基于RNA-seq篩選影響豬肉品質(zhì)的關(guān)鍵候選基因

肖明飛，申露露，何逸懿，易宏波，唐青松，李莉，洪興，李大江，徐娥*

（1.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所，廣東廣州 510640；3.成都通威三新藥業(yè)有限公司，四川成都 611500）

豬肉品質(zhì)是養(yǎng)豬生產(chǎn)中最重要的目標性狀之一。近年來，畜牧行業(yè)片面追求豬的生產(chǎn)性能，導致肉的風味變差，肉品質(zhì)下降。從江香豬是貴州省著名地方小型豬種，屬于國家二級保護畜種。從江香豬具有很強的環(huán)境適應性和抗病能力，具有高度純合的基因水平，因肉質(zhì)細嫩和味道鮮美而聞名。研究表明，從江香豬豬肉屬于高蛋白和低熱能的健康肉類，富含多種人體所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。近年來，轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)在畜牧行業(yè)得到廣泛應用。張福平等通過RNAseq 發(fā)現(xiàn)了與從江香豬發(fā)情排卵密切相關(guān)的7 個候選基因（和）。María 等基于RNA-seq 研究表明，在純種伊比利亞豬肌內(nèi)脂肪中301 個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與表達差異，其中和參與脂肪生成，和參與骨骼肌的發(fā)育。此外，也有學者通過RNA-seq 技術(shù)初步證實了miRNA-499 和miRNA-22 是影響豬肉滴水損失性狀的潛在調(diào)節(jié)因素。然而，目前關(guān)于從江香豬背最長肌的基因組學研究較少，從江香豬肉質(zhì)與大白豬的關(guān)鍵功能基因鮮有報道。本研究基于RNA-seq 技術(shù)對香豬和大白豬背最長肌的表達譜差異進行分析，通過GO 和KEGG 篩選與豬肉品質(zhì)相關(guān)的信號通路，挖掘影響豬肉品質(zhì)形成的關(guān)鍵功能基因，以期為豬肉品質(zhì)的改善提供相應的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品采集 實驗在貴州大學種豬場進行，從江香豬與大白豬屠宰前的飼養(yǎng)管理均一致。選取90 日齡和胎次相同的健康雄性去勢純種從江香豬和大白豬各3 頭，屠宰后采集背最長肌，液氮速凍轉(zhuǎn)移保存在-80℃冰箱待測。

1.2 RNA-seq 測序和生物信息學分析 使用Trizol 試劑盒（Invitrogen，美國）提取上述采集的從江香豬和大白豬背最長肌總RNA，所得總RNA 濃度和純度 經(jīng)NanoDrop 2000（IMPLEN，美國）和Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，美國）檢測，建立cDNA 文庫和庫檢后，上機進行Illumina HiSeq測序，得到原始序列（Raw Reads），同時去除低質(zhì)量和含雜質(zhì)的序列得到有效序列（Clean Reads）。將從江香豬和大白豬背最長肌的測序結(jié)果進行轉(zhuǎn)錄注釋并計算表達水平，以FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）作為基因表達水平估算指標（FPKM>1 作為判斷基因表達的標準），同時將|log（Fold Change，F(xiàn)C）| ≥1 &<0.05為差異表達基因（DEGs）篩選條件，利用GOseq R 軟件包對DEGs 進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析，確定DEGs 行使的主要生物學功能；利用KOBAS（2.0）軟件進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Gens and Genomes，KEGG）Pathway 富集分析，確定2 個豬種差異表達基因參與的主要代謝途徑和信號通路。Edge R 軟件繪制差異表達基因的散點圖和火山圖。

1.3 實時熒光定量（qRT-PCR）驗證 為進一步驗證RNA-seq 結(jié)果的準確性，以2 μg 的總RNA 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本）逆轉(zhuǎn)錄得到20 μL 的第1 鏈cDNA，加入180 μL 焦碳酸二乙酯（DEPC）水10 倍稀釋用于實時熒光定量。每個樣本獨立重復3 次實驗。目的基因和管家基因（GAPDH）的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。基因的相對表達量均采用2法計算。PCR 反應體系：94℃預變性30 s，94℃變性5 s，60℃退火和延伸30 s，40 個循環(huán)。

表1 實時熒光引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 結(jié)果使用Excel 2019 初步整理后，SPSS 18.0 軟件進行單因素方差分析。利用GraphPad Prism 8.0 軟件作圖。結(jié)果以平均值和標準誤表示，<0.05 為差異顯著，<0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 RNA-seq 測序質(zhì)量評估和參考序列比對 通過對從江香豬和大白豬的背最長肌進行高通量測序，從江香豬和大白豬分別獲得45 568 778 條和47 475 542 條Raw reads，經(jīng)過濾后，得到有效序列（Clean Reads）分別為42 41 202 134 條（從江香豬）和834 534 條（大白豬），結(jié)果如表2 所示。從江香豬和大白豬Clean Reads 均高于90%，錯誤的Reads 為0.02%；且從江香豬和大白豬的有效堿基數(shù)（Clean Bases）分別為6.43G 和6.18G，堿基質(zhì)量大于20（Q20）占96% 以上，堿基質(zhì)量大于30（Q30）占91% 以上，堿基G 和C 的數(shù)量占總堿基的54% 以上，說明獲得的堿基質(zhì)量較高。因此，測序結(jié)果可靠的可進行生物信息學分析。

表2 數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量情況

2.2 差異表達基因篩選 皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearson's Correlation Coefficient）R 是生物學重復相關(guān)性的重要評估指標之一，越接近1，則樣品的相似度越高，相關(guān)性越好。在本實驗中（圖1），從江香豬和大白豬的為0.95，說明實驗可靠，2 個豬種表達模式相似度高。

圖1 從江香豬和大白豬背最長肌組織樣品的皮爾遜相關(guān)分析

由圖2 可知，通過篩選，從江香豬對比大白豬背最長肌共得到318 個DEGs，其中相對表達量顯著上調(diào)的基因有184 個，顯著下調(diào)的基因有134 個。

圖2 差異表達基因火山圖

表3 和表4 列舉出了從江香豬與大白豬部分上調(diào)基因和下調(diào)基因，由于表中| log（FC）| ≥1，說明香豬與大白豬基因的相對表達量差異較大，均在2 倍以上。

表3 從江香豬中上調(diào)的DEGs（部分）

表4 從江香豬中下調(diào)的DEGs（部分）

2.3 差異基因GO 富集分析 將從江香豬和大白豬背最長肌中篩選的318 個DEGs 匹配到GO 功能注釋數(shù)據(jù)庫中，得到富集最顯著（<0.05）的前30 個GO 條目（表5），其中生物過程（Biological Proceess）富集了27 個條目，細胞組分（Cellular Component）富集了3 個條目。推測大部分DEGs 在生物學過程有著重要的意義。在生物學過程中，從江香豬與大白豬的DEGs 主要富集在單個有機體代謝過程、丙酮酸代謝過程、羧酸代謝過程、脂肪酸代謝過程、肌肉系統(tǒng)過程、組織發(fā)育過程等；細胞組分主要包括細胞外空間、肌原纖維、細胞外基質(zhì)等。

表5 從江香豬和大白豬差異表達基因GO 分析

2.4 差異基因KEGG 富集分析 如表6 所示，對從江香豬與大白豬318 個DEGs 進行KEGG 信號通路富集分析，共得到富集最顯著的10 條通路（<0.05），包括與肉質(zhì)相關(guān)的通路，分別是一磷酸腺苷活化蛋白激酶信號通路、轉(zhuǎn)錄因子信號通路、丙酮酸代謝途徑、脂肪酸代謝途徑等。

表6 從江香豬和大白豬差異表達基因KEGG 分析

2.5 qRT-PCR 驗證DEGs 為驗證從江香豬和大白豬測序結(jié)果，分別選擇從江香豬差異高表達基因：干擾素誘導的跨膜蛋白1（）、神經(jīng)絲中鏈（）、輔酶Q10A（）、丙酮酸脫氫酶激酶4（）、硫胺焦磷酸激酶1（）、動力蛋白輕鏈LC8-type1（）、硒結(jié)合蛋白1（），以及大白豬差異顯著高表達基因：2'-5'-寡聚腺苷酸合成酶1（）、分泌型磷蛋白1（）、具有序列相似性的家族134 成員B（）、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5（）、肌球蛋白重鏈7（）、乙醇脫氫酶（）、硒蛋白W（）進行qRTPCR 驗證。結(jié)果顯示，從江香豬和大白豬差異高表達基因熒光定量的結(jié)果與RNA-seq 結(jié)果相似（圖3、圖4），表明轉(zhuǎn)錄組結(jié)果可靠性高。其中，在DEGs 比較研究中發(fā)現(xiàn)，同屬硒蛋白家族的和基因在2 個豬種中具有不同的表達模式，在大白豬中高表達，而在從江香豬中高表達。

圖3 從江香豬高表達基因

圖4 大白豬高表達基因

3 討 論

當前，轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對豬肉品質(zhì)的研究已獲得很大的進展。成志敏等運用RNA-seq 技術(shù)研究大白豬和馬身豬肌肉肉質(zhì)性狀相關(guān)候選基因時發(fā)現(xiàn)，肌球蛋白輕鏈3（）、肌球蛋白重鏈3（）、肌球蛋白重鏈6（）等基因均與肌纖維有關(guān)；李再磊等也基于轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)掘和鑒定出了火毛撒壩豬和杜洛克豬背最長肌差異基因及相關(guān)信號通路。從江香豬是小型的地方豬種，由于貴州獨特的喀斯特環(huán)境與氣候，使從江香豬具有風味獨特、肉質(zhì)細嫩、營養(yǎng)豐富等優(yōu)良特性。本研究基于成熟的RNA-seq 技術(shù)研究從江香豬和大白豬肉質(zhì)差異基因，GO 分析的結(jié)果顯示，從江香豬對比大白豬差異表達基因主要富集在生物過程和細胞組分，包括一元羧酸代謝過程、肌肉系統(tǒng)過程、組織發(fā)育過程、細胞外空間、肌原纖維、細胞外基質(zhì)等。相關(guān)研究表明，肌肉系統(tǒng)過程、組織發(fā)育過程、應對脂質(zhì)過程、肌原纖維和細胞外基質(zhì)均與肌肉形成相關(guān)。此外，在KEGG 信號通路分析中，富集最顯著的4 條信號通路（一磷酸腺苷活化蛋白激酶信號通路、轉(zhuǎn)錄因子信號通路、丙酮酸代謝途徑以及脂肪酸代謝途徑）均與肉質(zhì)形成有關(guān)，這與前人研究一致。研究表明，AMPK信號通路是山東黑牛脂質(zhì)代謝的主要代表通路。胰島素和FoxO 信號通路在大白豬肉質(zhì)性狀中主要與葡萄糖代謝（葡萄糖轉(zhuǎn)化為三磷酸腺苷（ATP）相關(guān)。進一步篩選差異高表達基因進行驗證，發(fā)現(xiàn)基因在從江香豬背最長肌中高表達；基因在大白豬背最長肌中高達。

在從江香豬高表達基因中，與豬肌內(nèi)脂肪、肌肉含水量顯著相關(guān)，已被證實是從江香豬肌內(nèi)前體脂肪細胞代謝的關(guān)鍵基因，在從江香豬背最長肌中表達量較高。和均是與疾病相關(guān)的基因。屬于硒蛋白家族的一員，目前大量學者認為是體內(nèi)的抑癌基因，其生理功能可能包括蛋白質(zhì)降解、高爾基體內(nèi)轉(zhuǎn)運、細胞運動、細胞分化和氧化還原調(diào)節(jié)等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，與脂肪細胞成熟分化有關(guān)，在脂肪細胞中作為細胞分化的內(nèi)源性刺激物，且有助于硫化氫（HS）生物合成，是脂肪細胞分化和成熟的標志物。還有學者發(fā)現(xiàn)SBP1 是去泛素化酶1 的底物，在調(diào)節(jié)泛素化通路（泛素化通路與細胞的蛋白代謝緊密相連）中發(fā)揮一定作用。在大白豬差異高表達的基因中，參與早期肌肉細胞的增殖和分化，與豬肉品質(zhì)的各個方面有關(guān)，尤其是pH 值。則被證實與牛背最長肌的肌內(nèi)脂肪有關(guān)，與維生素A 的交互作用對牛肉大理石紋起著重要的影響。作為金華豬獨特的甲基化基因，被驗證在金華豬前脂肪細胞的整個成脂分化期發(fā)揮作用。是一種在補充硒的動物的肌肉中含量很高的蛋白質(zhì)，但在缺硒或發(fā)生白肌病（White Muscle Disease，WMD）的動物中幾乎檢測不到。Li 等研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加酵母硒提高了豬只背最長肌中（即）基因的表達，其表達量與豬肉質(zhì)的滴水損失呈負相關(guān)。以上研究結(jié)果提示，從江香豬肉質(zhì)鮮嫩的原因多與肌內(nèi)脂肪、脂肪細胞的代謝等因素有關(guān)。其中同屬硒蛋白家族的和基因在肉質(zhì)形成過程發(fā)揮重要生物學功能和肉質(zhì)調(diào)控作用。

4 結(jié) 論

本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序篩選從江香豬和大白豬背最長肌318 個DEGs，通過GO 和KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，從江香豬和大白豬DEGs 主要集中在一磷酸腺苷活化蛋白激酶信號通路、轉(zhuǎn)錄因子信號通路、丙酮酸代謝途徑以及脂肪酸代謝途徑4 條與肉質(zhì)相關(guān)的通路。進一步篩選得到影響2 個豬種肉質(zhì)差異的關(guān)鍵候選基因：從江香豬高表達基因（）和大白豬中高表達基因（），其中同屬硒蛋白家族的和基因在2 個豬種中具有重要生物學功能和肉質(zhì)調(diào)控作用，可作為關(guān)注熱點。本研究結(jié)果為豬肉品質(zhì)的分子調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。