干擾Cul5 對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的影響

曾雨晗，胡德寶，李新，張林林，丁向彬，郭宏，郭益文

（天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（MSC）是對骨骼肌起作用的細(xì)胞，也被稱為肌原干細(xì)胞，通常在骨骼肌發(fā)生損傷或產(chǎn)生疾病后被大量激活，從而維持著骨骼肌的穩(wěn)態(tài)。而MSC 的細(xì)胞周期離不開多種蛋白的參與。這些蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)水平很大程度取決于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解的調(diào)控作用。人體內(nèi)有兩大蛋白降解系統(tǒng)：溶酶體-自噬系統(tǒng)和UPS 系統(tǒng)，UPS系統(tǒng)負(fù)責(zé)體內(nèi)80%的蛋白降解。該系統(tǒng)由E1、E2、E3 3 種泛素酶及26 s 蛋白酶體組成。其中E3 泛素連接酶是將Ub 與底物蛋白連接并傳遞到26 s 蛋白酶體進(jìn)行識別的關(guān)鍵一步。在牛上泛素連接酶庫倫-5（Cullin5，Cul5）位于第15 號染色體，是庫倫家族的成員之一，由780 個氨基酸組成。作為E3 連接酶復(fù)合物的核心蛋白，Cul5 參與多種細(xì)胞活動，并發(fā)揮至關(guān)重要的骨架支撐作用。Cul5 分布在多種組織細(xì)胞內(nèi)，在心肌及骨骼肌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)。在細(xì)胞處于增殖期且活性增高時，Cul5 被認(rèn)為可發(fā)揮促進(jìn)增殖的作用，并在細(xì)胞周期、細(xì)胞的成肌分化、腫瘤的發(fā)生等多種疾病過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。在小鼠囊胚細(xì)胞中，敲除Cul5 致使胚胎細(xì)胞缺陷。體外表達(dá)磷酸化位點突變的Cul5 可促進(jìn)大鼠內(nèi)皮細(xì)胞增殖。在疾病的發(fā)生與進(jìn)程中，Cul5 的敲除或過表達(dá)，參與HIV、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤的調(diào)控過程。Cul5 對細(xì)胞的增殖分化有著重要的調(diào)控作用，但該基因?qū)趋兰〉恼{(diào)控作用尚不清楚，對牛骨骼肌細(xì)胞的影響研究更是少之又少。本研究采用牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外模型，模擬骨骼肌的增殖分化過程，通過敲低Cul5 的表達(dá)，探究Cul5 對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞來源 實驗室預(yù)先分離并凍存的初代牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。

1.1.2 主要試劑 高糖培養(yǎng)基；胎牛、馬血清；Lip 3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen）；蛋白質(zhì)快速裂解液、5×Tris電泳緩沖液、10×電轉(zhuǎn)緩沖液、紫外線超敏發(fā)光液A、B 液（索萊寶，北京）、20×TBS 緩沖液；Pax7 一抗（ProteinTech）；MyHC 一抗（DSHB）；Tubulin 一抗（DSHB）；Cul5 一抗（Santa Cruz Biotechnology）。

1.1.3 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱、熒光倒置顯微鏡（Leica）、實時熒光定量PCR 儀、凝膠電泳儀（Bio-Rad）、免疫印跡條帶曝光儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)參考天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室已建立的方法進(jìn)行，復(fù)蘇凍存的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，用添加1%鏈霉素的增殖培養(yǎng)基（1% 青霉素+20%FBS 胎牛血清+79% 高糖血清）培養(yǎng)細(xì)胞3～4 d，觀察細(xì)胞量占培養(yǎng)皿表面積60%～70%時進(jìn)行傳代實驗，將細(xì)胞傳入與實驗相對應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)板中，6 孔板用于蛋白提取，24 孔板用于RNA 提取，96 孔板用于EDU 實驗。用未含抗生素（20%FBS 胎牛血清+80% 高糖血清）的增殖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)孔板中的細(xì)胞量占培養(yǎng)皿表面積的60%～80%后，進(jìn)行脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染或更換為分化培養(yǎng)基（1%青霉素+2%HS 馬血清+79%DMEM）繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 查找Cul5 序列（來自NCBI 數(shù)據(jù)庫），設(shè)計并合成實驗組si-RNA 和對照組si-NC，待細(xì)胞量占培養(yǎng)皿表面積的70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔吸棄200 μL（6孔細(xì)胞培養(yǎng)板）、50 μL（24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板）、10 μL（96孔細(xì)胞培養(yǎng)板）培養(yǎng)基，將配置好的轉(zhuǎn)染液（依照Lip 3000 轉(zhuǎn)染說明書添加）加入細(xì)胞中6 h 后，更換含有抗生素的增殖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 RNA 的提取 用無酶的磷酸緩沖液清洗細(xì)胞2 次后，加入RNA 裂解液靜置5 min，后續(xù)參照RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 蛋白的提取 用普通的磷酸緩沖液清洗細(xì)胞2 次后，加入200～250 μL 含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液（稀釋比例為1:100），收集細(xì)胞后低溫離心10 min（12 000 r/min，4℃），吸取上清用作后續(xù)實驗或保存于-80℃冰箱。

1.2.5 EdU 細(xì)胞增殖實驗 將轉(zhuǎn)染后增殖24 h 的細(xì)胞，按EDU 試劑盒操作。在細(xì)胞水平上探尋Cul5 對MSC增殖的影響。

1.2.6 實時熒光定量PCR 檢測Cul5 的干擾效率及增殖、分化標(biāo)志因子的mRNA 表達(dá)量，引物信息Cul5 上游引物：GCAGAGTGCCAAGGCATGAT，下游引物：AGGCCCGCACTGATGATATG；Pax7 上游引物：AGC CAGAGTTTCAACGGGAG，下游引物：GTCGCCAAC AGACAACACAC；Ki-67 上游引物：GAGGTGGCTCA GGTTCGTC，下游引物：AAAGGGTTGGTGGTAAGT GGC；MyHC 上游引物：CTGGAATCCGGAGGCAGA A，下游引物：TTTTCGAAGGTAGGGAGCGG；MyOG上游引物：GGCTGACAAATGCCAGACTATCC，下游引 物：TGGTCCCTTGCTTTATCTCCCT；Tublin上游引物：CAACAGCACAGCCATCCAGGA，下游引物：TCTCAGCCTCGGTGAACTCCAT。

反應(yīng)試劑及體系為：cDNA 2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×All-in-One ? qPCR Mix 10 μL，RNase free water 7 μL。熒光定量PCR 程序：預(yù)變性：95 ℃，60 s；變性：95 ℃，10 s；退火：61 ℃，20 s；延伸：72℃，15 s；變性、退火、延伸共35 個循環(huán)；熔解曲線：95℃ 10 s；65℃，60 s；97℃，1 s；冷卻：37℃，30 s。

1.2.7 Western Blot 檢測增殖標(biāo)志因子、分化標(biāo)志因子的蛋白表達(dá)量。將增殖第1 天（24 h）和分化第1、2、3 天（24、48、72 h）的細(xì)胞用裂解液裂解并收集蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度，根據(jù)濃度按比例加入Buffer并100 ℃加熱10 min 使蛋白變性。通過Western Blot技術(shù)檢測增殖標(biāo)志因子Pax7 分化標(biāo)志因子MyHC 蛋白的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計分析 熒光定量PCR 和Western Blot 的結(jié)果用檢驗分析（SPASS 和Image Lab）；EdU 陽性細(xì)胞率卡方檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 檢測肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖及分化前后Cul5 的表達(dá)量提取牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖第1 天（24 h）及分化后3天（24、48、72 h）的RNA 和蛋白，結(jié)果可見，Cul5在mRNA 及蛋白水平上的表達(dá)量存在顯著差異（圖1），均為分化期顯著高于增殖期。

圖1 Western Blot 及qRT-PCR 檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖期(GM）及分化1、2、3 d（DM1、DM2、DM3）Cul5 蛋白及mRNA 表達(dá)水平

2.2 Cul5 si-RNA 干擾的篩選 在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上查找Cul5 序列，設(shè)計3 條si-RNA 將其命名為（si-Cul5-1、si-Cul5-2、si-Cul5-3），結(jié)果如圖2 所示?？梢?，在mRNA 水平上設(shè)計3 條si-RNA 與對照組相比均具有極顯著的干擾效果，其中si-Cul5-2的干擾效果最明顯。在蛋白水平上驗證si-Cul5-2 的干擾效果，結(jié)果也呈極顯著趨勢，所以將si-Cul5-2 用作后續(xù)實驗。

圖2 Western Blot 及qRT-PCR 檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Cul5-2 后Cul5 表達(dá)量

2.3 干擾Cul5 對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響 于96孔板中培養(yǎng)細(xì)胞并轉(zhuǎn)染Cul5 的小干擾RNA，結(jié)果如圖3 所示，干擾Cul5 后，細(xì)胞增殖EdU 陽性率與對照組相比極顯著上調(diào)。結(jié)果表明，敲低Cul5 對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖有作用。

圖3 EdU 檢測干擾Cul5 后牛骨骼衛(wèi)星細(xì)胞的增殖情況

在24 孔板中培養(yǎng)細(xì)胞并轉(zhuǎn)染Cul5 的小干擾RNA，提取細(xì)胞中的RNA。如圖4 所示，增殖標(biāo)志因子Ki-67、Pax7 均無顯著變化，提示干擾Cul5 在mRNA 水平上對細(xì)胞增殖無顯著影響。

圖4 qRT-PCR 檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Cul5-2后Pax7、Ki-67 表達(dá)量

在6 孔板中培養(yǎng)細(xì)胞并轉(zhuǎn)染Cul5 的小干擾RNA，提取細(xì)胞中的總蛋白。如圖5 所示，增殖標(biāo)志因子Pax7 顯著增高（<0.05），結(jié)果表明干擾Cul5 在蛋白水平上對細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。

圖5 qRT-PCR 檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Cul5-2 后Pax7、Ki-67 表達(dá)量

2.4 干擾Cul5 對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的影響 在24孔板中培養(yǎng)細(xì)胞并轉(zhuǎn)染Cul5 的小干擾RNA，更換分化培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞肌管的形成狀態(tài)。如圖6 所示，干擾Cul5 后骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的肌管數(shù)量明顯少于對照組。

圖6 干擾Cul5 后細(xì)胞在100 倍鏡下的光鏡圖

在24 孔板中培養(yǎng)細(xì)胞并轉(zhuǎn)染Cul5 的小干擾RNA，提取細(xì)胞中的RNA，如圖7 所示，可見分化標(biāo)志因子MyHC、MyOG 均無顯著變化，提示干擾Cul5在轉(zhuǎn)錄水平上對細(xì)胞分化無顯著影響。

圖7 qRT-PCR 檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Cul5-2 后MyHC、MyOG 表達(dá)量

在6 孔板中培養(yǎng)細(xì)胞并轉(zhuǎn)染Cul5 的小干擾RNA，提取細(xì)胞中的總蛋白，如圖8 所示，可見分化標(biāo)志因子MyHC 顯著降低，結(jié)果表明干擾Cul5 在蛋白水平上對細(xì)胞分化有抑制作用。

圖8 qRT-PCR 檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Cul5-2 后MyHC 蛋白表達(dá)量

3 討 論

MSC 位于肌纖維膜和細(xì)胞外基質(zhì)之間，當(dāng)其受到外界刺激被激活后，將啟動衛(wèi)星細(xì)胞的一系列反應(yīng)機(jī)制并成長為成熟肌纖維，在這個過程中MSC 起到修復(fù)細(xì)胞和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用。機(jī)體內(nèi)最主要降解蛋白質(zhì)的途徑是UPS 系統(tǒng)，其在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)平衡和維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面的重要性不言而喻。同時UPS 在DNA 損傷和修復(fù)、細(xì)胞增殖、分化等多種細(xì)胞調(diào)節(jié)方面也有著不可忽視的作用。UPS 是多步驟反應(yīng)過程，通過對泛素分子傳遞的連級反應(yīng)，對底物蛋白進(jìn)行泛素化標(biāo)記，使其被降解。E3 連接酶則起著傳遞泛素分子和連接底物蛋白的重要作用。Cul5 作為E3 泛素連接酶的核心骨架成分，在多種細(xì)胞中都表現(xiàn)出抑制增殖的效果。研究報道，降低Cul5 的表達(dá)對小鼠肺癌細(xì)胞的增殖有調(diào)控作用，并可抑制癌細(xì)胞的遷移。Cul5 也可通過調(diào)節(jié)線粒體活性蛋白激酶（AMPK）的磷酸化，影響細(xì)胞因子的mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和DNA 修復(fù)等生物過程。目前，前人對Cul5 的研究側(cè)重于其在癌細(xì)胞中的表達(dá)和癌癥發(fā)展，對肌肉的調(diào)控以及在牛上的實驗很少。所以本實驗以Cul5 為實驗?zāi)繕?biāo)，以牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞為基礎(chǔ)展開實驗。結(jié)果顯示，分化前后mRNA 和蛋白水平上Cul5 表達(dá)量均有顯著變化，均在分化期表達(dá)量較高，提示Cul5 可能對細(xì)胞分化有調(diào)控作用。然而，敲低Cul5 后，在mRNA 水平上，該基因?qū)υ鲋臣胺只瘶?biāo)志因子均無顯著影響，但在蛋白水平上卻影響顯著，即Pax7 顯著增高，MyHC 顯著下降。造成這一現(xiàn)象的原因可能在于Cul5 是通過其翻譯后修飾進(jìn)而表達(dá)蛋白，發(fā)揮影響細(xì)胞進(jìn)程的作用。也有相關(guān)文獻(xiàn)說明這一觀點。在大鼠腎上腺髓內(nèi)皮細(xì)胞中VACM-1/Cul5 的抗增殖效果取決于其后翻譯修飾。本研究表明Cul5 對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化有重要的調(diào)控作用。Cul5 的功能具有組織特異性，在不同組織中發(fā)揮著不同作用。研究發(fā)現(xiàn)，Cul5 在大鼠內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)其增殖，但在小鼠腎小球足細(xì)胞抑制其增殖?；蚬δ艿亩嘧冃允共煌?xì)胞發(fā)揮的調(diào)控作用不同，具體機(jī)制還待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究以牛肌衛(wèi)星體外成肌誘導(dǎo)分化模型為基礎(chǔ)，探尋Cul5 對MSC 的調(diào)控作用，通過研究結(jié)果可以得出：干擾Cul5 能夠促進(jìn)MSC 的增殖，并抑制其分化過程，可為進(jìn)一步研究Cul5 在牛肌肉發(fā)育分化中的調(diào)控機(jī)制提供一定參考。