FSH 注射的第5 次和第6 次，同時(shí)注射前列腺素F2（PGF2）各5 mL，在第6 次注射FSH 后撤栓，撤栓后24 h 開(kāi)始觀察母牛發(fā)情，母牛發(fā)情后的10 h 開(kāi)始輸精，間隔6 h 輸精1 次，每頭母牛發(fā)情期間輸精2～3 次，每次輸2 支比利時(shí)蘭白花種公牛細(xì)管凍精。第2 組注射國(guó)產(chǎn)FSH（劑量為1 000 IU，每500 IU 用10 mL 生理鹽水稀釋），超排方法與第1 組一致。

第3 組和第4 組在比利時(shí)蘭白花牛發(fā)情周期上的任意一天肌注5 mL PGF（注射當(dāng)天計(jì)為第0 天），間隔11 d 再次注射PGF5 mL，最后一次注射PGF后48～72 h 內(nèi)，每天早晚兩次觀察供體母牛發(fā)情情況（發(fā)情當(dāng)天為第0 天），發(fā)情后的第9 天開(kāi)始進(jìn)行超排處理。第3 組按遞減法注射進(jìn)口FSH（每次間隔12 h，劑量為700 IU，用20 mL 生理鹽水稀釋），連續(xù)4 d 給藥8 次，在FSH 注射的第5 次和第6 次，同時(shí)肌注PGF各5 mL。母牛發(fā)情后的10 h 開(kāi)始輸精，間隔6 h 輸精1 次，每頭母牛發(fā)情期間輸精2～3 次，每次輸2 支比利時(shí)蘭白花種公牛細(xì)管凍精。第4 組注射國(guó)產(chǎn)FSH（劑量為1 000 IU，每500 IU 用10 mL 生理鹽水稀釋），超排方法與第3 組一致。

1.6 供體胚胎的采集與質(zhì)量鑒定 本實(shí)驗(yàn)采用2 種沖胚方法進(jìn)行胚胎采集。第1 種，注射式?jīng)_胚：將母牛保定后，尾椎硬膜外腔注射3～5 mL 的鹽酸普魯卡因局麻，高錳酸鉀水消毒外陰后用消毒紙巾擦凈，然后用75%酒精消毒并用生理鹽水沖洗2 遍。選擇澳大利亞產(chǎn)沖胚管回收胚胎，第1 次沖胚時(shí)吸取沖胚液30 mL，從沖胚管口注入子宮角里且不能全部注射，留10 mL 左右沖胚液，用注射器將沖胚液全部吸出，剩余每次注入50 mL沖胚液，重復(fù)多次，將沖胚液由注射器導(dǎo)入胚胎濾器，每側(cè)子宮角沖洗液用量為500 mL。兩側(cè)子宮沖胚完畢后，將沖胚管抽至子宮體，投入添加160 萬(wàn)IU 青霉素和100 萬(wàn)IU 鏈霉素的生理鹽水10 mL。沖胚結(jié)束后肌肉注射5 mL PGF。第2 種沖胚方式為傳統(tǒng)灌注沖胚法，該方法操作過(guò)程基本與注射式?jīng)_胚法相同，只是在沖胚時(shí)使用三通軟管，1 頭連接沖胚管，1 頭連接吊瓶，另1 頭為出液口（接胚胎口）。操作時(shí)用1 只手控制液流開(kāi)關(guān)，舉高吊瓶向子宮灌注沖胚液30～50 mL，另一只手通過(guò)直腸按摩子宮角，在灌流的同時(shí)，用食指和拇指捏緊宮管結(jié)合部，灌流完畢后，關(guān)閉進(jìn)流閥，打開(kāi)出流閥，用集卵杯收集沖胚液，如此反復(fù)。因比利時(shí)蘭牛臀部肌肉發(fā)達(dá)，兩種沖胚方式均需鹽酸普魯卡因作硬膜外腔麻醉以便于操作。在實(shí)驗(yàn)中采用這兩種方法交替進(jìn)行沖胚，每種方法各處理9 頭比利時(shí)蘭白花牛。

胚胎收集于胚胎濾器中，用體式顯微鏡檢胚。在40～60 倍的高倍鏡下觀察胚胎，依據(jù)胚胎形態(tài)、發(fā)育程度（未受精卵母細(xì)胞、早期桑葚胚、緊密桑葚胚、胚泡、擴(kuò)張胚泡、孵出胚泡等）、質(zhì)量（優(yōu)秀、良好、一般、差劣、變質(zhì)）進(jìn)行分類。根據(jù)《牛胚胎》（GB/T25881-2010）的形態(tài)學(xué)鑒定標(biāo)準(zhǔn)，A 級(jí)：胚胎形態(tài)完整、外形勻稱、卵裂球輪廓清晰、大小均勻、結(jié)構(gòu)緊湊、細(xì)胞密度大、色調(diào)和透明度適中、無(wú)附著的細(xì)胞和液泡；B 級(jí)：形態(tài)完整、輪廓清晰、細(xì)胞結(jié)合略顯松散、密度較大、可見(jiàn)到一些附著的細(xì)胞和液泡、變形細(xì)胞的比例為10%～20%；C 級(jí)：輪廓不清楚、卵裂球大小不均勻、色澤太明或太暗、細(xì)胞密度小、游離的細(xì)胞或液體較多、變性的細(xì)胞達(dá)30%～40%；D 級(jí)：未受精卵或發(fā)育延遲2 d 以上、細(xì)胞團(tuán)破碎、變性細(xì)胞的比例超過(guò)50%、死亡退化的胚胎。A、B、C 級(jí)胚胎為可用胚胎，其中A、B 級(jí)胚胎可用于鮮胚移植或冷凍保存，C 級(jí)胚胎只可用于鮮胚移植，D 級(jí)胚胎為不可用胚胎。

1.7 測(cè)定指標(biāo) 記錄實(shí)驗(yàn)中每頭利時(shí)蘭白花牛的直檢黃體數(shù)、A 級(jí)胚胎、B 級(jí)胚胎、C 級(jí)胚胎、D 級(jí)胚胎（不可用胚胎數(shù)）。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS17 軟件對(duì)不同同期發(fā)情處理方法、FSH 來(lái)源和沖胚方法各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以LSD 法進(jìn)行多重比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以<0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 比利時(shí)蘭牛超排結(jié)果分析 從表1 可以看出，實(shí)驗(yàn)共超排比利時(shí)蘭白花牛20 頭，超排有效率為90%，獲得胚胎總數(shù)為112 枚，可用胚胎（含A、B、C 三級(jí)胚胎）73 枚，可冷凍胚胎數(shù)（含A、B 二級(jí)胚胎）53 枚，不可用胚胎（D 級(jí)胚胎）39 枚。

表1 比利時(shí)蘭白花牛超排情況

2.2 超排前不同同期方法對(duì)比利時(shí)蘭白花牛超排效果的影響 從表2 結(jié)果顯示，埋植CIDR 和二次注射PG 同期發(fā)情超排有效率為90.00%，CIDR 組（8.44 個(gè)，7.11 枚，4.67 枚，3.22 枚）平均直檢黃體數(shù)、平均回收胚胎數(shù)平均可用胚胎數(shù)、以及平均可冷凍胚胎數(shù)均高于PG 組（7.22 個(gè)，5.33 枚，3.44 枚，2.67 枚），但均無(wú)顯著差異。

表2 超排前不同同期方法對(duì)比利時(shí)蘭白花牛超排效果的影響

2.3 不同來(lái)源FSH 對(duì)比利時(shí)蘭白花牛超排效果的影響表3 顯示，超排20 頭次比利時(shí)蘭白花牛，2 頭無(wú)超排反應(yīng)，其余牛的卵巢反應(yīng)明顯。使用進(jìn)口FSH 平均直檢黃體數(shù)、平均回收胚胎數(shù)、平均可用胚胎數(shù)和平均可冷凍胚胎數(shù)均高于國(guó)產(chǎn)FSH（<0.05）。

表3 不同來(lái)源FSH 對(duì)比利時(shí)蘭白花牛超排效果的影響

2.4 不同沖胚方法對(duì)比利時(shí)蘭白花牛超排效果的影響表4 顯示，注射法平均回收胚胎數(shù)和回收率均顯著高于灌注法。

表4 不同沖胚方法對(duì)比利時(shí)蘭白花牛超排效果的影響

3 討 論

3.1 超排前不同同期方法對(duì)比利時(shí)蘭白花牛超排效果的影響 超數(shù)排卵處理的供體牛所處發(fā)情周期階段會(huì)顯著影響超排效果。研究表明，使用促性腺激素超排供體牛，在黃體期中期開(kāi)始使用促性腺激素處理的超排效果顯著優(yōu)于卵泡期、黃體期早期或者黃體期后期超排處理的效果。超排獲得胚胎的數(shù)量和質(zhì)量會(huì)被超數(shù)排卵方案直接影響，目前報(bào)道關(guān)于超數(shù)排卵的方案已有很多，超排效果較好的主要有PG+FSH 和CIDR+FSH法。使用埋植CIDR 進(jìn)行同期發(fā)情，在不考慮母牛發(fā)情周期的情況下，通過(guò)注射外源性激素使超排開(kāi)始的時(shí)間正好處于新的卵泡波出現(xiàn)的時(shí)間，這時(shí)供體母牛卵巢上對(duì)外源促性腺激素敏感的中等大小卵泡數(shù)量最多，從而使更多的腔前卵泡發(fā)育成為有腔卵泡。本實(shí)驗(yàn)采用埋植CIDR 和二次注射PGF同期發(fā)情處理比利時(shí)蘭白花牛，并進(jìn)行超數(shù)排卵處理，結(jié)果表明CIDR 法和PG 法處理供體牛所得到的超排有效率相似，CIDR 法的平均回收胚胎數(shù)和平均可用胚胎數(shù)均高于PG 法，但差異均不顯著。這可能是二次注射PG 使比利時(shí)蘭白花牛剛好在發(fā)情周期的8～12 天，處于第2 個(gè)卵泡波，有較好的回收胚胎數(shù)和可用胚胎數(shù)。但是使用PG+FSH 法受到嚴(yán)格的時(shí)間限制，且CIDR+FSH 法超排效果較好，因此應(yīng)選擇埋植CIDR 作為比利時(shí)蘭白花牛超排前同期方法。

3.2 不同來(lái)源FSH 制劑對(duì)比利時(shí)蘭牛超數(shù)排卵的影響超排效果會(huì)直接影響供體牛回收可用胚胎的數(shù)量和質(zhì)量。激素是影響超排效果的一個(gè)關(guān)鍵因素，激素質(zhì)量的好壞直接影響黃體的數(shù)量和質(zhì)量、獲得可用胚胎的數(shù)量以及超排效果的穩(wěn)定性，因此超排效果與超排藥物的選擇有著直接關(guān)系。FSH 制劑是現(xiàn)階段同價(jià)位下最穩(wěn)定的超排藥物，其主要的作用是促進(jìn)卵巢上卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育以及排卵。不同國(guó)家廠家生產(chǎn)的FSH 與促黃體素（LH）的比例不相同，在生物活性方面也存在差異。目前所報(bào)道中的國(guó)產(chǎn)FSH 與進(jìn)口FSH 對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，結(jié)論各不相同。有學(xué)者認(rèn)為進(jìn)口FSH 比國(guó)產(chǎn)FSH 超排效果好，且具有較好的穩(wěn)定性；也有報(bào)道選用國(guó)產(chǎn)FSH 進(jìn)行超排處理后可用胚胎數(shù)與進(jìn)口FSH差異不顯著。本實(shí)驗(yàn)采用進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)的兩種FSH 進(jìn)行超排處理，結(jié)果表明使用進(jìn)口FSH 在平均直檢黃體數(shù)、平均回收胚胎數(shù)、平均可用胚胎數(shù)和平均可冷凍胚胎數(shù)均顯著高于國(guó)產(chǎn)FSH。這可能是FSH 中LH 含量不同造成的，進(jìn)口FSH 在提純過(guò)程中去除了80% 的LH，因此增加了胚胎數(shù)量；國(guó)產(chǎn)FSH 超排效果差的原因可能是FSH 濃度較低，含有較多的LH，且比利時(shí)蘭白花牛屬于大型肉牛品種，注射1 000 IU FSH 劑量不能充分刺激卵泡發(fā)育和卵巢排卵。Kanitze 等和Carvalho等使用重組牛FSH（高純度FSH）進(jìn)行超數(shù)排卵，結(jié)果表明能夠獲得類似的超數(shù)排卵效果，證明了內(nèi)源性LH 對(duì)卵泡生長(zhǎng)的最后階段是足夠的，不需要外源性LH。鑒于進(jìn)口FSH 的超排效果具有顯著優(yōu)勢(shì)且要迅速擴(kuò)大比利時(shí)蘭白花牛核心種群數(shù)量，因此現(xiàn)階段選用進(jìn)口FSH 作為超排激素。

3.3 不同沖胚方法對(duì)比利時(shí)蘭牛超排沖胚效果的影響本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在直檢黃體數(shù)相似的情況下使用注射式?jīng)_胚與傳統(tǒng)灌注式?jīng)_胚平均回收胚胎數(shù)（7.56 枚 VS 4.89 枚）和回收率（94.44% VS 63.77%）差異顯著。且注射式?jīng)_胚與傳統(tǒng)灌注式?jīng)_胚在沖胚液用量一致（1 000 mL/頭）的情況下，注射法沖胚時(shí)間短（沖1 頭牛需要15～25 min），而灌注法沖胚時(shí)間長(zhǎng)（沖1 頭牛需30～40 min）。注射式?jīng)_胚能夠做到?jīng)_胚液全進(jìn)全出，而灌注式?jīng)_胚會(huì)有較多的沖胚液殘留在子宮里，不利于子宮恢復(fù)，影響下次超排效果。綜上所述，采用注射法進(jìn)行沖胚時(shí)可以節(jié)約時(shí)間，回收率高，因此比利時(shí)蘭白花牛沖胚時(shí)選用注射式?jīng)_胚。

4 結(jié) 論

本研究表明，在南疆現(xiàn)有管理水平和生態(tài)環(huán)境下，選用進(jìn)口FSH 激素，超排方案采用CIDR+FSH+PG 方法，同時(shí)使用注射式?jīng)_胚，可生產(chǎn)最多的比利時(shí)蘭白花?？捎门咛ズ涂衫鋬雠咛ィ瑢?duì)比利時(shí)蘭白花牛體內(nèi)胚胎生產(chǎn)、核心種群建立以及在南疆推廣具有一定的參考價(jià)值。